Wir danken Irmgard Weiss für kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der DFG über des Exzellenzclusters für Mikroskopie im Nanometerbereich und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB, B1-7, T.D) unterstützt.

Keine Studien mit lebenden Tieren wurden durchgeführt. Experimente mit euthanasierten Tiere, um die Zelle zu erhalten, die Kulturen von den lokalen Tierschutz Behörden (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) unter der Zustimmung genehmigt wurden Nummer T10/30. Die Experimente wurden mit der genehmigten Protokolle geführt.
1. primäre Hippocampal Zellkultur
<ol><li>Bereiten Sie die dissoziierten Zellkultur der Ratte Hippocampus am embryonalen Tag 1916,17. Die Zellen auf 12 mm Deckgläsern beschichtet mit Polyethyleneimine (PEI) in 24 Wohlen Teller bei einer Dichte von 50.000-60.000 Zellen/Well-Platte. Überprüfen Sie die Dichte mit einer Zelle zählen Industrie- und Phase Kontrast-Optik.</li>
	<li>Kultur der Neuronen für 3 Tage (Tag in Vitro (DIV) 3) in einer 24-Well-Platte im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Bewerten Sie die Deckgläsern für Indikatoren für die Zellgesundheit mit übertragenen Lichtmikroskopie (z. B. Phase Kontrast-Optik bei einer Vergrößerung von 10-20 X). Überprüfen Sie, ob die folgenden Indikatoren für eine gute Gesundheit: eine klare Phase Kontrast Halo, Neuriten ohne Perlen Strukturen und keine Soma clustering oder Neuriten zu bündeln.</li>
</ol>(2) transfection
Hinweis: Das folgende Protokoll bezieht sich auf eine Doppel-Transfektion für 3 Brunnen. Allerdings funktioniert das Protokoll am besten Beträge für 4 Brunnen ausreichend vorbereitet sind.
<ol><li>In einen Erlenmeyerkolben 500 mL Transfektion Puffer (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, 15 mM Glukose, 42 mM HEPES) vorzubereiten.<ol>
<li>8,0 g NaCl, 0,37 g KCl 0,095 g Na2HPO4, 1,35 g Glukose und 5,0 g HEPES in 400 mL destilliertem Wasser in einen Erlenmeyerkolben auflösen.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 6,95 mit 1 M NaOH mit dem pH-Meter.</li>
		<li>Stellen Sie die Lautstärke mit destilliertem Wasser auf 500 mL, und überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Meter.</li>
		<li>Machen Sie 20-30 mL-aliquoten Transfektion Puffer mit den folgenden pH-Werten durch pipettieren 1 M NaOH auf die Transfektion Puffer: 6.96 6,97, 6,98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7,05, 7.06, 7,07, 7.08, 7.09, 7.11. Hinweis: Der pH-Wert des Puffers Transfektion ist entscheidend für die Wirksamkeit der Transfektion.</li>
		<li>Um die Transfektion Puffer führt die höchste Zahl von transfizierten Zellen zu testen, testen Sie jede pH-Wert von 6.96 bis 7.11. Verwenden Sie die Transfektion in 2.2-2.11 und eine validierte Plasmid mit dem Ausdruck GFP beschriebene Methode. Bestimmen Sie die Anzahl von transfizierten Zellen pro Deckglas für jeden Transfektion Puffer pH Wert zu beurteilen welche Puffer am besten funktioniert.</li>
		<li>Aliquoten der Puffer mit dem höchsten Wirkungsgrad der Transfektion in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen Einfrieren und lagern die Rohre bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wärmen Sie reduzierte Serum Medium, Zellkulturmedium und destilliertem Wasser auf 37 ° C im Wasserbad vor.</li>
	<li>Bereiten Sie die Transfektion Mischung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Arbeiten Sie unter der Laminar-Flow-Haube, sterile Arbeitsbedingungen zu gewährleisten.<ol>
<li>Mix 7,5 µL 2 M-Kalzium-Chlorid mit 4 µg pro Endotoxin-freie DNA (Synaptophysin-mOrange und mGFP/GLP-Rogdi). Fügen Sie Wasser zu einem Gesamtvolumen von 60 mL in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu erreichen.</li>
		<li>60 mL Transfektion Puffer zur Mischung hinzugeben. Um die besten Ergebnisse zu erhalten, fügen Sie die Transfektion Puffer tropfenweise beim Schütteln der DNA-Mix vorsichtig auf den Wirbel.</li>
		<li>20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Vermeiden Sie schütteln die Inkubation Röhre während der Inkubationszeit indem man das Rohr neben der Laminar-Flow-Haube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie unter der Haube Laminar-Flow Zellkulturmedium ("konditionierten Medium") aus den Brunnen mit einer 1000 mL pipettieren zu und speichern Sie es in einem separaten Behälter im Inkubator.</li>
	<li>Jedes gut 500 mL reduzierte Serum Medium hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 bis 20-minütigen Inkubationszeit (Schritt 2.3.3) vorbei ist.</li>
	<li>Geben Sie 30 mL Transfektion Mischung in jede Vertiefung durch pipettieren einige Tropfen hinzu. Entsorgen Sie die Rückstände an der Unterseite des Rohres.</li>
	<li>Nachdem alle Brunnen mit Transfektion Mix geliefert wurden, schütteln Sie vorsichtig 24-Well-Platte um die Verteilung der Transfektion Mischung in das Medium zu gewährleisten.</li>
	<li>60 Minuten bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren Sie Brunnen.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie den Transfektion Mix und waschen Sie es dreimal mit Zellkulturmedium. Fügen Sie 1 mL Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren sie für 30 Sekunden bei RT. entfernen Sie 750 mL des Mediums und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie dies dreimal. Hinweis: Die Waschschritt ist von entscheidender Bedeutung. Halten Sie die Zeit, die jeweils gut kein Medium im Mindestfall (i.e., entfernen und Ersetzen von Brunnen von Brunnen) und fügen Sie das waschmedium sanft.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie der Zellkulturmedium und 450 mL des konditionierten Medium gut-durch-Brunnens.</li>
	<li>Lassen Sie die Reifen in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 DIV 10 Neuronen.</li>
</ol>(3) Stimulation und Syt1 Aufnahme
Hinweis: Das folgende Protokoll gilt die Aufnahme für 3 Brunnen. Passen Sie für die Depolarisation beliebig vieler Brunnen die Mengen entsprechend an.
<ol><li>50 mL 10 X Depolarisation Puffer (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glukose, 200 mM HEPES, pH 7,4) in einen Erlenmeyerkolben vorzubereiten. Hinweis: Depolarisation Puffer kann für mehrere Wochen bei 4 ° C gehalten werden. Wenn eine Lösung nicht depolarisierende auch verwendet wird, bereiten Sie ein 10 X Tyrode Lösung bestehend aus 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glukose, 200 mM HEPES pH 7.4 um vergleichen Stimulation induzierte recycling mit spontanen das Recycling. Fügen Sie nach Verdünnung auf 1 X 1 µM von Tetrodotoxin vor Gebrauch, Aktionspotential Generation zu blockieren.<ol>
<li>1,87 g NaCl, KCl, MgCl2-6 H20 0,1 g, 0,15 g CaCl2-2 H2O und 3,0 g Glukose-1 H2O und 2,38 g HEPES in 50 mL destilliertem Wasser in einen Erlenmeyerkolben 2,61 g auflösen. Passen Sie den pH mit NaOH und Sterilfilter die Lösung. Verdünnen Sie den Puffer 01:10 in destilliertem Wasser, 1 X Konzentration zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixierung nach Stimulation 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer (pH 7,4) vorbereiten.<ol>
<li>Für 500 mL 4 % PFA in 1 X PBS, lösen Sie 20 g Paraformaldehyd in 450 mL destilliertem H2O. Hinweis: Die Heizlösung können beschleunigen, auflösen, aber nicht die Lösung über 70 ° C erhitzen, wie die PFA zerfallen kann. Achtung: PFA ist toxisch, potentiell krebserzeugend und teratogen. Tragen Sie Handschuhe bei der Arbeit mit PFA, arbeiten unter dem Abzug und Verschlucken zu vermeiden.</li>
		<li>Lassen Sie die Lösung abkühlen, RT und 50 mL 10 X PBS-Stammlösung. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit NaOH/HCl mit dem pH-Meter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorwärmen von 1 x Depolarisation Puffer 600 mL und 10 mL Zellkulturmedium auf 37 ° C im Wasserbad.</li>
	<li>1 x Depolarisation Puffer und Vortex 1 mL der Maus Anti-Syt1 Antikörper (Klon 604.2) für 10 Sekunden hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie der Zellkulturmedium aus den Zellen. Fügen Sie 200 mL des Depolarisation-Antikörper-Mix, jeweils gut und 5 Minuten bei 37 ° C und 5 % CO2 im Inkubator inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie den Depolarisation-Antikörper-Mix und waschen Sie es dreimal mit Zellkulturmedium. Fügen Sie 1 mL Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 30 Sekunden bei RT. entfernen Sie 750 mL des Mediums und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie dreimal.</li>
	<li>Entfernen und verwerfen die Zellkulturmedium und 300 mL 4 % PFA mit 1 X PBS-Puffer. 20 Minuten bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Drei Mal für jeweils 5 Minuten mit 1 X PBS waschen. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>(4) Immunocytochemistry
<ol><li>50 mL blockierende Puffer vorzubereiten. Hinweis: Puffer blockiert kann bei-20 ° C mehrere Monate aufbewahrt werden.<ol>
<li>2,5 g Saccharose und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) in 5 mL 10 X PBS-Stammlösung auflösen. 1,5 mL Waschmittel Stammlösung 10 % zugeben. Rühren Sie die Lösung, bis alle Komponenten ordnungsgemäß aufgelöst haben und fügen Sie destilliertes H2O, bis hin zu einem Endvolumen von 50 mL. Aliquoten die Lösung und die Aliquote zur Aufbewahrung einfrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdünnen Sie die sekundären, Fluorophor-gekoppelten Antikörper (gegen die primäre Syt1-Antikörper-Arten) in 200 mL blockierende Puffer in jede Vertiefung bei einer Verdünnung von 1: 1000.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie 1 X PBS aus gut mit jeweils einem deckgläschen.</li>
	<li>200 mL Puffer-Antikörper Mischung in jede Vertiefung zu blockieren und 60 Minuten bei RT inkubieren Achtung: Da der Sekundärantikörper lichtempfindlich sind, müssen alle Schritte vorwärts in der Dunkelheit durchgeführt werden.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Inkubation der Zellen drei Mal für 5 Minuten mit 1 mL 1 X PBS.</li>
	<li>Einbetten der Deckgläsern auf Objektträger mit dem Einbetten von Medium.<ol>
<li>Tropfen Sie einen 7 mL Medium auf dem Objektträger einbetten. Entfernen Sie das Deckglas aus 24-Well-Platte mit einer Spritze anheben und mit der Pinzette greifen. Achtung: Zellen an der Oberfläche das Deckglas sind leicht beschädigt, so dass Zange mit Sorgfalt behandelt werden muss.</li>
		<li>Tauchen Sie das Deckglas in destilliertem Wasser auf die PBS zu entfernen und durch berühren einer Kante auf einem weichen Tuch trocknen.</li>
		<li>Drehen Sie das Deckglas auf das Einbetten von mittleren Tröpfchen, so dass die Oberfläche der Zellen tragen den Mikroskop-Objektträger, damit Einbettung der Zellen in das einbettende Medium steht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Folien unter der Haube für 1-2 Std. trocknen lassen (decken, um Lichteinfall zu vermeiden) und speichern sie in einer Mikroskop-Folie-Box bei 4 ° C. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>(5) mikroskopische Analyse
<ol><li>Nachdem die Deckgläsern trocken, legen Sie sie unter dem Mikroskop Objektive und Kamera.</li>
	<li>Passen Sie die Belichtungszeit für jeden Kanal, sodass einige Pixel überbelichtet sind, um maximale Verteilung der Grauwerte zu gewährleisten. Hinweis: Während die Belichtungszeit zwischen den Kanälen variieren kann, sollte es für einen Kanal zur Vergleichbarkeit zwischen den Deckgläsern konstant sein.</li>
	<li>Multi-Channel-Bilder für 10 Regionen von Interesse (ROIs) pro Deckglas zu erwerben. Überprüfen Sie, dass der ROI enthält axonalen Prozesse von transfizierten Neuron durch Prüfung GLP-Fluoreszenz, die punktförmige sein sollte.</li>
</ol>6. statistische Analyse
<ol><li>Exportieren Sie die Bilder als .tif-Dateien. Laden Sie die Bilder in OpenView18 , indem Sie auf Datei | Last-Image-Datei.</li>
	<li>Wählen Sie das Synaptophysin-mOrange Bild als Kanal 1, Rogdi-GLP/mGFP Bild als 2-Kanal und Alexa647 fluoreszenzbild als Kanal 3.</li>
	<li>Schwelle des ROIs.<ol>
<li>Klicken Sie auf Analyse | Ort-Bereich über Puncta. Wählen Sie Schwelle und Delta Intensität Werte, so dass bei der Sichtprüfung, diffuse Fluoreszenz ausgeschlossen wird, so dass nur punktförmige Signale in das Bild des Kanals 1 (für Synaptophysin-mOrange Fluoreszenz). Halten Sie die gleiche Schwelle für alle Bilder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie diese ROIs auf den entsprechenden Kanal 2 (GLP-Rogdi/mGFP Fluoreszenz) und 3 (Syt1-Fluoreszenz) der einzelnen Deckglas Bereiche durch Klicken auf jetzt ausführen. Hinweis: Der ROIs sollte nur berücksichtigt werden, wenn die Zelle doppelt transfiziert. Bei dieser Methode sollte mOrange und GFP-Fluoreszenz deutlich sichtbar sein.</li>
	<li>Sichern Sie die Daten in die Analyse-Log-Editor, indem Sie auf Log-Daten.</li>
	<li>Öffnen Sie den Analyse-Log-Editor unter der Registerkarte " Windows " und kopieren Sie die Werte für jeden Kanal. Die Werte für die separate Kanäle in ein Arbeitsblatt einfügen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität des Syt1-Kanals Rois in beide Transfektion Bedingungen (GFP-Rogdi und mGFP).</li>
	<li>Gelten Sie entsprechende statistische Tests wie der Student t-Test signifikante Unterschiede feststellen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es gibt drei Tests routinemäßig zur synaptischen Vesikel (SV) recycling zu studieren. Die ersten beiden umfassen die Verwendung von einem) fluoreszierende Styryl Farbstoffe wie FM1-43 (die in Membranen zu integrieren, sind in den Organellen während Endozytose aufgenommen und werden nach Exozytose freigesetzt); und b) eindringmittel getaggt rekombinante SV-Proteine (die bei Überexpression, in die proteinhaltige recycling Maschinen integrieren). Wenn die angehängte Fluorophore ihre Fluoreszenz je nach pH-Wert ändern, dienen sie Änderungen zwischen dem sauren Innenraum von einem SV und der pH-Wert des Mediums extrazelluläre überwachen. Die rekombinante Proteine mit einer pH-Sensitive-Variante des GFP markiert werden als Phluorins bezeichnet. Die beiden Assays diskutiert wurden beide vorgestellten zuvor19,20, und die vor- und Nachteile der einzelnen wurden auch bewertete21.
Hier beschreiben wir eine dritte, etablierte Methode4,5,6,7,9,14. Um SV recycling zu testen, nutzen wir die Tatsache, dass die luminalen Domäne der Vesikel-assoziierten Protein Synaptotagmin-1 (Syt1) an der Zelloberfläche nach Exozytose ausgesetzt wird. Zuerst fügen wir einen Antikörper gegen die luminalen Domäne das Kulturmedium, die dann durch die Blase beim SV recycling aufgegriffen wird. Diese Antikörper-Aufnahme ist visualisiert und durch Immunfluoreszenz quantifiziert. Alternativ kann ein direkt beschriftete Syt1-Antikörper verwendet werden. Die Bezeichnung kann pH-unabhängige Berichterstattung Lokalisierung von der Syt1-Antikörper sowohl innerhalb als auch auf der äußeren Oberfläche des SVs oder pH-abhängig, Berichterstattung, Lokalisierung basiert auf Fluoreszenz Änderungen sein. Wir beschreiben auch die Kombination des SV recycling Assays mit doppelten Transfektion von kultivierten Neuronen zu testen, ob ein Protein von Interesse, GFP-Rogdi Zielen funktionale Synapsen und wirkt sich auf recycling-SV. GLP-Rogdi ist spezifisch für diesen Ansatz; Allerdings können die gleichen Fragen für jedes Protein des Interesses zu richten.
Dieser Test wurde erstmals 1992 zur Überwachung der spontanen recycling von SVs4 und wurde von der gleichen Gruppe, evozierte SV12recycling zu überwachen. Ihre Experimente festgestellt, dass Syt1 Aufnahme empfindlich gegen Clostridien Neurotoxine, die SV Exozytose12zu blockieren. Sie zeigte auch, dass die Stimulation der Kulturen durch Depolarisation bei 37 ° C verbessert die Internalisierung von Syt1 Antikörpern im Vergleich zu 1) Kulturen, die auf dem Eis, die meisten Endozytose verhindert gehalten werden, und (2) Kulturen inkubiert bei 37 ° C ohne Stimulation, die für spontane recycling ermöglicht aber nicht recycling12,22hervorrufen. Der Test kann leicht vergleichen SV zwischen zwei Bedingungen, wie z. B. recycling, mit und ohne ein Molekül des Interesses. Insbesondere konzentriert sich dieses Protokoll auf dem Vergleich Syt1 Antikörper Aufnahme in der Gegenwart im Vergleich zu fehlender ein bestimmtes Protein überexprimieren. Das Protokoll kann erweitert werden, wenn die relativen Beiträge der Oberfläche-Bindung, spontane recycling und recycling-evozierten müssen bewertet werden. Beispielsweise verhindert die Inkubation Neuronen auf Eis ohne Stimulation Endozytose, jede Oberfläche Bindung des Antikörpers Syt1 enthüllt. Inkubation der Neuronen bei 37 ° C in der basalen Lösung mit Tetrodotoxin verhindert Aktionspotential Vermehrung, offenbart spontane recycling. So offenbaren Inkubation Neuronen bei 37 ° C unter stimulierenden Bedingungen kann das Ausmaß der evozierten SV recycling.
Lebenden Zellen reagieren empfindlich auf physiologische Voraussetzungen; Wartung, Transfektion und Depolarisation Puffer sollte daher immer für physiologische Parameter wie pH-Wert und Temperatur getestet werden. Während der Depolarisation Puffer durch Sterilfilter übergeben werden können, nachdem der pH-Wert eingestellt hat, sind Transfektion Puffer empfindlich auf sterilen filtern. Daher stellen Sie den pH-Wert, halten Sie es bis zum ersten Gebrauch eingefroren und drehen Sie es in einer Tischplatte Zentrifuge, pellet-alle Bakterien. Zur Transfektion ist es wichtig, den Puffer ausreichend dafür Vereinigung des Plasmids mit Calcium-Phosphat-Kristallen zu mischen. Calcium-Phosphat-Transfektion funktioniert am besten bei Tag in Vitro (DIV) 2-4. Tagged Synaptophysin, ein SV transmembranen Protein verwenden wir als Marker zur Identifizierung von präsynaptischen Klemmen in den transfizierten Neuronen. Tagged Versionen von anderen SV-Proteine wie SV2, Synapsin, und VAMP/Synaptobrevin oder aktive Zone Moleküle wie Fagott, RIM, Munc13-1 und Besetzung können auch verwendet werden.
MCherry und mOrange emittieren rote Fluoreszenz. Obwohl mCherry heller als mOrange, hat es mehr Emission bei langen Wellenlängen als mOrange. Deshalb für die dreifache Fluoreszenz-Bildgebung mit GFP, einen roten Farbstoff und ein Farbstoff im Bereich von 700 nm emittieren, mOrange eine bessere Option als mCherry. Für doppelten Fluoreszenz mit GFP und einen roten Farbstoff kann mCherry günstig sein, da es die hellere Farbe ist. Um spärlich Transfektion zu gewährleisten, sollten die Transfektion Mischung nicht länger als 60 Minuten inkubiert. Es ist auch wichtig, dass die Inkubation in einem depolarisierende Puffer ist die richtige Länge der Zeit, Exozytose von allen Vesikeln zu gewährleisten. Längere Exposition gegenüber der depolarisierende Puffer muss jedoch vermieden werden. Während der Bildaufnahme ist es auch wichtig, es gelten die gleichen Belichtungszeiten und Lichtintensitäten zu quantifizierbaren Vergleich zwischen verschiedenen Experimenten zu gewährleisten.
Schließlich umfasst unser Protokoll während der Bildanalyse, mehrere Überlegungen. Für ein Gebiet von Interesse, die rekombinante Synaptophysin Puncta zeigt ist die Schwelle niedriger Intensität festlegen, so dass diffuse Fluoreszenz ausgeschlossen ist. Als nächstes wird diese Schwelle auf andere Bereiche und Deckgläsern ähnliche Aufnahme von punktförmige Signale und Ausschluss von diffusen Fluoreszenz beobachten getestet. Sobald eine geeignete Schwelle erkannt wird, wird es auf alle Bilder, Erzeugerregionen Interesse (ROIs) des rekombinanten Synaptophysin (markiert mit mCherry oder mOrange) Kanals punctata angewendet. Zu guter Letzt ist Syt1 Intensität der ROIs9bestimmt.
Unser Ansatz ist für spärlich Transfektion optimiert. Wir analysieren präsynaptischen Funktion in einer komplexen Umgebung wo es SV recycling in Axone der transfizierten Neuronen umgeben von untransfected Neuronen. In diesem Set-up ermöglicht Doppel-Transfektion neuronalen Funktion zu manipulieren, und suchen den präsynaptischen Terminals der transfizierten Neuronen. Transfizierte präsynaptischen Neuronen, die untransfected postsynaptischen Neuronen in Berührung ist ein wichtiger Faktor bei der Beurteilung eines präsynaptischen Neurons Auswirkungen auf das recycling von SV. Die Einstellung kann auch leicht angepasst werden, um zu testen, ob eine postsynaptischen Manipulation präsynaptischen Veränderungen verursacht. In diesem Fall spärlich Transfektion von Neuronen mit einem Protein, das zur postsynaptischen Websites ausgerichtet ist wird die postsynaptischen Standorte der transfizierten Neuronen zu lokalisieren, und Syt1 Aufnahme kann synaptischen Boutons untransfected Neuronen festgesetzt.
Wenn spärlich Transfektion nicht notwendig ist, können unterschiedliche Transfection Protokolle angewendet werden. Z. B. birgt Transfektion mit Lipofectamine auf DIV-7 - 8 Ergebnisse in höhere Transfection Raten, aber es auch stärker Ausdruck in jeder transfizierten Zellen9. Darüber hinaus kann virale Transduktion Ausdruck in fast 100 % der kultivierten Neuronen14,23,24resultieren. In Experimenten zur Überwachung SV recycling kann Transfektion für ein einziges Protein durchgeführt oder ganz weglassen. Zum Beispiel wenn insgesamt synaptischen recycling ist im Vergleich zwischen den Neuronen aus Wildtyp und genetisch veränderte ist Mäuse, Kennzeichnung einzelne Neuronen durch Transfektion nicht notwendig. Darüber hinaus ermöglicht das Immunolabeling von endogenen Proteinen. Wenn die Transfektion fehlschlägt, es ist wichtig, testen die Transfektion Puffer mit einem validierten Plasmid oder verwenden Sie einen Puffer mit verschiedenen pH-Werten (siehe Vorbereitung der Transfektion Puffer). Mit Endotoxin freie DNA-Präparaten scheint auch von entscheidender Bedeutung sein. Immunostaining verinnerlicht Syt1 Antikörper Werke in sowohl PFA-behoben und Methanol fixiert. Anzumerken ist, dass nach der Methanol-Fixierung GFP und RFP Autofluoreszenz verloren geht. Wenn GFP oder RFP in Methanol fixiert Zellen lokalisiert werden muss, müssen dieser Proteine Immunolabeled sein. Syt1 Aufnahme fehlschlägt, sollte Depolarisation Zeit und K+ -Konzentration in der Depolarisation Puffer entsprechend geändert werden. Viele Protokoll-Varianten wurden veröffentlicht, mit Depolarisation Zeiten von 90 s25 bis 60 min12und K+ Konzentrationen von 45 mM, 50 mM, 70 mM und 110 mM6,25,26 ,27. Wenn wiederkehrende Aktivität verhindert werden muss, können Glutamat-Rezeptor-Blocker auch bei Depolarisation hinzugefügt werden. Schließlich, während hohe K+ Depolarisation gedacht ist, um die stärksten Impulse werden Aktionspotentiale auslösen können SV recycling durch weitere physiologische Reize22,28. Unterschiede in der Syt1 Antikörper Aufnahme Wirksamkeit auftreten in Ratte und Maus Kulturen. In unserer Methode der monoklonale Maus-Anti-Syt1-Klon 604.2 (RRID:AB_993036) erzeugt stärkere Färbung in Ratte Kulturen als in Kulturen, Maus, während der polyklonalen Kaninchen-Anti-Syt1-Antikörper (RRID:AB_11042457) erzeugt stärkere Färbung in Maus-Kulturen, aber einige Hinweise zur Vorsicht werden nachfolgend erläutert.
Einige Einschränkungen bezüglich der Verwendung von Anti-Synaptotagmin Antikörper für die Aufnahme in SVs sollten berücksichtigt werden. Erstens fördert N-Glykosylierung von Asparagin 24 der Syt1 die endocytotic Aufnahme von Protein29,30. Asparagin 24 ist Bestandteil der luminalen Domäne der Syt1. Die Maus und Kaninchen Antikörper, die wir verwenden, richten sich gegen Aminosäuren 1-12 und 1-8, bzw. der Syt1. Während ihre Epitope mit der N-Glykosylierung Website nicht überschneiden, werden sterische Behinderung oder umgekehrt, eine Induktion der Aufnahme durch Antikörperbindung ausgeschlossen. Mutation der N-Glykosylierung Website in Syt1 ändert nicht die Kinetik der Endozytose und die Ausrichtung der Syt1 zum SVs. Es erhöht sich den Anteil der Syt1 noch auf die äußere Plasmamembran Oberfläche bei der Endozytose durch schwache Reize induziert wird. Wenn starke Reize, wie hohe K+ Depolarisation angewendet werden, wird keine Verringerung der Syt1-Aufnahme30beobachtet. Insgesamt, wenn die Antikörper mit der N-Glykosylierung Seite in irgendeiner Weise gestört sie könnte dazu führen, dass eine Änderung in SV Endozytose im Vergleich zu Antikörper-freien Bedingungen, aber diese Änderung sollte ähnlich für das Experiment (in unserem Fall die Überexpression des GFP-Rogdi) und das Steuerelement (in unserem Fall der Ausdruck der GLP). Darüber hinaus möglicherweise polyclonal Antikörper eher sterische Probleme und Vernetzung als monoklonale Antikörper zu induzieren, da eine größere Anzahl der Kopie der Antikörper an das Epitop bindet. Wir kennen keine systematischen Studien zum Vergleich der verfügbaren Antikörper mit einander; jedoch haben einige Studien die Wirksamkeit von bestimmten Antikörpern behandelt. Beispielsweise beim SV recycling Kinetik wurden sondiert mit monoklonalen Maus Anti-Syt1 Antikörper Klon 604.2 und Synaptophluorin-Fluoreszenz-Änderungen im direkten Vergleich, wurden ähnliche Ergebnisse validieren die Verwendung dieser Antikörper28. SVs mit polyklonalen Kaninchen Syt1 Antikörper be- und synaptische Übertragung Elektrophysiologisch Aufnahme ergab, dass die geladenen Synapsen synaptische Übertragung in einer Weise erinnert an Verlustfunktion-Mutanten von Syt1 reduziert hatte. Daher wirken diese polyclonal Antikörper synaptische Übertragung. Die tatsächliche Aufnahme ergab spontane und evozierten recycling, was darauf hindeutet, dass ein polyklonalen Antikörper geeignet ist, um eine Runde SV Recycling zu überwachen, aber Vorsicht bei der Interpretation der Ergebnisse nach Aufnahme dieser Antikörper-31.
Drei Tests werden routinemäßig zur SV recycling zu studieren, darunter die Membran Kennzeichnung mit Styryl Farbstoffe, Überexpression des Phluorins, die Syt1-Antikörper-Aufnahme durchgeführt und hier. Alle drei Tests können zur endocytotic und steht Beine SV Recycling herangezogen werden. Während alle drei Assays leistungsstarke Vorteile haben, hat jeder auch eine Einschränkung des Grundsatzes. FM-Farbstoffe kennzeichnen die gesamte Zellenoberfläche und werden in die Zelle mit allen recycling Membranen aufgegriffen. PHluorins müssen durch Überexpression eingeführt werden. Syt1-Antikörper kennzeichnen das körpereigene Protein, aber einige Antikörper können seine Funktion unter bestimmten Bedingungen beeinflussen. Jede Einschränkung kann jedoch passend angesprochenen21.
Insgesamt hat der Syt1 Antikörper Aufnahme Test verschiedenen Zwecken gedient. Erstens wurde es verwendet, um selektiv SVs unterziehen, spontane oder evozierte recycling bzw.28,31,32,33beschriften. Zum anderen diente es den Effekt eines Medikaments oder Protein über das Ausmaß der SV recycling zu bestimmen; zum Beispiel, zu zeigen, dass BDNF spontan und evozierten SV recycling6erhöht. Drittens wurde es zur bestimmen der Anzahl der Synapsen mit recycling SVs als Prozentsatz der die Gesamtzahl der morphologisch definierten Synapsen34,35. Dies ergab, dass überexprimierenden der postsynaptischen Zelle-Adhäsionsmolekül Neuroligin-1 der Prozentsatz von Synapsen mit SVs25 -recycling und reduzieren das Abpumpen der AMPA-Typ Glutamat-Rezeptoren den Anteil der sinkt Synapsen mit SVs, Erhöhung des Anteils von presynaptically stiller Synapsen36-recycling. Darüber hinaus diente der Test, die Mobilität der gekennzeichneten SVs27 zu analysieren und zu bestimmen, die Lokalisierung von Syt1 mit Nanoskopie13,22,33. Schließlich dient diese Methode noch testen, ob bestimmte Proteine zu funktionalen Synapsen9zu lokalisieren. Der Syt1-Antikörper kann auch für Langzeit-Studien, wo bleibt der Antikörper in den Neuronen innerhalb von Tagen nach Aufnahme37verwendet werden. Dies kann mit einer zweiten Runde der Aufnahme mit einer separat beschriftete Syt1 Antikörper oder ein Antikörper gegen den luminalen Domäne eines anderen SV-Proteins kombiniert werden. Damit testen die SVs zunächst recycelt und das Ende eines Experiments zu recyceln. Es wäre interessant, dieser Test mehr intakt Modellsysteme, wie akute Scheiben und organotypischen Slice Kulturen anzupassen. Im Prinzip der Aufnahme-Test ermöglicht den Vergleich von Gewebe aus Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere oder sind kombinierbar mit viralen Lieferung oder Biolistics, dh., "Gen-Kanone," Protein-Expression in diesen Modellsystemen zu manipulieren. In solchen Systemen kann der Einfluss von bestimmten Störungen am präsynaptischen Maschinen, von der Aufnahme-Assay und Netzwerk-Dynamik überwacht gleichzeitig untersucht werden.

Studium der synaptischen Vesikel recycling ist wichtig bei der Bestimmung, wie präsynaptischen Eigenschaften, während Synaptische Plastizität oder in Reaktion auf die Störung der synaptischen Funktion verändern. Antikörper-Aufnahme bietet Studium Synaptotagmin-1 (Syt1) eine Methode zur Messung der Menge von recycling-SV. Syt1 ist ein SV-assoziierten Protein, das wirkt wie ein Ca2 + Sensor und ist notwendig für steht Freisetzung von Neurotransmitter-1,-2. Es ist ein transmembranen Protein mit einer C-terminalen cytoplasmatischen Domäne außerhalb der SV und eine N-terminale luminalen Domäne innerhalb der SV3. Bei Exozytose wird das externe Medium die luminalen Domäne der Syt1 ausgesetzt. Um diese externen Medium fügen wir Antikörper gegen die cytoplasmatischen Domäne, die während der Endozytose internalisiert wird. Diese Antikörper können man entweder mit Fluorophore oder Immunostained mit Sekundärantikörper4,5,6,7Pre konjugiert. Der Fluoreszenzintensität von der daraus resultierenden Immunosignal ist proportional zur Menge des SV recycling. Dieser Ansatz lässt sich bestimmen, konstitutiven und Depolarisation-induzierte SV recycling6,8.
Syt1 Aufnahme Assays können nach Virus-vermittelte Gentransfer auf praktisch alle Zellen in der Schale oder spärlich Transfektion von einer kleinen Anzahl von Zellen durchgeführt werden. Unsere Methode verbindet den Assay mit spärlich Doppel Transfektion von primären hippocampal Neuronen mit Calcium-Phosphat-9. Wir verwenden eine rekombinante Marker Protein bekannt zu akkumulieren bei Presynapses, eindringmittel tagged Synaptophysin zu lokalisieren präsynaptischen Klemmen und overexpress unser Protein des Interesses, Rogdi. Dies ermöglicht es uns testen ob Rogdi Ziele funktionale Synapsen und wirkt sich auf SV recycling. Das Gen Kodierung Rogdi wurde ursprünglich in einem Bildschirm für Drosophila-Mutanten zeichnet sich durch Gedächtnisstörungen10identifiziert. Mutationen im Rogdi-Gen verursachen beim Menschen eine seltene und verheerende Krankheit namens Kohlschütter-Tönz-Syndrom. Patienten leiden unter Zahnschmelz Fehlbildungen, sind Epilepsie und psychomotorische Verzögerungen; jedoch blieb die subzelluläre Lokalisation des genprodukts schwer fassbaren11. Somit bot die Syt1 Aufnahme Assay wichtige Beweismittel für die Lokalisierung von GFP-markierten Rogdi auf funktionale Synapsen9.
Diese Aufnahme-Technik hat mehrere Vorteile. Erstens kann SV recycling sowohl in Echtzeit durchführen live imaging7,12, und nach Fixierung6,9 beobachtet werden durch Messung der Fluoreszenzintensität des Syt1 Fluoreszenz Label. Darüber hinaus wurden mehrere Syt1 Antikörper Varianten entwickelt. Es gibt unmarkierten, die mit einem sekundären Antikörper nach einem standard Immunostaining Protokoll nach Fixierung beschriftet werden können, und Pre-konjugierten Varianten mit einem Fluoreszenz-Label bereits angebracht. Schließlich ist die Antikörper-basierten Fluoreszenz vorteilhaft durch die große Auswahl an handelsüblichen Sekundär- oder konjugierte Farbstoffe, die verwendet werden können.
Bei der Festsetzung und Immunostaining Neuronen, es ist auch möglich, für zusätzliche Proteine zu beflecken und ns1 Analysen durchführen. Dies kann helfen, festzustellen, wo sie sich in Bezug auf recycling SVs befinden. Die Intensität der Fluoreszenz-Label ist direktes Maß für die Höhe der SV-recycling. Darüber hinaus kennzeichnen die Antikörper selektiv Syt1-haltigen Strukturen, was hohe Spezifität und wenig Hintergrund-Fluoreszenz-4. Verschiedenen Protokolle können auch verwendet werden, z. B. Depolarisation Puffer oder elektrische Stimulation Protokolle9,12,13,14. Jedoch kann basalen SV recycling ohne Stimulierung der neuronalen Kulturen15gemessen werden.
Unsere Methode befasst sich speziell mit Syt1 Antikörper Aufnahme in Doppel-transfizierten Neuronen mit Sekundärantikörper Immunolabeling nach der Fixierung. Allerdings verweisen wir auf alle routinemäßig verwendeten Varianten des Tests in unserer Diskussion um Zuschauer geben die Möglichkeit, das Protokoll auf spezifischen Bedürfnisse anzupassen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03456.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti mouse Alexa 647</td>
			<td>Jackson-Immunoresearch</td>
			<td>715605151</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiwell 24 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087721H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube (50 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>BiochromAG</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,083,421,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td>
			<td colspan="2">ThermoElectron Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>M0250-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10144633CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol4-88</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1394KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>5155KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenView Experiment Analysis Application</td>
			<td>Free software, see comments</td>
			<td></td>
			<td>written by Noam E. Ziv, Technion &#8211; Israel Institute of Technology, Haifa, Israel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penstrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>safety hood</td>
			<td>ThermoElectron</td>
			<td></td>
			<td>Serial No. 40649111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>neoFroxx</td>
			<td>1104kg001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptotagmin1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>105311</td>
			<td>mouse monoclonal; clone 604.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3340001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Observer. Z1&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optical assay for synaptic vesicle recycling in cultured neurons overexpressing presynaptic proteins

Bei aktiven präsynaptischen nervenausgänge unterziehen synaptischen Vesikel Zyklen von Exo und Endozytose. Beim recycling, der luminalen Domänen des SV transmembranen Proteine an der Zelloberfläche ausgesetzt. Eines dieser Proteine ist Synaptotagmin-1 (Syt1). Ein Antikörper gegen der luminalen Domäne der Syt1, einmal hinzugefügt, um dem Kulturmedium wird während des Exo-endocytotic Zyklus aufgegriffen. Diese Aufnahme ist proportional zur Menge des SV recycling und durch Immunfluoreszenz quantifiziert werden kann. Hier verbinden wir Syt1 Antikörper Aufnahme mit doppelten Transfektion von kultivierten hippocampal Neuronen. Dies ermöglicht uns (1) lokalisieren präsynaptischen Websites basierend auf Ausdruck der rekombinanten präsynaptischen Marker Synaptophysin, (2) bestimmen ihre Funktionalität mit Syt1 Aufnahme und (3) charakterisieren das Zielen und Wirkungen eines Proteins des Interesses, GFP-Rogdi.

Ein erwartetes Ergebnis dieses Ansatzes ist ca. 50 Doppel-transfizierten Neuronen pro Deckglas bei einer Dichte von 50.000 Neuronen pro Bohrloch Auffinden. Das Axon jedes Neuron wird voraussichtlich mehrere Hotspots fluoreszent markiert Synaptophysin Akkumulation, Angabe Cluster OfSVs zeigen. Funktionale präsynaptischen Standorten colocalizes das rekombinante Synaptophysin Signal mit punktförmige Syt1 Fluoreszenz. Verwenden doppelte Transfektion, ist GLP-Rogdi als das Protein des Interesses (Abbildung 1) oder mGFP als das Steuerelement Co ausgedrückt mit rekombinanten Synaptophysin.
In diesem Experiment analysieren wir SV recycling am präsynaptischen Websites in Neuronen GLP-Rogdi oder mGFP zum Ausdruck zu bringen. Wenn das Steuerelement Protein, mGFP, ist die ganze Zelle homogen verteilt, aber seinen Einfluss an synaptischen Standorten muss noch untersucht werden, dann ist es notwendig, ein zweites Protein Co transfizieren, die presynaptically angereichert ist, markiert eindringmittel Synaptophysin.
Wie oben beschrieben, werden Zellen Depolarisation-induzierte Sender Freigabe unterzogen. Infolgedessen nehmen funktionale Synapsen Syt1 Antikörper hinzugefügt, um das Medium. Nach Immunolabeling der Syt1 Antikörper mit einer fluoreszent markierten Sekundärantikörper ist das Ausmaß der Syt1 Aufnahme schließlich quantifiziert mit Immunosignal (Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58043/58043fig1.jpg"> Abbildung 1: Doppel-transfizierten Zellen. Das Sichtfeld zeigt eine Doppel-transfizierten Zellen GLP-Rogdi (A) und Synaptophysin-mCherry (B) zum Ausdruck bringen. Synaptophysin ist ein reichlich synaptischen Vesikel Protein. Seine rekombinante Variante kann verwendet werden, für die Kennzeichnung der synaptischen Boutons. Die Lokalisierung Muster der GFP-Rogdi ähnelt dem des Synaptophysin-mCherry (C). Skalieren von Balken = 10 μm. Felder zeigen 2,5 X Vergrößerung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58043/58043fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58043/58043fig2.jpg"> Abbildung 2: GLP-Rogdi an funktionalen Synapsen. Live Syt1 Aufnahme erfolgte auf Doppel-transfizierten Zellen mit dem Ausdruck entweder mGFP (grün) und Synaptophysin-mOrange (rot; A-D) oder GLP-Rogdi (grün) und Synaptophysin-mOrange (rot; E-H). Syt1 Antikörper Aufnahme erfolgte mittels eines Maus monoklonaler Antikörpers gegen den luminalen Domäne der Syt1. Nach der Fixierung der PFA wurden Zellen mit Kaninchen Anti-GFP Antikörper gefärbt. Sekundäre Antikörper (Anti-Kaninchen Alexa 488 und Anti-Maus Alexa 647) wurden hinzugefügt, um GFP oder GLP-Rogdi und Syt1, bzw. zu erkennen. Autofluoreszenz des Synaptophysin-mOrange wurde zur präsynaptischen Terminals (B und F) zu erkennen. Punktförmige Syt1 Immunfluoreszenz zeigt Stätten der Vesicle recycling (blau; C und G). Beachten Sie, dass die Mehrheit der Syt1-Label Synapsen nicht transfizierten Neuronen lokalisiert sind. GLP-Rogdi richtete sich an den aktiven Synapsen und synaptische Vesikel recycling (I) nicht verändert. 3 unabhängige Kultur Experimente durchgeführt wurden (N = 3). Mindestens 3 Deckgläsern von jede Kultur (insgesamt 10) wurden für die Analyse verwendet. Zu guter Letzt 3 Bereiche pro Deckglas analysiert wurden (n = 30). Student t-Test zeigte keinen signifikanten Unterschied. Skalieren von Balken = 10 μm. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes (SEM). "N.s." zeigt keine Bedeutung. Diese Zahl wurde von Riemann Et Al. modifiziert 9 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58043/58043fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

an-optical-assay-for-synaptic-vesicle-recycling-cultured-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K Aufrufe.  University Medical Centre Göttingen. Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Serie: An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

Zusammenfassung

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Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen