Dieses Protokoll verwendet eine einfache Methode zur Verbesserung der Zuverlässigkeit eines 3D-Zellkulturmodells ohne den Einsatz von Spezialgeräten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir das wiederholbare 3D-Kulturexperiment durchführen können, indem wir den anfänglichen Kulturzustand innerhalb des kubischen Geräts steuern. Nach der Vorbereitung eines fünf mal fünf Millimeter großen polykarbonaten kubischen Rahmens legen Sie den Rahmen auf einen vorgekühlten Schlitten und eine Eisbox und verwenden Sie eine Pipette, um 12 Mikroliter vorgewärmte 1,5%Agarose von der Oberseite des kubischen Rahmens zur Bodenoberfläche hinzuzufügen.
Die Agarose verteilen, um eine flache Oberfläche zu erhalten und das Polymer aushärten zu lassen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Rahmen an den Rand des Glases zu schieben und den Rahmen so zu drehen, dass die offene Seite nach unten gerichtet ist, bevor der Rahmen wieder auf die Folie gebracht wird. Nachdem Die nächsten beiden Oberflächen des Rahmens mit mehr Agarose gefüllt wurden, wie gerade gezeigt, lassen Sie die Agarose in einen Behälter von einer offenen Fläche fallen, um eine Agarosewand auf der vierten und fünften Seite zu bilden.
Um eine anfängliche Zellclusterform einzurichten, injizieren Sie eine geeignete extrazelluläre Matrix für die von Interesse sindde Zellkultur in den Hybrid-Gelwürfelkulturraum und legen Sie eine hergestellte Mikroform auf den Würfel fest. Dann legen Sie den Würfel in einem Kohlendioxid-Inkubator für 25 Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn die extrazelluläre Matrix ausgehärtet ist, heben Sie die Mikroform vorsichtig heraus, damit sich die Matrix nicht verschlechtert.
Eine Tasche in der gewünschten Formform wird in der extrazellulären Matrix gefertigt. Um die Zellen zu laden, konzentrieren Sie die experimentelle Zellsuspension nach Zentrifugierung in das entsprechende experimentelle Zellkulturmedium und injizieren Sie die Zellen in die Tasche innerhalb der extrazellulären Matrix. Legen Sie den Würfel für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in den Kohlendioxid-Inkubator, damit die Zellen in die extrazelluläre Matrixtasche fallen und den durch die Mikroform geschaffenen Raum füllen.
Am Ende der Inkubation den Würfel in einen Brunnen einer 24-Well-Platte geben und 100 Mikroliter des entsprechenden Zellkulturmediums in den Brunnen geben. Injizieren Sie zusätzliche extrazelluläre Matrix, um die Tasche zu schließen und den Würfel für 25 Minuten in den Inkubator zurück. Wenn die extrazelluläre Matrix ausgehärtet wird, fallen etwa 10 Mikroliter von 20 Grad Celsius Agarose auf die Oberseite des Würfels, um die Oberfläche zu schließen und den Tropfen für 10 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius zu heilen.
Dann bedecken Sie den gesamten Würfel mit frischem Medium, um den osmotischen Druck zu fördern, um die Übertragung der Nahrung auf die Zellen innerhalb des Würfels zu erleichtern. Legen Sie die Platte für die nichtinvasive 3D-Formerkennung durch multidirektionale Beobachtung auf eine Mikroskopstufe und erhalten Sie Bilder von jeder Seite des Würfels durch helle Feld- oder Phasenkontrastmikroskopie, wobei Sie eine Pinzette verwenden, um den Würfeldienst zu drehen, der zwischen den Aufnahmen abgebildet werden soll. Für die immunfluoreszierende Bildgebung durch multidirektionale Beobachtung, zuerst den Überstand aus dem Brunnen, der den Würfel enthält, und fixieren Sie den Würfel in 4%Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
Am Ende der Fixierung den Würfel zweimal mit PBS für 10 Minuten pro Wäsche waschen. Impermeabilisieren Sie den Würfel mit 0,5%Triton x-100 und PBS für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Als nächstes waschen Sie den Würfel dreimal in PBS für 10 Minuten pro Wäsche, bevor Sie jede unspezifische Bindung mit Ziegenserum und Immunfluoreszenzpuffer für 60 Minuten bei Raumtemperatur blockieren.
Dann färben Sie die Zellen mit dem entsprechenden primären Antikörper von Interesse nach Standard-Antikörper-Färbung Protokolle. Dann stellen Sie alle sechs Seiten des Würfels auf einem Laser- oder Fluoreszenzmikroskop, wie gerade gezeigt. In diesem repräsentativen Experiment demonstriert die multidirektionale Bildgebung von Hybrid-Gelwürfeln, die mit normalen menschlichen Bronchialepithelzellen kultiviert werden, die Erzeugung einer anfänglichen zylindrischen oder prismenförmigen Zellkultur durch Phasenkontrast und immunfluoreszierende Bildgebung der Kulturen.
Hier bei der Immunfärbung normaler menschlicher Epithelzellen, die zunächst im Hybrid-Gelwürfel zu einer zylindrischen Form gesteuert werden, wird nach der Erzeugung des Bronchialbaumes gezeigt. Die Zweige zeigen die senkrechte zur zylindrischen Achse, wie sich die multidimensionale Bildgebung zeigt. Es ist wichtig, eine hohe Dichte von Zellen in die extrazelluläre Matrixtasche zu injizieren, da eine niedrige Dichte von Zellen zu einer Verschlechterung dieser Zellqualität nach der Inkubation führen kann.
Dieses Methodenmuster ist die wiederholbare Bildung eines 3D-Zellmusters mit einer quantitativen Messung durch multidirektionale Bildgebung, um den Mechanismus der Tellerentwicklung zu untersuchen.
