Name: an optical assay for synaptic vesicle recycling in cultured neurons overexpressing presynaptic proteins
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
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Wir danken Irmgard Weiss für kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der DFG über des Exzellenzclusters für Mikroskopie im Nanometerbereich und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB, B1-7, T.D) unterstützt.

Keine Studien mit lebenden Tieren wurden durchgeführt. Experimente mit euthanasierten Tiere, um die Zelle zu erhalten, die Kulturen von den lokalen Tierschutz Behörden (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) unter der Zustimmung genehmigt wurden Nummer T10/30. Die Experimente wurden mit der genehmigten Protokolle geführt.
1. primäre Hippocampal Zellkultur
<ol><li>Bereiten Sie die dissoziierten Zellkultur der Ratte Hippocampus am embryonalen Tag 1916,17. Die Zellen auf 12 mm Deckgläsern beschichtet mit Polyethyleneimine (PEI) in 24 Wohlen Teller bei einer Dichte von 50.000-60.000 Zellen/Well-Platte. Überprüfen Sie die Dichte mit einer Zelle zählen Industrie- und Phase Kontrast-Optik.</li>
	<li>Kultur der Neuronen für 3 Tage (Tag in Vitro (DIV) 3) in einer 24-Well-Platte im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Bewerten Sie die Deckgläsern für Indikatoren für die Zellgesundheit mit übertragenen Lichtmikroskopie (z. B. Phase Kontrast-Optik bei einer Vergrößerung von 10-20 X). Überprüfen Sie, ob die folgenden Indikatoren für eine gute Gesundheit: eine klare Phase Kontrast Halo, Neuriten ohne Perlen Strukturen und keine Soma clustering oder Neuriten zu bündeln.</li>
</ol>(2) transfection
Hinweis: Das folgende Protokoll bezieht sich auf eine Doppel-Transfektion für 3 Brunnen. Allerdings funktioniert das Protokoll am besten Beträge für 4 Brunnen ausreichend vorbereitet sind.
<ol><li>In einen Erlenmeyerkolben 500 mL Transfektion Puffer (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, 15 mM Glukose, 42 mM HEPES) vorzubereiten.<ol>
<li>8,0 g NaCl, 0,37 g KCl 0,095 g Na2HPO4, 1,35 g Glukose und 5,0 g HEPES in 400 mL destilliertem Wasser in einen Erlenmeyerkolben auflösen.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 6,95 mit 1 M NaOH mit dem pH-Meter.</li>
		<li>Stellen Sie die Lautstärke mit destilliertem Wasser auf 500 mL, und überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Meter.</li>
		<li>Machen Sie 20-30 mL-aliquoten Transfektion Puffer mit den folgenden pH-Werten durch pipettieren 1 M NaOH auf die Transfektion Puffer: 6.96 6,97, 6,98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7,05, 7.06, 7,07, 7.08, 7.09, 7.11. Hinweis: Der pH-Wert des Puffers Transfektion ist entscheidend für die Wirksamkeit der Transfektion.</li>
		<li>Um die Transfektion Puffer führt die höchste Zahl von transfizierten Zellen zu testen, testen Sie jede pH-Wert von 6.96 bis 7.11. Verwenden Sie die Transfektion in 2.2-2.11 und eine validierte Plasmid mit dem Ausdruck GFP beschriebene Methode. Bestimmen Sie die Anzahl von transfizierten Zellen pro Deckglas für jeden Transfektion Puffer pH Wert zu beurteilen welche Puffer am besten funktioniert.</li>
		<li>Aliquoten der Puffer mit dem höchsten Wirkungsgrad der Transfektion in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen Einfrieren und lagern die Rohre bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wärmen Sie reduzierte Serum Medium, Zellkulturmedium und destilliertem Wasser auf 37 ° C im Wasserbad vor.</li>
	<li>Bereiten Sie die Transfektion Mischung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Arbeiten Sie unter der Laminar-Flow-Haube, sterile Arbeitsbedingungen zu gewährleisten.<ol>
<li>Mix 7,5 µL 2 M-Kalzium-Chlorid mit 4 µg pro Endotoxin-freie DNA (Synaptophysin-mOrange und mGFP/GLP-Rogdi). Fügen Sie Wasser zu einem Gesamtvolumen von 60 mL in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu erreichen.</li>
		<li>60 mL Transfektion Puffer zur Mischung hinzugeben. Um die besten Ergebnisse zu erhalten, fügen Sie die Transfektion Puffer tropfenweise beim Schütteln der DNA-Mix vorsichtig auf den Wirbel.</li>
		<li>20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Vermeiden Sie schütteln die Inkubation Röhre während der Inkubationszeit indem man das Rohr neben der Laminar-Flow-Haube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie unter der Haube Laminar-Flow Zellkulturmedium ("konditionierten Medium") aus den Brunnen mit einer 1000 mL pipettieren zu und speichern Sie es in einem separaten Behälter im Inkubator.</li>
	<li>Jedes gut 500 mL reduzierte Serum Medium hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 bis 20-minütigen Inkubationszeit (Schritt 2.3.3) vorbei ist.</li>
	<li>Geben Sie 30 mL Transfektion Mischung in jede Vertiefung durch pipettieren einige Tropfen hinzu. Entsorgen Sie die Rückstände an der Unterseite des Rohres.</li>
	<li>Nachdem alle Brunnen mit Transfektion Mix geliefert wurden, schütteln Sie vorsichtig 24-Well-Platte um die Verteilung der Transfektion Mischung in das Medium zu gewährleisten.</li>
	<li>60 Minuten bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren Sie Brunnen.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie den Transfektion Mix und waschen Sie es dreimal mit Zellkulturmedium. Fügen Sie 1 mL Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren sie für 30 Sekunden bei RT. entfernen Sie 750 mL des Mediums und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie dies dreimal. Hinweis: Die Waschschritt ist von entscheidender Bedeutung. Halten Sie die Zeit, die jeweils gut kein Medium im Mindestfall (i.e., entfernen und Ersetzen von Brunnen von Brunnen) und fügen Sie das waschmedium sanft.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie der Zellkulturmedium und 450 mL des konditionierten Medium gut-durch-Brunnens.</li>
	<li>Lassen Sie die Reifen in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 DIV 10 Neuronen.</li>
</ol>(3) Stimulation und Syt1 Aufnahme
Hinweis: Das folgende Protokoll gilt die Aufnahme für 3 Brunnen. Passen Sie für die Depolarisation beliebig vieler Brunnen die Mengen entsprechend an.
<ol><li>50 mL 10 X Depolarisation Puffer (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glukose, 200 mM HEPES, pH 7,4) in einen Erlenmeyerkolben vorzubereiten. Hinweis: Depolarisation Puffer kann für mehrere Wochen bei 4 ° C gehalten werden. Wenn eine Lösung nicht depolarisierende auch verwendet wird, bereiten Sie ein 10 X Tyrode Lösung bestehend aus 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glukose, 200 mM HEPES pH 7.4 um vergleichen Stimulation induzierte recycling mit spontanen das Recycling. Fügen Sie nach Verdünnung auf 1 X 1 µM von Tetrodotoxin vor Gebrauch, Aktionspotential Generation zu blockieren.<ol>
<li>1,87 g NaCl, KCl, MgCl2-6 H20 0,1 g, 0,15 g CaCl2-2 H2O und 3,0 g Glukose-1 H2O und 2,38 g HEPES in 50 mL destilliertem Wasser in einen Erlenmeyerkolben 2,61 g auflösen. Passen Sie den pH mit NaOH und Sterilfilter die Lösung. Verdünnen Sie den Puffer 01:10 in destilliertem Wasser, 1 X Konzentration zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixierung nach Stimulation 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer (pH 7,4) vorbereiten.<ol>
<li>Für 500 mL 4 % PFA in 1 X PBS, lösen Sie 20 g Paraformaldehyd in 450 mL destilliertem H2O. Hinweis: Die Heizlösung können beschleunigen, auflösen, aber nicht die Lösung über 70 ° C erhitzen, wie die PFA zerfallen kann. Achtung: PFA ist toxisch, potentiell krebserzeugend und teratogen. Tragen Sie Handschuhe bei der Arbeit mit PFA, arbeiten unter dem Abzug und Verschlucken zu vermeiden.</li>
		<li>Lassen Sie die Lösung abkühlen, RT und 50 mL 10 X PBS-Stammlösung. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit NaOH/HCl mit dem pH-Meter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorwärmen von 1 x Depolarisation Puffer 600 mL und 10 mL Zellkulturmedium auf 37 ° C im Wasserbad.</li>
	<li>1 x Depolarisation Puffer und Vortex 1 mL der Maus Anti-Syt1 Antikörper (Klon 604.2) für 10 Sekunden hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie der Zellkulturmedium aus den Zellen. Fügen Sie 200 mL des Depolarisation-Antikörper-Mix, jeweils gut und 5 Minuten bei 37 ° C und 5 % CO2 im Inkubator inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie den Depolarisation-Antikörper-Mix und waschen Sie es dreimal mit Zellkulturmedium. Fügen Sie 1 mL Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 30 Sekunden bei RT. entfernen Sie 750 mL des Mediums und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie dreimal.</li>
	<li>Entfernen und verwerfen die Zellkulturmedium und 300 mL 4 % PFA mit 1 X PBS-Puffer. 20 Minuten bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Drei Mal für jeweils 5 Minuten mit 1 X PBS waschen. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>(4) Immunocytochemistry
<ol><li>50 mL blockierende Puffer vorzubereiten. Hinweis: Puffer blockiert kann bei-20 ° C mehrere Monate aufbewahrt werden.<ol>
<li>2,5 g Saccharose und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) in 5 mL 10 X PBS-Stammlösung auflösen. 1,5 mL Waschmittel Stammlösung 10 % zugeben. Rühren Sie die Lösung, bis alle Komponenten ordnungsgemäß aufgelöst haben und fügen Sie destilliertes H2O, bis hin zu einem Endvolumen von 50 mL. Aliquoten die Lösung und die Aliquote zur Aufbewahrung einfrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdünnen Sie die sekundären, Fluorophor-gekoppelten Antikörper (gegen die primäre Syt1-Antikörper-Arten) in 200 mL blockierende Puffer in jede Vertiefung bei einer Verdünnung von 1: 1000.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie 1 X PBS aus gut mit jeweils einem deckgläschen.</li>
	<li>200 mL Puffer-Antikörper Mischung in jede Vertiefung zu blockieren und 60 Minuten bei RT inkubieren Achtung: Da der Sekundärantikörper lichtempfindlich sind, müssen alle Schritte vorwärts in der Dunkelheit durchgeführt werden.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Inkubation der Zellen drei Mal für 5 Minuten mit 1 mL 1 X PBS.</li>
	<li>Einbetten der Deckgläsern auf Objektträger mit dem Einbetten von Medium.<ol>
<li>Tropfen Sie einen 7 mL Medium auf dem Objektträger einbetten. Entfernen Sie das Deckglas aus 24-Well-Platte mit einer Spritze anheben und mit der Pinzette greifen. Achtung: Zellen an der Oberfläche das Deckglas sind leicht beschädigt, so dass Zange mit Sorgfalt behandelt werden muss.</li>
		<li>Tauchen Sie das Deckglas in destilliertem Wasser auf die PBS zu entfernen und durch berühren einer Kante auf einem weichen Tuch trocknen.</li>
		<li>Drehen Sie das Deckglas auf das Einbetten von mittleren Tröpfchen, so dass die Oberfläche der Zellen tragen den Mikroskop-Objektträger, damit Einbettung der Zellen in das einbettende Medium steht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Folien unter der Haube für 1-2 Std. trocknen lassen (decken, um Lichteinfall zu vermeiden) und speichern sie in einer Mikroskop-Folie-Box bei 4 ° C. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>(5) mikroskopische Analyse
<ol><li>Nachdem die Deckgläsern trocken, legen Sie sie unter dem Mikroskop Objektive und Kamera.</li>
	<li>Passen Sie die Belichtungszeit für jeden Kanal, sodass einige Pixel überbelichtet sind, um maximale Verteilung der Grauwerte zu gewährleisten. Hinweis: Während die Belichtungszeit zwischen den Kanälen variieren kann, sollte es für einen Kanal zur Vergleichbarkeit zwischen den Deckgläsern konstant sein.</li>
	<li>Multi-Channel-Bilder für 10 Regionen von Interesse (ROIs) pro Deckglas zu erwerben. Überprüfen Sie, dass der ROI enthält axonalen Prozesse von transfizierten Neuron durch Prüfung GLP-Fluoreszenz, die punktförmige sein sollte.</li>
</ol>6. statistische Analyse
<ol><li>Exportieren Sie die Bilder als .tif-Dateien. Laden Sie die Bilder in OpenView18 , indem Sie auf Datei | Last-Image-Datei.</li>
	<li>Wählen Sie das Synaptophysin-mOrange Bild als Kanal 1, Rogdi-GLP/mGFP Bild als 2-Kanal und Alexa647 fluoreszenzbild als Kanal 3.</li>
	<li>Schwelle des ROIs.<ol>
<li>Klicken Sie auf Analyse | Ort-Bereich über Puncta. Wählen Sie Schwelle und Delta Intensität Werte, so dass bei der Sichtprüfung, diffuse Fluoreszenz ausgeschlossen wird, so dass nur punktförmige Signale in das Bild des Kanals 1 (für Synaptophysin-mOrange Fluoreszenz). Halten Sie die gleiche Schwelle für alle Bilder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie diese ROIs auf den entsprechenden Kanal 2 (GLP-Rogdi/mGFP Fluoreszenz) und 3 (Syt1-Fluoreszenz) der einzelnen Deckglas Bereiche durch Klicken auf jetzt ausführen. Hinweis: Der ROIs sollte nur berücksichtigt werden, wenn die Zelle doppelt transfiziert. Bei dieser Methode sollte mOrange und GFP-Fluoreszenz deutlich sichtbar sein.</li>
	<li>Sichern Sie die Daten in die Analyse-Log-Editor, indem Sie auf Log-Daten.</li>
	<li>Öffnen Sie den Analyse-Log-Editor unter der Registerkarte " Windows " und kopieren Sie die Werte für jeden Kanal. Die Werte für die separate Kanäle in ein Arbeitsblatt einfügen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität des Syt1-Kanals Rois in beide Transfektion Bedingungen (GFP-Rogdi und mGFP).</li>
	<li>Gelten Sie entsprechende statistische Tests wie der Student t-Test signifikante Unterschiede feststellen.</li>
</ol>

<ol>
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D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Remodeling+of+the+Presynaptic+Cytomatrix+upon+Homeostatic+Adaptation+to+Network+Activity+Silencing.">Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing.</a> Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).</li><li>Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+synaptic+vesicles+in+nerve+endings+monitored+by+recovery+from+photobleaching+of+synaptic+vesicle-associated+fluorescence.">Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence.</a> Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).</li><li>Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+origin+of+synaptic+vesicles+undergoing+evoked+and+spontaneous+fusion.">A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion.</a> Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).</li><li>Han, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycosylation+Is+Essential+for+Vesicular+Targeting+of+Synaptotagmin+1.">N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1.</a> Neuron. 41, 85-99 (2004).</li><li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+is+dispensable+for+sorting+of+synaptotagmin+1+but+is+critical+for+targeting+of+SV2+and+synaptophysin+to+recycling+synaptic+vesicles.">Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).</li><li>Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pool-specific+modification+of+neurotransmitter+release+by+intravesicular+free+radical+generation.">Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation.</a> The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).</li><li>Sara, Y., Virmani, T., De&#225;k, F., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isolated+pool+of+vesicles+recycles+at+rest+and+drives+spontaneous+neurotransmission.">An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 45, 563-573 (2005).</li><li>Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+same+synaptic+vesicles+drive+active+and+spontaneous+release.">The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release.</a> Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).</li><li>Bacci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+blockade+of+glutamate+receptors+enhances+presynaptic+release+and+downregulates+the+interaction+between+synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated+membrane+protein+2.">Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2.</a> Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).</li><li>Piccoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+Controls+Synaptic+Vesicle+Storage+and+Mobilization+within+the+Recycling+Pool.">LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool.</a> Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).</li><li>Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+knockdown+of+AMPA+receptors+reveals+a+trans-synaptic+signal+for+presynaptic+maturation.">Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation.</a> The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).</li><li>Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+synaptic+vesicles+are+inactivated+by+contamination+with+SNAP25.">Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25.</a> bioRxiv. , 172239 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es gibt drei Tests routinemäßig zur synaptischen Vesikel (SV) recycling zu studieren. Die ersten beiden umfassen die Verwendung von einem) fluoreszierende Styryl Farbstoffe wie FM1-43 (die in Membranen zu integrieren, sind in den Organellen während Endozytose aufgenommen und werden nach Exozytose freigesetzt); und b) eindringmittel getaggt rekombinante SV-Proteine (die bei Überexpression, in die proteinhaltige recycling Maschinen integrieren). Wenn die angehängte Fluorophore ihre Fluoreszenz je nach pH-Wert ändern,...

Studium der synaptischen Vesikel recycling ist wichtig bei der Bestimmung, wie präsynaptischen Eigenschaften, während Synaptische Plastizität oder in Reaktion auf die Störung der synaptischen Funktion verändern. Antikörper-Aufnahme bietet Studium Synaptotagmin-1 (Syt1) eine Methode zur Messung der Menge von recycling-SV. Syt1 ist ein SV-assoziierten Protein, das wirkt wie ein Ca2 + Sensor und ist notwendig für steht Freisetzung von Neurotransmitter-1,-2. Es ist ein transmembranen Protein mit einer C-terminalen cytoplasmatischen Domäne außerhalb der SV und eine N-terminale luminalen Domäne innerhalb der SV3. Bei Exozytose wird das externe Medium die luminalen Domäne der Syt1 ausgesetzt. Um diese externen Medium fügen wir Antikörper gegen die cytoplasmatischen Domäne, die während der Endozytose internalisiert wird. Diese Antikörper können man entweder mit Fluorophore oder Immunostained mit Sekundärantikörper4,5,6,7Pre konjugiert. Der Fluoreszenzintensität von der daraus resultierenden Immunosignal ist proportional zur Menge des SV recycling. Dieser Ansatz lässt sich bestimmen, konstitutiven und Depolarisation-induzierte SV recycling6,8.
Syt1 Aufnahme Assays können nach Virus-vermittelte Gentransfer auf praktisch alle Zellen in der Schale oder spärlich Transfektion von einer kleinen Anzahl von Zellen durchgeführt werden. Unsere Methode verbindet den Assay mit spärlich Doppel Transfektion von primären hippocampal Neuronen mit Calcium-Phosphat-9. Wir verwenden eine rekombinante Marker Protein bekannt zu akkumulieren bei Presynapses, eindringmittel tagged Synaptophysin zu lokalisieren präsynaptischen Klemmen und overexpress unser Protein des Interesses, Rogdi. Dies ermöglicht es uns testen ob Rogdi Ziele funktionale Synapsen und wirkt sich auf SV recycling. Das Gen Kodierung Rogdi wurde ursprünglich in einem Bildschirm für Drosophila-Mutanten zeichnet sich durch Gedächtnisstörungen10identifiziert. Mutationen im Rogdi-Gen verursachen beim Menschen eine seltene und verheerende Krankheit namens Kohlschütter-Tönz-Syndrom. Patienten leiden unter Zahnschmelz Fehlbildungen, sind Epilepsie und psychomotorische Verzögerungen; jedoch blieb die subzelluläre Lokalisation des genprodukts schwer fassbaren11. Somit bot die Syt1 Aufnahme Assay wichtige Beweismittel für die Lokalisierung von GFP-markierten Rogdi auf funktionale Synapsen9.
Diese Aufnahme-Technik hat mehrere Vorteile. Erstens kann SV recycling sowohl in Echtzeit durchführen live imaging7,12, und nach Fixierung6,9 beobachtet werden durch Messung der Fluoreszenzintensität des Syt1 Fluoreszenz Label. Darüber hinaus wurden mehrere Syt1 Antikörper Varianten entwickelt. Es gibt unmarkierten, die mit einem sekundären Antikörper nach einem standard Immunostaining Protokoll nach Fixierung beschriftet werden können, und Pre-konjugierten Varianten mit einem Fluoreszenz-Label bereits angebracht. Schließlich ist die Antikörper-basierten Fluoreszenz vorteilhaft durch die große Auswahl an handelsüblichen Sekundär- oder konjugierte Farbstoffe, die verwendet werden können.
Bei der Festsetzung und Immunostaining Neuronen, es ist auch möglich, für zusätzliche Proteine zu beflecken und ns1 Analysen durchführen. Dies kann helfen, festzustellen, wo sie sich in Bezug auf recycling SVs befinden. Die Intensität der Fluoreszenz-Label ist direktes Maß für die Höhe der SV-recycling. Darüber hinaus kennzeichnen die Antikörper selektiv Syt1-haltigen Strukturen, was hohe Spezifität und wenig Hintergrund-Fluoreszenz-4. Verschiedenen Protokolle können auch verwendet werden, z. B. Depolarisation Puffer oder elektrische Stimulation Protokolle9,12,13,14. Jedoch kann basalen SV recycling ohne Stimulierung der neuronalen Kulturen15gemessen werden.
Unsere Methode befasst sich speziell mit Syt1 Antikörper Aufnahme in Doppel-transfizierten Neuronen mit Sekundärantikörper Immunolabeling nach der Fixierung. Allerdings verweisen wir auf alle routinemäßig verwendeten Varianten des Tests in unserer Diskussion um Zuschauer geben die Möglichkeit, das Protokoll auf spezifischen Bedürfnisse anzupassen.

<table><tbody><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-50g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-100g</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Invitrogen</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>8.03456.0100</td><td></td></tr><tr><td>donkey anti mouse Alexa 647</td><td>Jackson-Immunoresearch</td><td>715605151</td><td>antibody</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>multiwell 24 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721H</td><td></td></tr><tr><td>tube (50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>BiochromAG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>1,083,421,000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td><td>ThermoElectron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500g</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Honeywell</td><td>M0250-500g</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OpenView Experiment Analysis Application</td><td>Free software, see comments</td><td></td><td>written by Noam E. Ziv, Technion &amp;ndash; Israel Institute of Technology, Haifa, Israel</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>safety hood</td><td>ThermoElectron</td><td></td><td>Serial No. 40649111</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>neoFroxx</td><td>1104kg001</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin1</td><td>Synaptic Systems</td><td>105311</td><td>mouse monoclonal; clone 604.2</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1,086,031,000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&amp;nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Observer. Z1&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an optical assay for synaptic vesicle recycling in cultured neurons overexpressing presynaptic proteins

Bei aktiven präsynaptischen nervenausgänge unterziehen synaptischen Vesikel Zyklen von Exo und Endozytose. Beim recycling, der luminalen Domänen des SV transmembranen Proteine an der Zelloberfläche ausgesetzt. Eines dieser Proteine ist Synaptotagmin-1 (Syt1). Ein Antikörper gegen der luminalen Domäne der Syt1, einmal hinzugefügt, um dem Kulturmedium wird während des Exo-endocytotic Zyklus aufgegriffen. Diese Aufnahme ist proportional zur Menge des SV recycling und durch Immunfluoreszenz quantifiziert werden kann. Hier verbinden wir Syt1 Antikörper Aufnahme mit doppelten Transfektion von kultivierten hippocampal Neuronen. Dies ermöglicht uns (1) lokalisieren präsynaptischen Websites basierend auf Ausdruck der rekombinanten präsynaptischen Marker Synaptophysin, (2) bestimmen ihre Funktionalität mit Syt1 Aufnahme und (3) charakterisieren das Zielen und Wirkungen eines Proteins des Interesses, GFP-Rogdi.

Ein erwartetes Ergebnis dieses Ansatzes ist ca. 50 Doppel-transfizierten Neuronen pro Deckglas bei einer Dichte von 50.000 Neuronen pro Bohrloch Auffinden. Das Axon jedes Neuron wird voraussichtlich mehrere Hotspots fluoreszent markiert Synaptophysin Akkumulation, Angabe Cluster OfSVs zeigen. Funktionale präsynaptischen Standorten colocalizes das rekombinante Synaptophysin Signal mit punktförmige Syt1 Fluoreszenz. Verwenden doppelte Transfektion, ist GLP-Rogdi als das Protein des Intere...

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An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K Aufrufe.  University Medical Centre Göttingen. Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Serie: An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become imperative to develop objective approaches to quantify changes in synaptic connectivity. Starting from sample fixation, this protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers. The number of these colocalizations is quantified using a plug in Puncta Analyzer (written by Bary Wark, available upon request, c.eroglu@cellbio.duke.edu) under the ImageJ analysis software platform. The synapse assay described in this protocol can be applied to any neural tissue or culture preparation for which you have selective pre- and postsynaptic markers. This synapse assay is a valuable tool that can be widely utilized in the study of synaptic development.

This protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Forschung

Neurowissenschaften

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

Ein High-Content-Assay für die Überwachung der AMPA Rezeptor Menschenhandel

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in appropriate order by transport from cell bodies and/or local translation in immature synapses. However, it is not fully understood how synaptic proteins accumulate in synapses in proper order. Here, we present a novel method to analyze presynaptic formation by using the combination of neuron ball culture with beads to induce presynapse formation. Neuron balls that is neuronal cell aggregates provide axonal sheets far from cell bodies and dendrites, so that weak fluorescent signals of presynapses can be detected by avoiding overwhelming signals of cell bodies. As beads to trigger presynapse formation, we use beads conjugated with leucine-rich repeat transmembrane neuronal 2 (LRRTM2), an excitatory presynaptic organizer. Using this method, we demonstrated that vesicular glutamate transporter 1 (vGlut1), a synaptic vesicle protein, accumulated in presynapses faster than Munc18-1, an active zone protein. Munc18-1 accumulated translation-dependently in presynapse even after removing cell bodies. This finding indicates the Munc18-1 accumulation by local translation in axons, not transport from cell bodies. In conclusion, this method is suitable to analyze accumulation of synaptic proteins in presynapses and source of synaptic proteins. As neuron ball culture is simple and it is not necessary to use special apparatus, this method could be applicable to other experimental platforms.

Presynapse formation is a dynamic process including accumulation of synaptic proteins in proper order. In this method, presynapse formation is triggered by beads conjugated with a presynapse organizer protein on axonal sheets of &#8220;neuron ball&#8221; culture, so that accumulation of synaptic proteins is easy to be analyzed during presynapse formation.

Presynapse Formation Assay mit Presynapse Organizer Perlen und "Neuron Ball" Kultur

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...