Dieses Protokoll demonstrierte eine standardisierte Methode zur Konstruktion dreidimensionaler Tumore von Sphäroide. Und diese Methodik ermöglichte eine High-Circuit- und High-Content-Analyse von 3D-Tumorkonstrukten. Durch die Verwendung einer Standardmethode zur Konstruktion von Tumorsphäroiden und eines Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analysesystems kann die Effektivität und Genauigkeit von Arzneimitteltests, die auf dreidimensionalen Sphäroiden durchgeführt werden, drastisch gesteigert werden.
In diesem Protokoll haben wir AMG510 verwendet, um das NCI-H23-Sphäroid als Beispiel zu behandeln. Aus dem Experiment konnten wir eine signifikante Wirkung des krebsartigen zielgerichteten Medikaments auf die Tumorsphäroide beobachten. Pipettieren Sie zunächst 100 Mikroliter Antihaftreagenz in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit U-förmigem Well-Boden und bewahren Sie sie 10 Minuten lang auf.
Nach 10 Minuten das Beschichtungsreagenz absaugen und zweimal mit sterilisiertem PBS waschen. Legen Sie die Kulturplatte bis zur Verwendung bei 37 Grad Celsius in befeuchtete Luft mit 5% Kohlendioxid in einen Inkubator. Beobachte die Zellen unter dem Mikroskop.
Waschen Sie dann die in einem T25-Kolben kultivierten Zellen zweimal mit PBS, um das Nährmedium zu entfernen, und behandeln Sie die expandierten Zellen mit einem Milliliter 0,25%Trypsin EDTA für ein bis zwei Minuten in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid. Bestätigen Sie die Zellform unter dem Mikroskop. Beenden Sie dann die Trypsinbehandlung, indem Sie die gebrauchte Trypsin-EDTA-Suspension in den T25-Kolben absaugen und die Zellen mit vier Millilitern frischem Medium waschen.
Übertragen Sie die gesamte Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Restzellen mit einem Milliliter frischem Medium ab und geben Sie es in das Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 186,48 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie 10 Milliliter frisches Medium in das Zellpellet und pipettieren Sie vorsichtig, bis sich die Zellen in einer homogenen Suspension befinden.
Aspirieren Sie 0,1 Milliliter Zellsuspension in ein neues Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 0,9 Milliliter frisches Medium hinzu und pipettieren Sie dann die Suspension gut. Extrahieren Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension für die Zellzählung.
Wiederholen Sie diesen Vorgang ein- oder zweimal und nehmen Sie einen Durchschnittswert. Verdünnen Sie die Suspension, um eine endgültige Aussaatdichte von 50.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Als nächstes geben Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 48-Well-U-Bodenplatte.
Wickeln Sie die Siegelfolie um die Platte und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 119,35 g. Ziehen Sie nach dem Zentrifugieren die Schutzfolie ab und geben Sie fünf bis acht Milliliter sterilisiertes Wasser in den Wasserkanal, der die Brunnen umgibt. Inkubieren Sie die Platte fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius.
Wechseln oder ergänzen Sie den Wasserkanal während dieser Zeit nicht mit Wasser und beobachten Sie die Zellaggregation während der folgenden fünf Tage. Für die Geleinbettung legen Sie das gefrorene Gel, nachdem Sie es aus dem minus 20 Grad Celsius warmen Kühlschrank genommen haben, während des Experiments für die gesamte Zeit auf eine Eisbox. Beobachten Sie die Zellsphäroide unter dem Mikroskop.
Bevor die Geleinbettung beginnt, sollte der Status der Sphäroide noch einmal überprüft werden. Entfernen Sie vorsichtig 150 Mikroliter des Mediums und betten Sie jedes Sphäroid in das Gel ein, indem Sie das flüssige Gel langsam von der Wandseite der Vertiefung hinzufügen, während Sie die vorgekühlte Pipettenspitze um und in der Vertiefung bewegen. Warten Sie fünf Minuten und wenn sich das Gel nicht gleichmäßig verteilt, pipettieren Sie das Gel vorsichtig mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze.
Jede Vertiefung enthält ein Tumorsphäroid, 25 Mikroliter 3,5 Milligramm pro Milliliter-Gel und 50 Mikroliter komplettes Nährmedium. Fügen Sie den Bedienelementen auch 75 Mikroliter Medium hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, bis die Hydrogelierung vollständig abgeschlossen ist.
Bestätigen Sie den Gelierstatus unter dem Mikroskop. Jede Probe mit 125 Mikrolitern frischem Medium überlagern und die Sphäroide weitere 7 bis 10 Tage kultivieren. Bereiten Sie Gruppen von Sphäroiden mit jeweils vier bis sechs Vertiefungen vor und wählen Sie mindestens drei davon für die Analyse aus.
Lösen Sie das Medikament nach Herstellerangaben auf und bereiten Sie mit DMSO 100-fach wirkende Lösungen zu. Verwenden Sie 0,1 % DMSO als Positivkontrolle und geben Sie 125 Mikroliter medikamentös behandeltes Medium in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in befeuchteter Luft mit 5 % Kohlendioxid wieder in den Inkubator.
In diesem Stadium enthält jede Vertiefung ein Tumorsphäroid, 25 Mikroliter 3,5 Milligramm pro Milliliter-Gel und 175 Mikroliter des Mediums. Die Kontrollen enthalten 200 Mikroliter des Mediums. Messen Sie die Lebensfähigkeit des Sphäroids mit einem alamarBlue-Assay-Kit gemäß den Richtlinien des Herstellers.
Aspirieren Sie 100 Mikroliter des überstehenden Mediums aus jeder Vertiefung in eine neue Testplatte. Messen Sie dann die Viabilität mit einem Mikrotiterplatten-Photometer. Messen Sie es am ersten, vierten, siebten und 10. Tag, nachdem Sie die Sphäroide in das Gel eingebettet haben.
Geben Sie 80 Mikroliter frisches Medium in jede Vertiefung der Kulturplatte. Ersetzen Sie dann weitere 100 Mikroliter des medikamentös behandelten Mediums. Stellen Sie sicher, dass sich keine Reste von alamarBlue im Brunnen befinden.
Saugen Sie vor der Belichtung 100 Mikroliter des Mediums ab und legen Sie die Platte auf den Tisch. Erhalten Sie digitale Bilder der Sphäroide mit einem automatisierten Mikroskop mit einem zehnfachen Objektiv. Das Mikroskop kann diese Sphäroide automatisch fokussieren und zentralisieren.
Warten Sie auf die automatische Bildgebung. Für jedes Sphäroid werden vier Bilder aufgenommen. Ein integriertes Bild wird erstellt und mit der Software verarbeitet, die mit dem High-Content-Imaging-System verbunden ist.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Image-Patch-Prozess und wählen Sie die integrierten Images in der Software aus. Wählen Sie U net-Modell und geben Sie den Umrechnungskurs ein. Klicken Sie auf den unteren Bildschirmrand, um die Bildverarbeitung zu starten.
Speichern Sie die Durchmesser-, Umfangs- und Rauheitsdaten in der Tabellenkalkulationssoftware. Zum Schluss fügen Sie 100 Mikroliter frisches Medium mit dem Medikament hinzu und stellen die Platte bei 37 Grad Celsius in befeuchteter Luft mit 5% Kohlendioxid wieder in den Inkubator. Die Hellfeldbilder von NCI-H23-Zellsphäroiden, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von AMG510 behandelt und automatisch von einem High-Content-Mikroskop aufgenommen wurden, sind in dieser Abbildung dargestellt.
Die Spalten stehen für unterschiedliche Tage und die Zeilen für unterschiedliche Arzneimittelkonzentrationen. Die Ergebnisse beinhalten drei Sphäroide für jede Erkrankung. Die Viabilität des Tumorsphäroids der mit AMG510 behandelten Probengruppen wurde an Tag eins, Tag vier, Tag sieben und Tag 10 gemessen.
Die terminale Zellviabilität der Proben mit Konzentrationsgradienten ist in dieser Abbildung dargestellt. Die Sphäroidedurchmesser des Tumors wurden an Tag eins, Tag vier, Tag sieben und Tag 10 gemessen. Das Sphäroidwachstumsverhältnis wurde als das Endvolumen relativ zum ursprünglichen Volumen definiert und anhand der Sphäroiddurchmesser berechnet.
Das Hemmungsverhältnis des Sphäroidwachstums wurde relativ zum Volumen definiert und anhand der Sphäroiddurchmesser berechnet. Die Tumorrauheit wurde von der Software an Tag eins, Tag vier, Tag sieben und Tag 10 gemessen, was auf die Invasivität der Tumorsphäroide hinweist. Der Umfang des Sphäroids wurde von der Software mithilfe von Deep-Learning-Algorithmen lokalisiert und gezeichnet.
Die Sphäroidbereiche in der Fokusebene wurden dann mit Bild J gemessen und auf der Grundlage dieser Daten ein überschüssiger Umfangsindex berechnet. Obwohl diese Botschaft leicht zu befolgen ist, müssen die Proben dennoch vorsichtig behandelt werden.
