Diese Arbeit wurde von der University of Calgary unter einem neuen Ermittler Gründungszuschuss Dr. Ungrin finanziert.

HINWEIS: Die Mikrotiterplatten werden in verschiedenen Formaten, je nach den gewünschten Ergebnissen. Spezifikationen sowie ungefähre Leitlinien für die minimale und maximale Anzahl von Zellen, die mit jedem Format verwendet werden soll, sind in Tabelle 1 gezeigt. Die kleineren Kavitäten verjüngen sich zu einer scharfen Spitze, und somit gibt es keine Größenbeschränkung niedriger, wenngleich Variabilität zwischen den Sphäroiden wird bei kleineren Größen mehr an Bedeutung. Routinemäßige Produktion von Sphäroiden von durchschnittlich weniger als 20 Zellen je 8 ist unkompliziert. Die größere Mikrowell-Größe ist nicht vollständig verjüngt, versucht daher zu Sphäroiden aus einer kleinen Anzahl von Zellen bilden können, in mehrere kleinere Kügelchen in jeder Vertiefung führen. Durch geringe Unterschiede in der Oberflächeneigenschaften, die Vorbereitung mit der Tensid-Lösung (Schritt 1.2) ist nicht optional, wenn Sie AggreWell 400Ex Platten. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung von AggreWell 400 Platten auf Basis - für andere Formate Nachteileult Tabelle 1. Die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung beladen ist, wird durch Multiplizieren der Anzahl der Vertiefungen und durch die Anzahl der Zellen, die für jeden Cluster-Sphäroid enthält bestimmt. Zum Beispiel, um Sphäroide von 1000 Zellen pro Stück zu erzeugen, muß jede Vertiefung (1.200 mal 1.000 Zellen Sphäroide jeweils =) 1,2 x 10 6 Zellen geladen werden. Gegeben, dass die Zellen in einem Volumen von 0,4 ml eingelegt werden muß Zelldichte berechnet werden. So zum Beispiel von Sphäroiden von jeweils 1000 Zellen gebildet wird, 1,2 x 10 6 Zellen in 0,4 ml entspricht einer Dichte von 3 × 10 6 Zellen pro ml enthält. 1. Vorbereiten Mikroschälchen in Zellen erhalten <ol><li> Microwell Platten sind steril, wie vorgesehen, und sollte nur aus der Verpackung in einer sterilen Umgebung wie einem Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank entfernt werden. Sterilität sollte in der gesamten Protokoll beibehalten werden. Die Sterilität beeinträchtigt werden, werden die Vertiefungen mit 70% Ethanol in Wasser unter Verwendung der erneut sterilisiertfolgenden optionalen Schritte. <ol><li> 0,5 ml 70% igem Ethanol zu jeder ungenutzte gut. Einige Mikrovertiefungen werden Lufteinschlüsse, obwohl dies kann durch Zugabe von Flüssigkeit auf der einen Seite, und ermöglicht es, über die Oberfläche verteilt, anstatt abzufallen senkrecht auf die Oberfläche reduziert werden. Deckel wieder. </li><li> Während Ethanoldampf sollte schnell alle Blasen durchdringen, wenn es eine große Anzahl kann es wünschenswert sein, sie zu entfernen. Zentrifuge für 2 min bei 2.000 x g. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Rotor korrekt mit dieser Geschwindigkeit ausgeglichen. </li><li> Mit einem Low-Vergrößerung inverse Mikroskop überprüfen Blasen aus den Kavitäten entfernt. </li><li> Inkubation für 5 min bei geschlossenem Deckel bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Ethanol. Platte kann nun mit sterilem Wasser oder PBS für die sofortige Verwendung gewaschen werden, oder für die Lagerung an der Luft getrocknet. </li></ol></li><li> Um zu gewährleisten, dass die Zellen nicht mit der Oberfläche wechselwirken Mikrotiterplatten, kann es unter Verwendung eines Tensids hergestellt werden. Im allgemeinen ist esempfiehlt sich, diesen Schritt selbst durchführen und anschließend vergleichen Sphäroiden mit und ohne Tensid-beschichtete Kavitäten erzeugt. <ol><li> In 0,5 ml Spüllösung in jede Vertiefung. Einige Mikrovertiefungen werden Lufteinschlüsse, obwohl dies kann durch Zugabe von Flüssigkeit auf der einen Seite, und ermöglicht es, über die Oberfläche verteilt, anstatt abzufallen senkrecht auf die Oberfläche reduziert werden. Deckel wieder. </li><li> Zentrifugieren für 2 min bei 2.000 × g, um Blasen zu entfernen. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Rotor korrekt mit dieser Geschwindigkeit ausgeglichen. </li><li> Mit einem Low-Vergrößerung inverse Mikroskop überprüfen Blasen aus den Kavitäten entfernt. </li><li> Inkubation für mindestens dreißig Minuten mit dem Deckel auf bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. Platten können bei vier Grad mit der Tensid-Lösung in die Vertiefungen erst benötigt, wenn ordnungsgemäß verschlossen austrocknen gespeichert werden. </li><li> Waschen Sie Platte mit sterilem Wasser oder PBS unmittelbar vor der Verwendung. Platten nicht zulassenAustrocknen nach der Beschichtung. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereiten Cells HINWEIS: Die Details der Zellpräparation wird etwas mit der spezifischen Zelltyp untersucht variieren. Allerdings haben wir diese Bedingungen beobachtet wirksam mit einer breiten Palette von Zellen, einschließlich der Linien hier diskutiert sowie humanen und murinen embryonalen Stammzellen (ESC), der Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), Fibroblasten, vermeintliche primitive Endoderm sein, und Stromazellen. Andere Gruppen haben dieses System erfolgreich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Chondrogenese aus mesenchymalen Stammzellen 9 eingesetzt, standardisierte Generation von neuralen Vorläuferzellen aus pluripotenten Stammzellen 10, analysiert toxikologischen in Hepatozyten 11 und Beurteilung der Rückenmarksregeneration in 12 Salamander. Das spezifische Protokoll für die Arbeit mit HT29-Zellen wird hier gezeigt. <ol><li> Beginnen Sie mit einem T75-Kolben von HT29 Zellen in DMEM+ 10% FBS </li><li> Saugen Wachstumsmedium von der Flasche, und 3 ml Trypsin. </li><li> Zellen 5 min bei 37 ° C. </li><li> Stoppen Trypsin Verdauung durch Zugabe von 3 ml Wachstumsmedium. Einen aliquoten zur Zellzählung und übertragen Sie den Rest in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 200 x g. </li><li> Während der Zentrifugation im Gange ist, zählen Zellen. </li><li> Saugen Trypsin / Medium-Gemisch und ersetzen mit frischem Wachstumsmedium, das Volumen durch die erforderliche Zelldichte wie oben berechnet bestimmt. </li><li> (Optional) Führen Sie die Zellsuspension durch ein Sieb, um eventuelle Klumpen zu entfernen. HINWEIS: Zellerntebedingungen wird etwas zwischen den Zeilen variieren. Wenn ein Protokoll für die Dissoziation zB Passagieren der Zellen von Interesse ist, sollte diese als Ausgangspunkt verwendet werden. Bei empfindlichen Zelllinien Verwendung von Trypsin kann in übermäßigen Zelltod führen. In diesen Fällen haben wir gute Ergebnisse beobachtet mit TrypLE als Alternative dissociatiReagenz auf acht. Wenn die Zellen während der Dissoziation verklumpten und verlieren die Lebensfähigkeit kann die Zugabe von DNAse der Enzymlösung dieses Problem zu beheben. Reduzierung Dissoziation Zeiten und Einsatz eines Verreiben Schritt zu brechen Zellklumpen kann auch erhöhen Rentabilität. </li></ol> 3. Sphäroidbildung HINWEIS: Sphäroide können in einer Vielzahl von Formulierungen Medium erzeugt werden, aber die ersten Versuche sind nach dem Medium, in dem die Zellen kultiviert wurden, um Folgen der Übergang zu einem 3-dimensionalen Kultursystem von Folgen der Änderung der Zusammensetzung des Mediums unterscheiden, durchgeführt werden. <ol><li> Hinzufügen von 0,4 ml Wachstumsmedium in jede Vertiefung. </li><li> Zentrifugieren für 2 min bei 2.000 × g, um Blasen zu entfernen. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Rotor korrekt mit dieser Geschwindigkeit vor der Zentrifugation ausgewogen. </li><li> Mit einem Low-Vergrößerung inverse Mikroskop überprüfen Blasen aus den Kavitäten entfernt. </li><li> In 0,4 mlZellsuspension mit der erforderlichen Dichte (oben berechnet). Vorsichtig mischen durch Pipettieren von oben und unten, ohne dabei Luftblasen in die Vertiefungen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über den gut verteilt, um eine einheitliche Kügelchen zu erhalten. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 200 x g. Wenn die Platte nicht selbst Niveau während der Zentrifugation kann Konvektionsströme dieses Ergebnis in ungleichmäßige Verteilung der Zellen in die Vertiefungen entstehen. Daher sollte die Platte nach innen und gegen die andere Platte ausgeglichen werden, so dass das Gewicht gleichmäßig auf beide Seiten der Trägerplatte verteilt sind. </li></ol> HINWEIS: Wenn Hinweise auf unebenen Zellverteilung zu sehen ist, kann es notwendig sein, eine kleine Menge der Schmierung der Drehpunkte auf der Platte Träger gelten - konsultieren Zentrifugenhersteller für Anweisungen. HINWEIS: Sobald die Zellen in die Vertiefungen zentrifugiert wurden, sind sie einigermaßen Widerstandtig, Auswaschen von geringfügigen Bewegungen der Platte. Abrupte Bewegungen, die in Schwappen des Mediums führen sollte vermieden werden, aber Transfer von der Platte aus der Zentrifuge an Mikroskop oder Inkubator sollte nicht in signifikanten Zell Verschiebung führen. <ol start="6"><li> Mit einem inversen Mikroskop sicher, dass Zellen in die Kavitäten gruppierten, und dass sie gleichmäßig über die gut verteilt. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Mit einem inversen Mikroskop beobachten den Prozess der Sphäroid-Bildung. Einige Zelllinien kompakten Kügelchen innerhalb von 24 Stunden zu bilden, andere können länger dauern. Die Progression von Cluster in HT29-Zellen aggregieren, ist in Fig. 2 gezeigt. </li><li> Recover Sphäroiden aus den Kavitäten und Transfer zum Suspensionskultur durch vorsichtiges Strahlen sie mit einer Pipette. Alternativ halten Sphäroiden in situ mit Mediumwechsel 8 - die Dauer hängt von ihrer ursprünglichen Größe und Wachstumsrate, die define der Zeit, bis sie die Vertiefungen, in denen sie gebildet wurden hinauswachsen. <ol><li> Um mittel, ohne Sphäroiden, absaugen Medium am Rand des Brunnens mit einer Pasteurpipette ersetzen. Langsam bringen die Spitze nach unten, bis es beginnt, Flüssigkeit aus dem Meniskus zu ziehen, und folgen Sie den Meniskus nach unten, wie es fällt. Dann fügen Sie frisches Medium gegen die Wand und an der gleichen Stelle. Einige Sphäroide können verloren werden, wenn jedoch Medium abgesaugt und immer in derselben Position ersetzt wird, wird diese Zahl klein im Vergleich zu der großen Zahl im Bohrloch verbleiben. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr. Ungrin hat ein finanzielles Interesse an der Technologie AggreWell als Erfinder.

Wir haben ein System, bei dem eine große Anzahl von gleichförmigen Kügelchen können aus mehreren Zelllinien von verschiedenen Quellen erzeugt werden, hergestellt. Wir haben noch eine haftende Zelllinie, die nicht Sphäroiden unter diesen Bedingungen bilden nicht begegnen. Wir haben schon früher beobachtet Zellverlust in der Bevölkerung anfällig für Anoikis 5,8 jedoch bisher diese Frage nicht mit Tumorlinien entstanden. Das System ist beliebig skalierbar Oberfläche, mit dem Verhalten konsistent Mikrotiterplatte im 24-Well-und 6-Well-Format, sowie Prototypen Bioreaktoren mit je 50.000 Mikrovertiefungen, die derzeit entwickelt. Sphäroid Asymmetrie sollte ein Problem sein, kann die Inkubationszeit in Schritt 4.8, zwei oder drei Tage verlängert werden. Spheroids kann auch für einen Zeitraum nach der Extraktion aus den Vertiefungen, um die Symmetrie zu erhöhen inkubiert werden, aber in diesem Fall darauf zu achten, Kultur Dichten so gering, Sphäroiden in Kontakt miteinander zu halten wi, werdenll verschmelzen oft zu größeren Strukturen. Aus diesem Grund haben wir bisher Kulturen in den Vertiefungen, in denen die Aggregate gebildet wurden, wobei die Hauptbeschränkung wobei die Größe des Sphäroids gehalten. Dies wiederum ist eine Funktion sowohl der Wachstumsrate und der anfänglichen Größe 8, und wenn erweiterte Kultur innerhalb der Mikrotiterplatte soll, sollte diese im voraus berücksichtigt werden. Optionen, um übermäßiges Wachstum zu verhindern, sollte es dazu kommen, sind entweder beginnend mit kleiner Kügelchen, oder den Einsatz der größeren Vertiefungen der AggreWell 800 Platte. Sollte Sphäroiden nicht, in Kohärenz mit der Zeit zu erhöhen, kann eine mögliche Ursache sein Zelltod. Besonders in größeren Aggregaten hoch metabolisch aktiven Zellen können Massentransportbeschränkungen über die Lieferung von Sauerstoff und wichtigen Nährstoffen in einem nekrotischen Kerns 2 führen - und damit ein nicht-zusammenhängende Sphäroid kann einfach eine Folge der übermäßigen Zelltod sein. Alternativ Messungen der mechanischen Zusammenhaltsion von Sphäroiden wurden verwendet, um die interzelluläre Bindungskräfte zu bewerten, in Beziehung zu dem metastatischen Potential einer gegebenen Zelllinie 13. Es wäre interessant, die Beziehung zwischen Form und Sphäroid metastatische Potential zu untersuchen, vielleicht mit morphometrischen Parameter wie Rundheit und Umkreis, zum Flächenverhältnis. Zusätzlich zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften und morphometrische von Sphäroiden, Mikrovertiefungsanordnung in dem System ermöglicht die Großproduktion von gemischten Zusammensetzung Sphäroiden, bestehend aus Kombinationen von mehreren Zelltypen und / oder Biomaterialien 6,7. Die Tumorzellen in Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen wichtig sind, um das Verhalten von Tumoren genauer modellieren in vivo 14, so kann es von Interesse sein, Sphäroiden von Tumorzellen in Kombination mit Fibroblasten und Endothelzellen zu erzeugen, zum Beispiel. Mikropartikel verschiedener Biomaterialien können ebenfalls eingearbeitet werden, und kann beeinflussen spheroid Eigenschaften sowohl direkt durch ihre Wechselwirkungen mit Zellen 7,15 und auch als Reservoir für die kontrollierte Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen in das Innere des Sphäroids 16. Wenn es einen Besorgnis über Sterilität, zum Beispiel bei der Arbeit mit einer Mikrotiterplatte, in der einige Brunnen vorher benutzt worden, die einige Zeit im Brutschrank als Teil einer vorhergehenden Versuch verbracht haben kann, die Brunnen kann mit 70% Ethanol sterilisiert werden im Wasser. Sobald Sphäroide gebildet worden sind, können sie auch aus Restpersonen Zellen, indem die Suspension über eine Zelle Sieb abgetrennt werden. Einzelne Zellen werden durchlaufen, während die Sphäroide wird beibehalten. Wenn der Sphäroid vergießen potentiell metastatischen Zellen im Laufe der Kultur vermutet, kann es wünschenswert sein, diese Prozedur mehrmals durchführen zu können - zunächst auf rechtsfähige Zellen zu entfernen, und anschließend zu isolieren purified Populationen von Zellen durch den Sphäroiden gegeben.

Es gibt eine zunehmende Zahl von Hinweisen, dass Tumorzellen verhalten sich anders im dreidimensionalen Kulturen, als sie tun, wenn sie auf Kunststoff kultiviert, und das auf herkömmlichen Gewebekultur-Plattformen identifiziert Therapeutika Wirksamkeit verlieren, wenn zu einer physiologisch relevanten System 1 umgestellt. Es ist daher wünschenswert, das Verhalten der Krebszellen unter diesen Bedingungen zu untersuchen, sowohl, um Einblicke in die zugrunde liegenden Biologie zu gewinnen, und die Erfolgsrate des Übergangs neue therapeutische Mittel aus dem Screening-Anlage in die Klinik zu erhöhen. Ein nützliches Modellsystem mit einer langen Geschichte beschäftigt dreidimensionale Cluster von Krebszellen als Tumorsphäroide 1,2 bekannt. Idealerweise würde Techniken Sphäroidformation Produktion einer großen Zahl von gleichförmigen Kügelchen, deren Größe und Zusammensetzung des Experimentators gesteuert ermöglichen. Während Hanging-Drop-und Well-Platte nähert 3,4 sind in der Lage, einige dieser Wieder erfüllenAnforderungen, Durchsatz der Regel begrenzt ist, und die Erzeugung einer großen Anzahl von Sphäroiden wird eine arbeitsintensive Aufgabe. Wir haben vor kurzem ein System, um ähnliche Herausforderungen in der regenerativen Medizin zu lösen 5 entwickelt. Der Einsatz gezwungen Aggregation innerhalb einer Serie von dicht gepackten Mikrometermaßstab Brunnen (siehe Abbildung 1), ermöglicht dieser Ansatz die Erzeugung von Sphäroiden aus beliebigen Anzahl von Zellen, einschließlich Gemische von mehreren Zelltypen 6, sowie den Einbau von verschiedenen Biomaterialien 7. Tausende bis Hunderttausende oder mehr - - Sphäroide werden in großer Zahl gebildet und kann sofort entnommen oder in den Vertiefungen, in denen sie waren mit Mediumaustausch für mindestens eine 8 bis zwei (unveröffentlichte Beobachtung) gebildet Wochen aufrechterhalten werden. Dieses System ist daher gut zur Erzeugung einer großen Zahl von gleichmäßigen und reproduzierbaren Tumorsphäroide für die Beurteilung der effe geeignetctiveness von neuartigen Antitumor-Wirkstoffe oder biologische Grundlagenuntersuchungen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Tumorsphäroide werden zunehmend als wichtiger in vitro-Modell für das Verhalten von Tumorzellen in drei Dimensionen erfasst. Mehr als herkömmliche physiologisch relevanten haft-Blatt-Kulturen, sie genauer zu rekapitulieren, die Komplexität und in Echt Tumoren Wechselwirkungen. Um dieses Modell zu nutzen, um eine bessere Beurteilung der Tumorbiologie oder die Wirksamkeit von neuen therapeutischen Mittel, ist es notwendig, um Sphäroide reproduzierbar zu erzeugen, in einer kontrollierten Art und Weise und in großer Zahl sein. Die AggreWell System besteht aus einer hochdichten Anordnung von pyramidenförmigen Vertiefungen, in dem eine Suspension von einzelnen Zellen zentrifugiert. Die Nummern der Zellen Clustern am Boden jeder Vertiefung und die Anzahl und das Verhältnis der unterschiedlichen beteiligten Zelltypen hängen nur von den Eigenschaften der vom Experimentator Suspension eingeführt. So sind wir in der Lage, Tumorsphäroide beliebiger Größe und Zusammensetzung mit erzeugenSie benötigen, um die zugrunde liegende Technologie-Plattform ändern. Die Hunderte von Mikro pro Quadratzentimeter Fläche der Kultur wiederum sorgen dafür, dass extrem hohe Produktionsniveau kann über eine einfache, nonlabor intensiver Prozess erreicht werden. Wir erwarten daher, dass dieses Protokoll wird im Großen und Ganzen sinnvoll, Forscher in der Sphäroid Feld Tumor sein.

Sphäroide aus verschiedenen Tumorlinien unterschiedliche anatomische Herkunft leicht erzeugt und in Suspensionskultur gewonnen werden. Fig. 3 zeigt die einheitliche Größe Steuer erhältlich durch dieses Verfahren, mit sehr einheitlicher Sphäroid Populationen unter jeder Bedingung. Klar inter-line Unterschiede im Verhalten sind ebenfalls sichtbar, mit HT29-Darmkrebszellen und Speiseröhrenkrebs TE6 bildenden Zellen dicht gepackt Sphäroiden mit scharf definierten Grenzen, während LNCaP Prostata-Krebszellen führte zu weniger kohärent Sphäroiden mit unregelmäßigen Grenzen (siehe Beiträge zu möglichen Gründen ). Die stärkeren inneren Kräfte in den kohärenter Aggregate führte auch zu einem Zusammenbruch symmetrische Form auch noch in die Vertiefungen, in denen sie gebildet wurden, während die LNCaP Aggregate, insbesondere an der größeren Größe, sichtlich die quadratisch-pyramidale Geometrie der behalten Mikrovertiefungen. Die Beziehung zwischen Eingangs-Zellzahlen und der phys.<html> schen Größe der resultierenden Sphäroid wird von einer Anzahl von Variablen abhängen. Theoretische Volumen, bezogen auf das Produkt aus dem Volumen pro Zelle und der Anzahl von Zellen verwendet werden, können durch Zellverlust, der wiederum Verlust von Zellen in der Einzelzellsuspension Stufe sowie Verlust von zu kleinen Aggregaten aufgrund umfassen reduziert werden Aufgrund der unzureichenden Anzahl von Nachbarn und übermäßig große Aggregate aufgrund von Einschränkungen und Nekrosen in den Kern zu befördern. Größe wird auch durch jede Proliferation, die während des Aggregationsprozesses auftreten können, beeinflußt werden. Wie werden diese Parameter von Zelllinie zu Zelllinie unterschiedlich sein, wenn Sphäroiden von spezifischen physikalischen Abmessungen erwünscht sind, die richtige Anzahl von Zellen einführen müssen experimentell ermittelt werden. In erster Näherung wird Sphäroid Durchmesser erwartet, dass mit der dritten Wurzel der Anzahl der Zellen eingebaut zu erhöhen - zum Beispiel eine 8-fache Erhöhung der Anzahl der Zellen sollte zu einer Verdoppelung der Sphäroid Durchmesser führen. <html> _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der Sphäroid-Produktion. Die Mikrowell-System besteht aus einer Anordnung von dicht gepackten quadratisch-pyramidalen Mikrovertiefungen (625 pro cm 2 für die 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m Größe), in die Zellen zentrifugiert werden. Die Zellen werden durch die schrägen Seitenwände gebracht werden, und die Größe des resultierenden Sphäroid durch Variieren der Dichte der eingesetzten Zellsuspension gesteuert. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; 2. Versammlung der gruppierten Zellen in Sphäroiden. Spheroids wurden aus siebenhundert HT29 Zellen jeweils gebildet. Sofort nach der Zentrifugation (A) Zellen sind lose in dem Boden jeder Vertiefung geclustert. Beachten Sie, dass die Cluster gleichmäßig nach rechts unten in diesem Fall ausgeglichen. Dies ist akzeptabel, vorausgesetzt, Clustergrößen konsistent bleiben über das Array. Wenn bedeutende Unterschiede Cluster-Größe von einer Seite des Feldes auf die andere zu sehen, siehe Anmerkung in Schritt 3.5. Nach Inkubation für 24 h (B), wurden die interzelluläre Haftkräfte verursacht die Cluster zu aggregieren und bilden zusammenhängende Sphäroide, die dann herausgezogen werden kann (C). <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Abbildung 3. Sphäroide in Mikrotiterplatten erzeugt. Sphäroide wurden gebildet siebenhundert (A, C, E) oder eintausendfünfhundert (B, D, F) HT29-Dickdarmkrebszellen (A, B), LNCaP-Prostatakrebszellen (C, D) oder TE6 Speiseröhrenkrebs-Zellen (E, F). Beachten Sie die Konsistenz der Kügelchen innerhalb einer Vorbereitung, und auch die Unterschiede zwischen den Zelllinien - insbesondere die losen LNCaP Aggregate im Vergleich zu dem dichter gepackt und HT29 Zellen TE6. Maßstabsbalken entspricht 200 um. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Microwell-Format </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40ex </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Microwell Breite (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Mikrowells pro cm 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156,25 </td></tr><tr><td> Mikrowells pro Well </td><td> 1200 </td><td> 4700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Mindest Zellen pro Mikrowell * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Maximale Zellen pro Mikrowell * </td><td> 2000 </td><td> 2000 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> Mindest Zellen pro Vertiefung * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Maximale Zellen pro Vertiefung * </td><td> 2,4 x 10 6 </td><td> 9,4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70% Ethanol (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Spülen Lösungsvolumen (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 3.2 - Mittlere Vorspannung Volumen (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> 3.5 - Handy Ladevolumen (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Anzahl der Zellen pro Mikrovertiefung sind nur eine Annäherung, da dieser Wert wird mit der Größe der eingesetzten speziellen Zellen variieren und sollte empirisch bestimmt werden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. AggreWell Optionen und Modifikationen Protokoll.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Wir führen ein Protokoll für die Erzeugung einer großen Anzahl (Tausende bis Hunderttausende) von einheitlicher Größe und Zusammensetzung gesteuerten Tumorsphäroide mit handelsüblichen Mikrotiterplatten.

Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

production-large-numbers-size-controlled-tumor-spheroids-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.3K Aufrufe.  University of Calgary.  Wir führen ein Protokoll für die Erzeugung einer großen Anzahl (Tausende bis Hunderttausende) von einheitlicher Größe und Zusammensetzung gesteuerten Tumorsphäroide mit handelsüblichen Mikrotiterplatten. 

Serie: Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Forschung

Biotechnik

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was pretreated with NaOH and washed to a neutral pH. Cellulase was added to the pretreated bamboo powder to generate the hydrolysate, which contained 30 g/L glucose and 15 g/L xylose and was used as the carbon source to prepare a medium for chemical production. When cultured in microaerobic conditions, 12.7 g/L 2,3-butanediol was produced by wildtype K. pneumoniae. In aerobic conditions, 13.0 g/L R-acetoin was produced by the budC mutant of K. pneumoniae. A mixture of 25.5 g/L 2-ketogluconic acid and 13.6 g/L xylonic acid was produced by the budA mutant of K. pneumoniae in a two-stage, pH-controlled fermentation with high air supplementation. In the first stage of fermentation, the culture was maintained at a neutral pH; after cell growth, the fermentation proceeded to the second stage, during which the culture was allowed to become acidic.

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo powder was pretreated with NaOH and enzymatically hydrolyzed. The hydrolysate of bamboo was used as the feedstock for 2,3-butanediol, R-acetoin, 2-ketogluconic acid, and xylonic acid production by Klebsiella pneumoniae.

Herstellung von Chemikalien durch<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bambushydrolysat als Ausgangsmaterial verwenden

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

Herstellung von größenkontrollierten und emulsionsfreien Chitosan-Genipin-Mikrogelen für Tissue-Engineering-Anwendungen

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...