Die Polymerase-Kettenreaktion, oder PCR ist eine häufig angewandte Methode, um DNA Fragmente zu vervielfältigen. Das PCR beruht auf der Thermocycling-Methode, bei der die Reaktionen wiederholt auf drei verschiedene Temperaturen, die Denaturierung, Hybridisierung und Elongierung genannt werden, erhitzt und abgekühlt werden.
Die PCR Reaktion beginnt, wenn alle PCR Reagenzien in die Thermocycler Maschine platziert werden, die programmiert ist, um die Reaktion präzise zu erhitzen und abzukühlen.
Der PCR Zyklus beginnt mit der Denaturierung, die bei 95°C für 20-30s, also deutlich über dem Schmelzpunkt der DNA, ausgeführt wird. Der Schmelzpunkt ist der Zustand, in dem die Hälfte der DNA eine Doppelstrang-Helix, und die andere Hälfte ein Einzelstrang-„Random Coil“ ist.
Die Denaturierungstemperatur liegt weit über dem Schmelzpunkt, um sicherzustellen, dass alle Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren gebrochen sind, und dass nur Einzelstrang-DNA vorhanden ist. Die beiden Einzelstränge werden Leitstrang und Folgestrang genannt. Die Sequenz des Leitstrangs ist identisch mit der mRNA, die letztendlich das Protein kodiert.
Wenn die DNA von links nach rechts gelesen wird, beginnt sie mit einer 5’ Phosphatgruppe und endet mit einer 3’ Hydroxylgruppe. Der Folgestrang wird auch der komplimentäre Strang genannt, und beginnt mit einer 3’ Hydroxylgruppe und endet mit einer 5’ Phosphatgruppe, wenn er von links nach rechts gelesen wird.
Im zweiten Schritt, der Hybridisierung, binden sich kurze Stücke von DNA, die auch Primer genannt werden, mittels Wasserstoffbrückenbindungen an Leit- und Folgestrang. Der Primer, der den Folgestrang bindet, hat die gleiche Sequenz wie der Leitstrang und ist daher der Vorwärtsprimer. Der Primer, der den Leitstrang bindet, ist umgekehrt komplementär zu dem Leitstrang und ist deshalb der umgekehrte oder Rückwärtsprimer. Abhängig von der Länge des Primers liegt die Hybridisierungstemperatur für diesen Schritt normalerweise 3-5°C unter dem Schmelzpunkt der beiden Primer. Die Hybridisierung findet normalerweise zwischen 50 und 65°C statt und dauert 20-40 Sekunden.
Wenn die Primer an die DNA binden, starten sie die Reaktion, weil sie der Polymerase, einem Enzym, das die DNA repliziert, eine 3’ Hydroxylgruppe zur Verfügung stellen.
Der nächste Schritt wird Elongation genannt und passiert normalerweise bei 72°C, was optimal für die Polymeraseaktivität ist. Wenn sie erst einmal gebunden ist, fängt die Polymerase an freie Deoxy-Nukleotidtriphosphate, oder dNTPs, an das Ende des Primers, eines nach dem anderen von der 5’ in die 3’ Richtung anzufügen, um doppelsträngige DNA herzustellen.
Wenn die Elongation abgeschlossen ist, kann ein neuer Zyklus beginnen. In dem nächsten Zyklus binden sich die Primer an die Einzelstrang-DNA, die bei der vorherigen Elongation entstanden ist. Das kurze Fragment, das man amplifizieren will (welches auch als Amplikon bezeichnet wird) wird letztendlich gebildet, indem die Polymerase mit dem Vorwärtsprimer einen DNA Strang ausgehend von der durch den Rückwärtsprimer entstandenen Amplifikation bildet, oder umgekehrt. Wenn es erstmal hergestellt wurde, erhöht sich die Menge an Amplikon exponentiell in den folgenden Zyklen. Abhängig von dem Ziel der Reaktion werden 20-40 Zyklen benötigt.
Für lange Amplikons wird der letzte Elongationsschritt normalerweise bei 72°C für 5-15 Minuten ausgeführt, um sicherzustellen dass die DNA doppelsträngig ist. Normalerweise wird ein letzter Halteschritt als Vorsichtsmaßnahme bei 4°C in den Thermocycler programmiert, damit die DNA stabil bleibt bis sie aus dem Thermocycler entnommen wird.
Das PCR benötigt einige wichtige Reagenzien. Zuerst braucht man „Template“-DNA, also eine DNA Probe von der ein Fragment amplifiziert werden soll. Dann sind da natürlich noch die Primer, also die kurzen Stücke DNA oder Oligonukleotiden, welche die Reaktion starten.
Beim Aussuchen der Primer gibt es einiges zu beachten. Erstens müssen sie komplementär zu den 5’ und 3’ Regionen der Template-DNA sein, welche die zu amplifizierenden Sequenzen flankieren. Zweitens sollten sie zwischen 15 und 30 Basen lang sein und aus ca. 50% Guanin und Cytosin bestehen. Drittens sollten die Schmelzpunkte der Primer über 50°C Celsius liegen und nur etwa 1 oder 2 Grad voneinander abweichen, damit sie beide effizient bei der Hybridisierungtemperatur binden können. Viertens können sie nicht komplementär mit sich selbst sein und dadurch miteinander hybridisieren. Und fünftens sollten sie keine Sekundärstruktur enthalten, die entsteht wenn ein Primer intern hybridisiert.
Zusätzlich zu den Primer und der Template-DNA ist die DNA Polymerase wichtig für die PCR Reaktion. Das Enzym, das häufig für die PCR benutzt wird, heißt Taq Polymerase und ist ein thermostabiles Enzym, das von dem Bakterium Thermus aquaticus, welches in heißen Quellen zu Hause ist, isoliert worden ist. Die Taq Poymerasen können Temperaturen von mehr als 90°C widerstehen.
Deoxy-Nukleotidtriphosphate, oder dNTPs, welche die Basenpaare in den wachsenden Strängen darstellen, müssen auch noch zu der Reaktion hinzu gefügt werden. Ein Reaktionspuffer, der den pH-Wert beibehält und wichtige Ionen wie Mangan, Magnesium und Kalium bereitstellt, ist außerdem wichtig, um die Reaktion zu stabilisieren und wichtige Kofaktoren für das Polymerase-Enzym bereit zu stellen. Wie alle Reaktionen, benötigt man für das PCR auch ein Lösungsmittel: man benutzt PCR-Grad Wasser, das keine Ionen enthält, welche die Reaktion hemmen können.
Bevor man mit dem PCR beginnt, sollte man sicherstellen, dass die Arbeitsumgebung sauber ist, um eine Kontamination zu vermeiden. Handschuhe müssen immer getragen werden.
Man sollte eine Tabelle mit Reaktionsvolumen und Konzentrationen anfertigen, um einen Überblick über die verschiedenen Bestandteile der Reaktion, die man braucht, einschließlich der Kontrollen, zu behalten. Eine typische Reaktion sollte die folgenden Komponenten enthalten: 5µl eines 10X Reaktionspuffers, 4µl von 25mM MgCl2, 1µl von 10mM dNTPs, 2µl des 50 ng/µl Vorwärts- und Rückwärtsprimers, und 0.3µl einer 5U/µl Taq Polymerase. Außerdem sollte man genug Template-DNA hinzugeben, um 100 ng in der Reaktion zu erreichen. Die meisten PCR Reaktionen werden bei einem 50 µl Volumen durchgeführt. Das heißt spezielles Wasser für die PCR Reaktion muss hinzugefügt werden, um ein Endvolumen von 50µl zu erreichen.
Wenn die Reaktion auf dem Papier geplant wurde, kann man die Reagenzien auf Eis zusammenstellen.
Danach gibt man die Reagenzien in PCR-Reaktionsgefäße. Zuerst gibt man das Wasser hinzu, dann die Template-DNA, die Primer, den Puffer, das Magnesiumchlorid, die dNTPs und zu letzte die Taq Polymerase. Danach mischt man die Reaktion gründlich.
Wenn die Reaktion fertig angesetzt ist, platziert man sie in den Thermocycler und startet das PCR-Programm. Nur kurz erwähnt: die Maschine besteht aus einem Thermoblock, wo die PCR-Reaktionsgefäße oder die Platte eingesetzt werden und wo sie den genauen Temperaturänderungen ausgesetzt sind. Außerdem gibt es eine beheizte Abdeckung, durch welche Kondensation vermieden wird, sodass keine Probe verloren geht, und ein Display, mit dem man die PCR Temperaturen und Zeitdauern programmiert. Man sollte das Programm immer schon vor dem Ansetzen der PCR Reaktion programmiert haben.
Nachdem der Thermocycler fertig ist, nimmt man die Reaktionen heraus und sieht sich das PCR Produkt mittels Gel-Elektrophorese an. Wenn das PCR erfolgreich war, sollte man ein Amplikon auf der richtigen Basenpaargröße sehen.
Nun geben wir einige nützliche Hinweise für ein erfolgreiches PCR Experiment. Wenn man versucht, das selbe PCR-Produkt von verschiedenen Template-DNAs zu erhalten, hat man normalerweise viele Reaktionen anzusetzen. Dabei kann es nützlich sein einen Mastermix vorzubereiten. Der PCR-Mastermix ist im Prinzip eine Mischung von großem Volumen, die alle Reagenzien enthält, die gleich für die verschiedenen Proben sind, und dann in verschiedene PCR-Reaktionsgefäße aufgeteilt wird.
Die meisten PCR Reaktionen fangen mit einem ersten Denaturierungsschritt an, der normalerweise bei 95°C für 1-9 Minuten stattfindet. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Template-DNA als Einzelstrang für den ersten Amplifikationszyklus bereit steht.
Oft kann es vorteilhaft sein eine Laborbank speziell für PCR zu benutzen um eine Reaktion anzusetzen, speziell dann wenn das Risiko einer Kontamination hoch ist. Um zu schauen ob eine Probe kontaminiert ist, ist es wichtig eine Negativkontrolle ohne Template-DNA anzusetzen, von welcher kein PCR-Produkt auf dem DNA-Gel zu sehen sein sollte.
Das PCR muss oftmals durch das Einstellen der Temperaturen, der Magnesiumchloridkonzentration, oder durch neue Primer, optimiert werden. Wenn die Reaktion erstmal funktioniert, ist es außerdem eine gute Idee eine Kontroll-DNA anzusetzen, von welcher man weiß, dass ein Produkt entsteht.
Es existieren viele verschiedenen Anwendungen des PCRs für verschiedene Zwecke.
Bei einer Variation des PCR, dem sogenannten „Hotstart“-PCR, wird die Polymerase der Reaktion bis nach dem ersten Denaturierungsschritt vorenthalten. Dadurch wird nicht-spezifische Amplifizierung unterbunden, die vor der Reaktion auftreten kann.
Ein PCR kann auch modifiziert werden, damit man mehrere DNA Sequenzen gleichzeitig amplifizieren kann. Hierfür verwendet man verschiedene Primer in der gleichen PCR Reaktion, was auch Multiplex-PCR genannt wird.
In Verbinding mit fluoreszenten Oligonukleotidproben kann das PCR eine Technik sein, mit der man die absoluten oder relativen Level der Genexpression messen kann, oder wieviel mRNA von einem bestimmten Gen oder einer Gruppe von Genen produziert wird. Diese Methode nennt man qPCR.
Das PCR kann auch benutzt werden, um die Anwesenheit einer speziellen DNA Sequenz in einem Organismus zu bestimmen. Dieses Verfahren wird auch als Genotypisierung bezeichnet. Zum Beispiel kann die Genotypisierung benutzt werden, um die Echtheit von Fischproben zu bestimmen. Dafür stellt man fest, ob eine speziesspezifische Sequenz in der Probe enthalten ist. Die Genotypisierung wird auch in der forensischen Analyse benutzt, um zu bestimmen, ob DNA an einem Tatort mit der DNA eines Verdächtigen übereinstimmt.
Das war die Einführung in das PCR von JoVE. In diesem Video haben wir uns angeschaut was ein PCR ist und wie es funktioniert, welche Komponenten man für das PCR benötigt, durch welchen Mechanismus das PCR DNA amplifizieren kann, und welche verschiedenen Anwendungen diese nützliche Methode hat. Danke für eure Aufmerksamkeit.
