Die Transformation von Bakterien ist ein natürlich auftretender Prozess, bei dem Bakterien Fremd-DNA aufnehmen und dann amplifizieren oder klonieren. Dieser Prozess kann im Labor künstlich durch die Anwendung eines elektrischen Feldes erzeugt werden. Durch einen Hochspannungs-Puls werden Poren in der bakteriellen Zellmembran erzeugt, durch welche die Plasmid-DNA eingeschleust wird. Diese Methode wird Elektroporation genannt. Das folgende Video beschreibt die Grundlagen der Elektroporation, und führt sowohl eine Schritt-für-Schritt Anleitung, als auch einige Anwendungen, vor.
Bevor wir über die Elektroporation sprechen, müssen wir verstehen welche Art von DNA man für diese Experimente verwenden kann: das Plasmid. Ein Plasmid ist ein kleines, ringförmiges, extrachromosomales Stück DNA, das als Vektor, also als Träger einer speziellen DNA Sequenz, fungiert.
Unabhängig davon ob diese Sequenz das Gen für ein fluoreszierendes Proteins einer Qualle oder ein Enzym von Pflanzen ist, wird es in eine Region, die multiple Klonierungsstelle (oder MCS) genannt wird, eingefügt. Diese Region enthält spezielle Sequenzen, die von Restriktionsendonukleasen oder Restriktionsenzymen, geschnitten werden. Die selben Restriktionsenzyme können auch benutzt werden, um die Zielsequenz zu schneiden, so dass die Enden komplementär zu den geschnittenen Enden des Plasmids sind.
Plasmide enthalten außerdem einen Replikationsursprung (abgekürzt ORI), der den Punkt angibt, bei dem die Replikation beginnt. Bei Transformationen ist das Antibiotikaresistenz-Gen von wichtiger Bedeutung. Wie der Name schon sagt, ermöglicht dieses Gen den Bakterien ein Enzym zu produzieren, welches das Antibiotikum neutralisiert. Dadurch können die Bakterien in einem Antibiotikum-haltigen Medium überleben.
Bei der Elektroporation wird ein spezielles Gerät benutzt, das Elektroporator genannt wird. Normalerweise werden die Zellen in eine Elektroporationsküvette plaziert, welche Elektroden auf jeder Seite hat und elektrisch mit der Maschine verbunden ist, wenn die Küvette in die Maschine plaziert worden ist.
Bakterielle Zellen, die mit DNA vermischt sind, werden in eine Küvette pipettiert. Dann wird ein 1000–10000 V pro Zentimeter starkes elektrisches Feld für ein paar Millisekunden erzeugt. Das führt zu einer Spannungsdifferenz von 0.5–1 V über die Membran. Es wird angenommen, dass diese Spannungsdifferenz eine Reorganisation der Phospholipiddoppelschicht der Membran bewirkt, so dass sich Poren bilden. Dabei können DNA-Plasmide die Membran passieren. Wenn das Pulsieren abgeschlossen ist, repariert sich die Lipiddoppelschicht von selbst.
Wenn das Plasmid aufgenommen wurde, können die Bakterien auf Agarplatten mit antibiotischem Medium wachsen.
Nun das wir uns mit Plasmiden und dem Mechanismus der Elektroporation beschäftigt haben, schauen wir uns das Verfahren genauer an.
Zellen, die DNA einfach aufnehmen können, nennt man kompetente Zellen. Die für die Elektroporation am häufigsten verwendeten Bakterien in der molekularbiologischen Forschung sind E. Coli, also die prokaryotischen Bakterien, die auch in deinem Darm wohnhaft sind. E.coli, die für die Elektroporation vorbereitet worden sind, werden auch elektrokompetente Zellen genannt.
Wie immer beim Arbeiten mit Bakterien sollte man sicherstellen, dass die Arbeitsfläche so sauber wie möglich ist.
Das Arbeiten mit Bakterien bedeutet auch, dass man mit aseptischer Vorgehensweise arbeitet. Das bedeutet, dass man einen Bunsenbrenner benutzt, um Instrumente zu sterilisieren, und um einen Konvektionsstrom zu erzeugen, welcher Schwebstoffe von der Arbeitsfläche fernhält.
Direkt vor der Elektroporation sollte man das Medium auf Zimmertemperatur und die Agarplatten mit Antibiotikum auf 37C erwärmen. Die Küvetten für die Elektroporation werden auf Eis gekühlt.
Jetzt taut man die gewaschenen elektrokompetenten Zellen auf Eis auf.
Nun gibt man 1-5 L eines 1ng/L kalten, salzfreien Plasmids zu den Zellen hinzu, mischt diese sanft, und pipettiert die Mischung in die kalte Küvette. Dabei stellt man sicher, dass keine Luftblasen entstanden sind.
Nun stellt man die Spannung und die Stärke des elektrischen Feldes auf die für die Zellen richtigen Werte. Hier kann man sehen wie ein Elektroporator auf 1700 Volt gestellt wird, was zu einer Feldstärke von 17 kV/cm führt.
Jetzt wischt man die Außenseite der Küvette trocken und platziert diese in den Elektroporator. Man pulsiert die Zellen bis man einen Piep-Ton hört.
Ein nicht erfolgreiches Pulsieren führt zu einer elektrische Entladung, welche man als sichtbaren Funken und als hörbares Geräusch wahrnimmt. Diese Entladung, die auch als “arcing” bezeichnet wird, kann vorkommen wenn zu viel Salz in den kompetenten Zellen oder der DNA vorhanden ist.
Ob die Elektroporation erfolgreich war, kann man von der Zeitkonstante, also der Dauer des Spannungszerfalls nach dem Puls, ableiten. Wenn Salz in der Elektroporation enhalten ist, ist die Elektroporationslösung sehr leitfähig und der Zerfall passiert sehr schnell und führt zu der Entladung, bei der viele Zellen sterben. Gute Zeitkonstanten für Bakterien sind zwischen 5-10 Millisekunden.
Direkt nach dem Puls entnimmt man die Küvette und gibt 1 ml Medium direkt zu den Zellen. Das Medium mit den Zellen wird in ein Reaktionsgefäß transferiert und für 1 Stunde bei 37C unter Schnütteln inkubiert, so dass sich die Zellen erholen.
Mit aseptischer Arbeitsweise gibt man dann 20-200 μL der Zellen auf eine Agarplatte mit Antibiotikum. Die Platten werden umgedreht, also mit dem Agar oben, über Nacht bei 37C inkubiert, so dass die Kondensation nicht auf die
Bakterien tropft.
Bakterien, die mit dem Plasmid transformiert worden sind, bilden Kolonien. Nun zählt man die Kolonien, um die Transformationseffizienz zu berechnen. Dafür teilt man die Zahl der erfolgreich transformierten Zellen durch die Menge an DNA, die man aufgetragen hat.
Der Agar und das Medium, welche die Nährstoffe für die Bakterien bereitstellen, sollten vorbereitet und durch Autoklavieren sterilisiert werden. Das flüssige Medium muss vor der Benutzung auf Zimmertemperatur abgekühlt sein. Auch der Agar sollte auf 50-55˚C abgekühlt werden, so dass man das Antibiotikum hinzufügen kann bevor die Agarplatten hergestellt werden. Die Platten müssen dann auf Zimmertemperatur abgekühlt werden, damit sie fest werden.
Da die Bakterien, die man für die Transformation benutzt, in dem Gefrierschrank gelagert werden, muss man sie erst auf Eis auftauen und dann ohne Antibiotikum über Nacht bei 37˚C auf einer Agarplatte wachsen lassen.
Mit aseptischer Vorgehensweise wählt man eine bakterielle Kolonie aus und vervielfältigt diese in einer größeren 500 mL Kultur über Nacht bei 37C in einem schüttelnden Inkubator.
Während sich die Zellen vermehren, bereitet man einen Liter destilliertes Wasser und eine 10% Glycerin Lösung in Wasser (Volumenverhältnis) vor. Die Lösung wird dann autoklaviert und bei 4˚C abgekühlt.
Messungen der Absorbanz werden benutzt, um zu bestimmen wann die Bakterien in der Mitte der logarithmischen Phase der Wachstumskurve sind, in welcher sie einfach DNA aufnehmen können. Wenn die Zellen in dieser Phase sind, werden sie für den restlichen Teil dieser Methode auf Eis gestellt.
Danach werden die bakteriellen Zellen in zwei große Zentrifugenröhren gefüllt und bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und das Pellet wird in 100 ml sterilem Wasser resuspendiert. Dieser Schritt wird mindestens einmal wiederholt, damit das Salz entfernt wird, welches die Elektroporation stark beeinflussen kann.
Jetzt wäscht man die Bakterien zwei weitere Male mit 50 ml der 10% Glycerin Lösung in Wasser. Zum Schluss resuspendiert man die Bakterien in der gleichen Lösung.
Nun verteilt man 50 μl der Bakterien in verschiedene Eppendorf-Gefäße und lagert diese bis zur Elektroporation auf Eis. Für die längerfristige Lagerung werden sie schockgefroren und bei -80˚C gelagert.
Wie ihr sehen werdet, hat die Elektroporation viele Anwendungen.
Eine Alternative zu der Elektroporation ist die Hitzeschock-Transformation, wobei die Bakterien Kalziumchlorid und Hitze ausgesetzt werden, damit sie die DNA aufnehmen.
Im allgemeinen ist die Hitzeschock-Methode sanfter für die Bakterien als die Elektroporation. Außerdem wird keine niedrige Salzkonzentration benötigt. Ligations-Reaktionen, also Reaktionen bei denen ein Ziel-Gen in ein Plasmid eingefügt wird, kann man direkt für Hitzeschock-Transformationen benutzen. Die Hitzeschock-Transformation ist billiger als die Elektroporation, denn man braucht keine teuren Instrumente oder Küvetten. Auf der anderen Seite führt die Hitzeschock-Transformation zu einer niedrigeren Transformationseffizienz und sie dauert länger. Außerdem ist sie beschränkt auf Bakterien, Hefe und Pflanzenprotoplasten, wohingegen die Elektroporation auch für Säugerzellen angewendet werden kann.
Hier sieht man wie embryonische Fibroblasten der Maus in eine Elektroporationsküvette pipettiert werden. Nachdem die Elektroporation ausgeführt wurde, kann man die Elektroporationseffizienz durch die Messung des grün fluoreszierenden Porteins bestimmen, welches in dem Plasmid kodiert ist. Die Transformation von Säugerzellen nennt man auch Transfektion. Typischerweise benötigt man eine geringere Feldstärke und höhere Zeitkonstante als in bakteriellen Zellen.
Die Elektroporation kann auch bei vollständigen Tieren angewendet werden, wie zum Beispiel hier bei dem sich entwickelnden Hühnerembryo. Die Plasmid DNA wird in das Gehirn des sich entwickelnden Huhns injiziert. Danach wird eine Elektroporationsprobe benutzt, um ein elektrisches Feld in dem Gehirngewebe zu erzeugen. Nach ein oder zwei Tagen kann man sich die grün oder rot fluoreszierenden Proteine - kodiert durch die Plasmide und hergestellt in den Neuronen - anschauen und die strukturellen Veränderungen im sich entwickelnden Huhn Gehirn beobachten.
Das war die Einführung in die Transformation von Bakterien mittles Elektroporation von JoVE. Dieses Video hat Plasmide als die am häufigsten verwendete DNA behandelt. Außerdem haben wir über die biophysikalischen Mechanismen gesprochen, die in einer Elektroporation passieren, und wir haben ein allgemeines Verfahren gezeigt, wie man eine Elektroporation durchführt, und wie man die Elektroporation in Säugerzellen verwendet. Danke für eure Aufmerksamkeit.
