Unterschiede in vereinfachten 2D-In-vitro-Kulturen im Vergleich zu 3D-Gewebe-ähnlichen Umgebungen haben das Interesse an 3D-Systemen erhöht, um die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe darzustellen. Der Herstellungsprozess erfordert keine Einrichtungs- oder Photolithographietechniken. Das 3D-PDMS-Gerät enthält jedoch die notwendigen Vektoren für 3D-Anwendungen in physiologischer Umgebung.
Verwenden Sie für die mesofluidische Gerätevorbereitung ein geeignetes dreidimensionales computergestütztes Design-Softwareprogramm, um die Maske der Form für das Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Gerät zu entwerfen und die Form mit Stereo-Lithographiegeräten mit einem thermoresistenten Harz zu drucken. Wenn die Form fertig ist, mischen Sie grob drei Milliliter PDMS-Monomerlösung pro Form mit einem Härtungsmittel im Verhältnis 10 zu eins und verwenden Sie ein Vakuum, um die Mischung in einem Vakuum-Austrocknungsor für eine Stunde zu entgasen. Am Ende der Austrocknung verwenden Sie ein Stück Klebeband, um Staub von der Oberfläche der Form zu entfernen und die Form vorsichtig mit der entgasten PDMS-Lösung zu füllen.
Als nächstes härten Sie das PDMS bei 80 Grad Celsius für zwei Stunden aus, bevor Sie die Form bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Wenn die Form zur Berührung gekühlt wird, verwenden Sie eine Klinge, um die Grenze zwischen der Form und PDMS zu schneiden und das PDMS vorsichtig von der Form zu schälen. Trimmen Sie das PDMS, um einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckel zu montieren, und schlagen Sie ein Loch am Einlass.
Wischen Sie das Gerät mit schwachen Fussgeweben und 70 % Ethanol ab und bedecken Sie das Gerät mit einem neuen Klebeband, um große Staubpartikel zu entfernen. Dann autoklavieren Sie das PDMS-Gerät und decken Sie bei 121 Grad Celsius für acht Minuten nass und 15 Minuten trocken und behandeln Sie die untere Oberfläche des PDMS-Teils und Deckenrutsche mit einer Corona-Entladungspistole für fünf Minuten in einer Gewebekulturhaube, bevor sie die Stücke miteinander verkleben. Um das Gerät zu laden, setzen Sie zuerst die Zellen von Interesse in einem geeigneten Volumen von Wachstumsmedium ergänzt mit 1%Penicillin und Streptomycin und 1%insulin-transferrin-selen-x.
Als nächstes 50 Mikroliter der Brustdrüsenzellsuspension mit 425 Mikroliterfrischung neutralisierter Kollagenlösung mischen und eine 200-Mikroliter-Pipette mit der Kollagenzellsuspension füllen. Injizieren Sie die Suspension durch den Einlass in das PDMS-Gerät, bis die gesamte Kammer gefüllt ist, und legen Sie das Gerät bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für eine Stunde, um eine Gelation zu induzieren, bevor Sie die Reservoirs auf beiden Seiten mit Wachstumsmedium füllen und das Gerät bis zur konfokalen Bildgebung an den Inkubator zurückgeben. Für die 3D-Bildgebung und Quantifizierung installieren Sie eine live zellbildende Kulturkammer auf einem konfokalen Mikroskop und stellen Sie die Temperatur und das Kohlendioxid auf 37 Grad Celsius bzw. 5 % vor.
Fügen Sie Wasser in das Bildkammerreservoir, um die Kammer zu befeuchten, legen Sie bei Bedarf Feuchttücher in die Kammer und legen Sie das PDMS-Gerät in die Kammer. Fügen Sie einem der Reservoirs einen epidermalen Wachstumsfaktor als Quelle des Faktors in der Gradientenbildung hinzu, sodass das andere Reservoir als Senke für die Entwicklung der räumlich abgestuften epidermalen Wachstumsfaktorverteilung dienen soll. Legen Sie dann den Bereich des Z-Stacks fest, der das Volumen der von Interesse interessierten Organoide abdeckt, und starten Sie die Bildgebung.
Verwenden Sie am Ende des Experiments ein geeignetes Bildanalyseprogramm, um die Länge und den Winkel der Zweige zu messen, die sich von den Organoiden oder der Migration einzelner Zellen erstrecken. Sowohl in Silico- als auch in In-vitro-Tests ergaben sich die Bildung eines stabilen linearen epidermalen Wachstumsfaktorgradienten im gesamten Zellkulturbereich, der etwa zwei Tage ohne Auffüllung der Quell- oder Senkenreservoirs dauert, was darauf hindeutet, dass der epidermale Wachstumsfaktor, ein 6,4 Kilodalton-Protein, einen stabilen diffusionsbasierten Gradienten innerhalb eines Kollagengels bilden kann, das über einen relativ kurzen Zeitraum hergestellt wurde. Mamma-Organoide bilden mehrere Zweige in Gegenwart eines räumlich gleichmäßigen 2,5 Nanomolar epidermalen Wachstumsfaktors ohne Richtungsverzerrung über drei Tage, wenn der epidermale Wachstumsfaktor im linearen Gradienten mit 0,5 Nanomolaren pro Milliliter addiert wird.
Die Verzweigungsformation weist jedoch eine signifikante Richtungsverzerrung auf. Bemerkenswert ist, dass die Zugabe von Spaltknoteninhibitoren die Fähigkeit der Organoide unterdrückt, auf den Gradienten zu reagieren. Der pH-Wert der Kollagenlösung ist entscheidend für die Gelation und Zelllebensfähigkeit.
Wenn das Kollagen vor dem Mischen nicht neutralisiert wird, ist die Zelllebensfähigkeit gering. Diese Methode kann erweitert werden, um eine realistischere Gewebemodellierung zu ermöglichen und könnte die Vaskuläre Netzwerkbildung aus einzelnen Zellen innerhalb des Gels aufnehmen.
