1) Herstellung von Drosophila melanogaster neuronalen muskulös Kreuzung (NMJ) <ol><li> Bereiten Standard Drosophila Kochsalzlösung (130 mM NaCl, 36 mM Saccharose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7.3 4. </li><li> Präparieren Sie die Vorbereitung in Kochsalzlösung (1,1). Die Drosophila-Larven ist dorsal-up in einem Sylgard Gericht verzehrte, die Dorsalseite ist im Schnitt längs, und die inneren Organe entfernt werden. Das Präparat wird dann gestreckt und schmachtete. Mehrere ventralen Muskeln können dann verwendet werden. </li></ol> 2) Stimulation und FM-Färbung <ol><li> Es ist ratsam, alle folgenden Schritte bei schlechten Lichtverhältnissen zu tun, um FM Farbstoffe vor dem Ausbleichen zu schützen. </li><li> Für die chemische Stimulation der Nerven ist eine hohe Kalium-Puffer verwendet. Bereiten Drosophila Kochsalzlösung (siehe 1.1) mit 90 mM KCl und 10 uM FM1-43-Farbstoff. Halten Sie die Lösung vor Licht geschützt. </li><li> Bath die Zubereitung mit der zuvor hergestellten Puffer für 1 Minute bei Raumtemperatur. </li><li> Wash mit Standard Drosophila Kochsalzlösung (1,1) an extrazelluläre FM1-43 Farbstoff zu entfernen. Gehen Sie schnell zu einer Fixierung. </li></ol> 3) Befestigung <ol><li> Bath die Zubereitung mit 2,5% Glutaraldehyd in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Für eine gute Erhaltung der morphologischen Merkmale, ist Glutaraldehyd zu Paraformaldehyd bevorzugt. </li><li> Wash einmal mit PBS und verlassen dann die Vorbereitung für 15 Minuten in 100 mM NH 4 Cl untergetaucht. Dieser Schritt ist getan, um den freien Aldehydgruppen der verbleibenden Glutaraldehyd Fixierlösung zu stillen. </li><li> Waschen Sie die NH 4 Cl-Lösung mit normalen PBS. </li></ol> 4) Photokonversion <ol><li> Inkubieren Sie die NMJ Vorbereitung für 30 Minuten bei 4 ° C in PBS mit 1,5 mg ml-1 von Diaminobenzidin (DAB). </li><li> Position der Probe unter dem Fluoreszenzmikroskop. Suchen und konzentrieren das Fluoreszenzsignal mit einer relativ niedrigen Vergrößerung Wasserimmersionsobjektiv (20x 0,5 nA). </li><li> Illuminate der Probe mit der maximalen Intensität, bis die Lampe FM Farbstoff ist völlig gebleicht (Abbildung 1C). Um zu steuern, wenn Photokonversion aufgetreten ist, ist es ratsam, bei der Probe unter Sendelicht überprüfen vor und nach dem FM Farbstoff-Bleiche. Wenn Photokonversion stattfindet, ist ein dunkelbrauner Niederschlag zu erwarten (Abbildung 1C). Die Belichtungszeit ist variabel, abhängig von der Beleuchtungsstärke und auch von der DAB Eindringen in die Vorbereitung. Für die meisten Vorbereitungen haben wir festgestellt, Belichtungszeiten von ca. 30-45 Minuten als optimal bei Verwendung eines 20x-Objektiv. Kürzere Zeiträume Beleuchtung sind für höhere Vergrößerung Ziele (60x) verwendet. </li><li> Für die Beleuchtung bevorzugen wir eine Quecksilberlampe verwendet, mit einem Lampengehäuse mit einem Rückspiegel, die rückgestreuten Lichtstrahlen sammelt, und erhöht damit die gesamte Intensität. </li></ol> 5) Die Verarbeitung der Probe für die EM <ol><li> Osmication <ol class="lalpha"><li> Bereiten Sie eine Lösung mit einem Volumen von Osmiumtetroxid in Baum Mengen an Wasser (ca. 300 ul pro Probe). Die Arbeit mit Osmiumtetroxid muss unter der Haube getan werden, mit Handschuhen und aye Schutzausrüstung. </li><li> Inkubieren Sie die Vorbereitung in der Osmiumtetroxid-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur (unter der Haube). </li><li> Wash ausgiebig mit PBS (4-5 mal 5 Minuten) und übertragen jeweils Proben zu einer sauberen Glaskolben. </li></ol></li><li> Austrocknung <ol class="lalpha"><li> Separate Lösungen mit 30, 50, 70 90, 95 und 100% Ethanol. </li><li> 1 ml 30% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten. </li><li> 1 ml 50% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten. </li><li> 1 ml 70% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten. </li><li> 1 ml 90% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten. </li><li> 1 ml 95% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten (Wiederholung 3x). </li><li> 1 ml 100% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten (Wiederholung 3x). </li></ol></li><li> Embedding und Weiterverarbeitung <ol class="lalpha"><li> 1 Volumenteil Epon-Harz mit einem Volumen von Ethanol. Fügen Sie es um die Vorbereitung unter ständiger Rotation (2-4 Stunden). </li><li> Legen Sie die Vorbereitung in 100% Epon in offenen Flaschen, damit das restliche Ethanol verdampfen (4-6 Stunden). </li><li> Legen Sie die Vorbereitung in Formen bei 60 ° C für 36 Stunden. </li><li> Elektronenmikroskopie Verarbeitung. Prozess der Vorbereitung in 50-80 nm dünne Schnitte, mit Standard-Ultramikrotomie Verfahren. </li></ol></li><li> Elektronenmikroskopie Bildgebung <ol class="lalpha"><li> Die Zubereitung ist abgebildet mit herkömmlichen Verfahren EM. </li></ol></li></ol> 6) repräsentative Ergebnisse Die erwarteten Ergebnisse sind in den Abbildungen 1C und 2 dargestellt. Die Beleuchtung Verfahren führt zur Bildung von brown DAB Niederschlag, der sichtbar sein in beiden Fluoreszenz und Transmission Bildgebung. Das erste Auftreten bei der Beleuchtung ist das Verschwinden der Fluoreszenz mit der FM Farbstoff Färbung verbunden. Die Hintergrund-Fluoreszenz durch die Aldehyd-Fixativ induzierte dagegen sichtbar sein wird während des gesamten Experiments. Die Bleiche erfolgt in der Regel in ~ 10-20 Minuten nach dem Start der Beleuchtung. In der Regel keine Photokonversion Produkt kann zu diesem Zeitpunkt beobachtet werden. Die Beleuchtung sollte fortgesetzt werden und nach ca. 10 Minuten die Vorbereitungen zu einer braunen Farbton durch DAB Akkumulation (Abb. 1C iv) wiederum Unklar ist, warum DAB Niederschlags-und FM Farbbleichung nicht gleichzeitig erfolgen, es ist möglich, dass eine relativ große Menge an oxidiertem DAB muss vor Aggregation und Präzipitation ansammeln, und dass daher diese Reaktion ist langsamer als die Bleiche. In diesem Stadium ist jedoch die Vorbereitung nicht bereit für die Elektronenmikroskopie Verarbeitung, wie die DAB Niederschläge wahrscheinlich unvollständig. Wir bevorzugen es, 5-10 Minuten länger warten, während der die Vorbereitung (präsynaptischen Nervenendigung) eine dunkelbraune (oder schwarze) Farbe, was auf eine vollständige Umsetzung übernimmt. Eine leichte Umwandlung der allgemeinen Oberfläche des Präparates (z. B. der Muskelfasern in einer neuromuskulären Synapse) kann in diesem Stadium beobachtet werden. Es ist sehr wahrscheinlich zu einem Umsatz von DAB induziert durch Autofluoreszenz (und / oder Fixiermittel Fluoreszenz) verwandt, und es ist nicht schädlich für das Verfahren. Das Präparat wird dann für die Elektronenmikroskopie aufbereitet und sollten auf das Vorhandensein von dunkler (beschriftet) Vesikeln überprüft werden. Wie wir bereits 5,6 gezeigt haben, sind auch diese Vesikel viel dichter als nicht-markierten diejenigen, und sind daher leicht zu unterscheiden (Abbildung 2B). Um die Wahrscheinlichkeit zu unterscheiden und die unterschiedlichen Arten von Vesikeln zu erhöhen, sollten keine kontrastverstärkenden post Färbung der Schnitte durchgeführt (keine Uranylacetat oder Bleicitrat-Färbung) werden, die Osmium-Färbung ist ausreichend für die meisten zellulären Elemente zu beobachten, und ist nicht als dunkel wie DAB Niederschlag. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: FM Farbstoffe und es zu benutzen für Photokonversion. (A) stellen die Stufen einer klassischen Experiment zum Be-und distaining Vesikel mit FM Farbstoff unter Stimulation. (I) Inkubieren der Probe in FM Farbstoff enthaltenden Puffer. (Ii) Förderung (elektrisch oder chemisch) an Vesikelfusion in Anwesenheit von FM Farbstoff zu induzieren. (Iii) Die Teilfolge Endozytose nach Stimulation wird einige Vesikel mit FM Farbstoff noch in der extrazellulären Puffer zu laden. (Iv) Ersetzen Sie die extrazelluläre FM Farbstoff durch Waschen mit Puffer. (V) Ein neuer Stimulation induziert beladenen Vesikel, ihre FM Farbstoff auf Exozytose freizugeben. (B) Schematische Darstellung der Kopf-, Brücken-und Schwanz des FM1-43-Farbstoff. (C) Beispiel für eine Photokonversion Experiment in Drosophila NMJ. (I) Nach dem Laden der NMJ mit FM1-43-, Wasch-externen Farbstoffmoleküle und Fixieren, kann die Fluoreszenz einer Nervenendigung mit einem konventionellen Epifluoreszenzmikroskop (63x) beobachtet werden. (Ii-iii) Unter kontinuierlicher Beleuchtung der Farbstoff vollständig gebleicht. (Iv) Wenn die Beleuchtung setzt, erscheint eine schwarze Farbe durch Diaminobenzidin Niederschlag. Scale-Balken repräsentiert 10 pm. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: EM Beispiele photokonvertiertem Proben (A) Das Bild zeigt eine Nervenendigung mit synaptischen Vesikeln, aber nicht von ihnen sind photokonvertiertem; dies könnte durch nicht genügend Beleuchtung oder arme Diaminobenzidin Eindringen in das Gewebe verursacht werden.. (B) Synaptic bouton mit mehreren dunklen (gefüllt) Bläschen, die durch FM Photokonversion ging. (C) Excess der Beleuchtung ergibt sich insgesamt eine dunkle Terminal, wo keine Bläschen oder Organellen sind unterscheidbar. Scale-Balken 200 nm.

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

Ein paar kritische Schritte sollten berücksichtigt werden: <ul><li> Die DAB Inkubation sollten nur nach gründlichem Waschen und Abschrecken der Vorbereitungen durchgeführt werden. Andernfalls wird der nicht umgesetzte Glutaraldehyd wird mit DAB zu interagieren und zu seinen Niederschlag (in der Regel in Form von flachen Kristallen, die nicht Elektron dichten). Die Vorbereitungen, wo dieser Niederschlag findet reichlich sind selten brauchbar für die Elektronenmikroskopie. </li><li> Illumination Zeiten sollten opt...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

Die Fusion von synaptischen Vesikeln mit der Plasmamembran (Exozytose) ist ein erforderlicher Schritt in die Freisetzung von Neurotransmittern und die neuronale Kommunikation. Die Vesikel werden dann von der Plasmamembran (Endozytose) abgerufen und zusammen mit dem allgemeinen Pool von Vesikeln innerhalb der Nervenendigung gruppiert, bis sie eine neue Exo-und Endozytose-Zyklus (Vesikel Recycling) zu unterziehen. Diese Prozesse wurden untersucht mit einer Vielzahl von Techniken wie der Elektronenmikroskopie, Elektrophysiologie Aufnahmen, Amperometrie und Kapazitätsmessungen. Wichtig ist, dass in den letzten zwei Jahrzehnten eine Reihe von fluoreszenzmarkierten Marker entwickelt, so dass optische Techniken, um Vesikel in deren Recycling Dynamik zu verfolgen. Einer der am häufigsten verwendeten Marker ist der Styryl-oder FM-Farbstoff 1, strukturell, enthalten alle FM Farbstoffe einem hydrophilen Kopf und einen lipophilen Schwanz durch einen aromatischen Ring und einen oder mehrere Doppelbindungen (Abb. 1B) verbunden. Ein klassischer FM Farbstoff experimentieren, um einen Pool von Vesikeln Etikett besteht in Baden die Vorbereitung (Abb. 1Ai) mit dem Farbstoff während der Stimulation des Nervs (elektrisch oder mit hoher K +). Dies induziert Vesikel-Recycling und die anschließende Beladung des Farbstoffs in jüngster Zeit durch Endozytose Vesikel (Abb. 1A i-iii). Nach dem Laden der Vesikel mit Farbstoff, eine zweite Runde der Stimulation in einem Farbstoff-freie Bad löst die FM durch Exozytose (Abb. 1A iv-v), Prozess, der durch die Überwachung der Fluoreszenz-Intensität zu verringern (Entfärbung) verfolgt werden kann. Obwohl FM Farbstoffe stark auf den Bereich der Vesikel-Recycling beigetragen haben, ist es nicht möglich, die genaue Lokalisation und Morphologie der einzelnen Vesikel mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie bestimmen. Aus diesem Grund erklären wir hier, wie FM-Farbstoffe können auch als endocytischen Marker mit Hilfe der Elektronenmikroskopie verwendet werden, durch Photokonversion. Die Photokonversion Technik nutzt die Eigenschaft von Fluoreszenzfarbstoffen an reaktiven Sauerstoffspezies unter intensiver Beleuchtung erzeugen. Fluoreszenzmarkierten Präparate werden in einer Lösung mit Diaminobenzidin (DAB) getaucht und beleuchtet. Reaktive Spezies durch die Farbstoffmoleküle generiert oxidieren die DAB, die eine stabile, unlösliche Niederschlag, ein dunkles Aussehen hat und kann problemlos in der Elektronenmikroskopie 2,3 unterschieden werden Formen. Da DAB ist nur in der unmittelbaren Nähe von fluoreszierenden Molekülen (wie die reaktive Sauerstoff-Spezies kurzlebig sind) oxidiert, sorgt für die Technik, die nur fluoreszenzmarkierten Strukturen werden den Elektronen-dichten Niederschlag enthalten. Die Technik ermöglicht so die Studie über die genaue Lage und Morphologie der aktiv Recycling Organellen.

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

FM Farbstoffe haben eine unschätzbare Hilfe für das Verständnis der synaptischen Dynamik worden. FMs sind in der Regel unter dem Fluoreszenzmikroskop bei unterschiedlichen Bedingungen Stimulation gefolgt. Allerdings ermöglicht Photokonversion FM Farbstoffe mit Elektronenmikroskopie kombiniert die Visualisierung verschiedener synaptischer Vesikel-Pools, unter anderem Ultrastruktur Komponenten in synaptischen boutons.

Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

studying-synaptic-vesicle-pools-using-photoconversion-of-styryl-dyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Aufrufe.  European Neuroscience Institute Göttingen. FM Farbstoffe haben eine unschätzbare Hilfe für das Verständnis der synaptischen Dynamik worden. FMs sind in der Regel unter dem Fluoreszenzmikroskop bei unterschiedlichen Bedingungen Stimulation gefolgt. Allerdings ermöglicht Photokonversion FM Farbstoffe mit Elektronenmikroskopie kombiniert die Visualisierung verschiedener synaptischer Vesikel-Pools, unter anderem Ultrastruktur Komponenten in synaptischen boutons.

Serie: Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Forschung

Neurowissenschaften

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Pentylenetetrazole-induzierten anzünden-Maus-Modell

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...