Dieses Protokoll wurde in Zusammenarbeit mit der bisherigen Mitglieder des McGinnis Lab, Kim A. Mace und Joseph C. Pearson entwickelt. Wir danken den fortgesetzten Bemühungen der Bloomington Drosophila Stock Center für ihre Arbeit zu organisieren und zu verteilen wertvolle Bestände. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem National Institutes of Health (R01 und K12 GM077197 GM68524) und die Familie von Herbert Stern unterstützt. MTJ wird derzeit von Grant Number 5G12RR003060-26 aus dem National Center for Research Resources und Grant Number 8G12MD7603-27 aus dem Nationalen Institut für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Nationalen Instituts für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten oder den National Institutes of Health.

Die Drosophila embryonalen Wunde Protokoll kann in fünf Stufen zusammengefasst werden: (1) Embryonen, (2) Embryo-Vorbereitung (3) Embryo Verwundung, (4) Embryo Mikroinjektion, und (5) Embryo Fixation. 1. Embryonen <ol><li> Sammeln erwachsenen Fliegen, 2-3 Tage nach schlüpfende, 50 Frauen und 25 Männer mit einem Embryo Sammlung Käfig. </li><li> Legen Sie einen frischen Apfelsaft und Hefe-Agar Platte jeden Morgen für 3 Tage. Hinweise: Für die optimale Besamungs, Zyklus die Fliegen auf einem 12-Stunden-Tageszeitplan in einer 25 ° C-Inkubator (05.00 Lichter &quot;ON&quot; und 17.00 Uhr Lichter &quot;OFF&quot;), weibliche Fliegen reagieren auf Veränderungen in der Lichtzyklus und werden im Rahmen einer Umstellung von Lichtern &quot;ON&quot; leuchtet &quot;OFF&quot; 10,11 größere Mengen Eier abzulegen. </li><li> Am Nachmittag des Tag-3, legen Sie einen frischen Apfelsaft und Hefe-Agar-Platte auf den Käfig und sammeln Embryonen für 2 Stunden. Legen Sie eine neue Hefe-Platte auf den Käfig, und speichern Sie die2 h-Sammelplatte. </li><li> Speichern die Sammelplatte für weitere 14 h bei 25 ° C, um die Embryonen zu altern. Anmerkungen: Die Wundheilung kann in jeder Phase während der Drosophila-Entwicklung untersucht werden, die in diesem Papier beschrieben wundinduzierten Transkriptions Reporter haben eine optimale Aktivität zwischen den Stufen 15 bis 16 Dezember. Am späten Stufe 17 ist der Embryo zu alt, um einfach durchbohren die Reifung Kutikula und die Wunde Reportern effizient zu aktivieren oder zu erkennen wundinduzierten Transkription. Damit die Sammelzeit und die Verwundung Zeit, während der Spitzenlabor Stunden auftreten, folgen wir einen Zeitplan für die Embryo-Entnahme für 2 Stunden (16.00 bis 18.00 Uhr), den Austausch der Sammlung Platte mit einer neuen Platte um 18:00 Uhr, Alter der Sammelplatte bei 25 ° C für 14 h (über Nacht), und die Embryonen aufgewickelt um 08:00 Uhr (am nächsten Tag). </li></ol> 2. Embryo Vorbereitung Hinweise: Dieses Protokoll umfasst den Einsatz von vielen Werkzeuge und Gegenstände, die scharf sind oder von g gemachtMädchen. Behandeln Sie alle Kleie und Glasobjekte mit Vorsicht, um Verletzungen zu vermeiden. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig Embryonen aus der Sammlung Platten mit einem Pinsel, indem 2-3 ml Wasser auf die Platte und wirbelnden. Bringen Sie Wasser und Embryonen von Platte zu Nylon Netz und Sammelrohr. </li><li> In 4-5 ml Bleichmittel auf die Kappe eines Kunststoff-Petrischale Platte und genießen Sie das Netz abgedeckt Ende der Sammelröhrchen, die die Embryonen in Bleichmittel für 2 min;, die die äußere Eierschale des Embryos entfernt. Manuell drehen Sie den Sammelröhrchen ein paar Mal Embryonen aus Verklumpung in der Bleich verhindern. Spülen mit Wasser Embryonen 10x und trocknen Sie das Netz abgedeckt Sammelröhrchen, die die dechorionated Embryonen auf einem Papiertuch. </li><li> Verwenden Sie eine Nadel, um Sezieren ~ 50 Embryonen aus Nylon-Mesh über zu einer Agar-Platte. Wir fügen grüne Lebensmittelfarbe auf die Agar-Platte, um den Kontrast und die Hilfe bei Embryo Ausrichtung hinzuzufügen. Unter einem Binokular, stellen zwei parallele Reihen von ~ 25 Embryonen, richten Sie die embryos auf der Folie, so daß sie im rechten Winkel zu der Punktionsnadel auf der Mikroinjektionsvorrichtung sein. Lassen Sie ein wenig Platz (ca. 1 Embryo Länge) zwischen den Embryonen für den Gasaustausch Zwecke. Die zwei parallelen Reihen sollte etwa 5 mm voneinander entfernt sein. </li><li> Legen Sie eine Folie mit doppelseitigem Klebeband auf der Oberseite der Embryonen ausgerichtet, und drücken Sie die Folie, um Embryonen, die von der grünen Platte auf den Schlitten übertragen sorgfältig. Dann Luft trocknen die Embryonen ~ 25 min bis Innendruck auf den Embryo zu reduzieren und zu verhindern, wenn ein Burst Verwundung. </li><li> Legen Sie 2-3 Tropfen Halocarbonöl-Mix in den Embryonen zu weiteren Austrocknung zu verhindern. </li></ol> 3. Embryo Verwundung <ol><li> Legen Sie die Folie in der Embryo-Injektion Mikroskoptisch. Finde die Embryonen in das Sichtfeld bewegt und üben die Phase des umgekehrten Mikroskops. Hinweise: Vor der Arbeit mit der Nadel, konzentrieren sich auf Mittelebene des Embryo entlang der dorsoventralen Achse. Um ein effizientes Verwundung die erlaubenEmbryonen ausgerichtet, Verwundung beginnen die Reihe näher an der Nadel Gerät. Bewegen Sie die Bühne, um die Spitze der Reihe ausgerichtet Embryonen in das Blickfeld zu bringen. </li><li> Vorsichtig und sichern gezogen-Nadel in den Nadelhalter. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel nach unten in Richtung Folie verschieben. Richten Sie die Nadel mit dem Embryo im gleichen Brennebene. Sobald die Nadel im Fokus mit dem Embryo, nicht die Nadel mit dem Mikromanipulator zu bewegen. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, um den Embryo durch und durch durchstechen, dann auf der nächsten Embryo in der Zeile zu bewegen. Wenn Sie fertig sind Verwundung die erste Zeile, verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel ganz nach oben und weg von der Bühne, bevor er den Schlitten zu bewegen, drehen Sie die Folie manuell 180 ° und Wund die zweite Reihe. </li><li> Bewahren Sie die Embryonen unter Halocarbonöl bei Raumtemperatur und fahren Sie mit Embryo-Fixierung, wenn dadurch in-situ-Hybridisierung oder Antikörperfärbung (siehe Vorgehensweise Schritt 5). Alternativ speichern Sie die Embryonen für 4-6 hunter Halocarbonöl und fahren Sie mit Wundtranskriptions fluoreszierenden Reporter-Visualisierung (Repräsentative Ergebnisse). Hinweise: Für die Visualisierung der fluoreszierenden Reporter, betäuben wir die Embryonen mit 50% 1-Phenoxy-2-Propanol 13. Die Embryonen werden aus der Halocarbonöl entfernt und auf einem neuen Objektträger gelegt. Wir stellen Glasperlen um den Embryonen, fügen Sie ein paar Tropfen des Anästhetikums, und legen Sie ein Deckglas auf der Embryonen. </li></ol> 4. Embryo-Mikroinjektion Hinweise: Die Mikroinjektionsvorrichtung, die wir in dem Protokoll ist nicht automatisiert, um spezifische Volumen während des Tests zu liefern. Wir fügen einen Farbstoff zu der Lösung, die Mikroinjektion zu visualisieren und zu versuchen, das abgegebene Volumen zu normieren. Wenn zu viel Lösung in das Embryo injiziert wird die Dotterhaut platzen. <ol><li> Last Nadel von hinten mit 1 &amp;mgr; l der chemischen Lösung und Farbstoff (z. B. 0,6 MH 2 O 2). Lassen KapillareMaßnahmen, um die chemische Lösung auf die Spitze der Nadel zu ziehen. </li><li> Um eine Nadel abbrechen, legen Sie ein Deckglas in einem Winkel auf einer Folie und Mantel die Kante mit Halocarbonöl-Mix. Bringen Sie die Nadel in den Fokus montiert mit der Kante des Winkeldeckglas und Deckglas sanft bewegen Kante an der Spitze der Nadel bis gebrochen. Üben Sie Druck auf Mikroinjektionsvorrichtung und überprüfen Sie, dass die chemische Lösung plus Farbstoff wird die Nadel heraus fließt. </li><li> Legen Sie die Folie mit Embryonen ausgerichtet auf dem Mikroskoptisch. Gehen, um den Embryo und die Nadel in der gleichen Ebene zu konzentrieren. Gleichzeitig durchstechen und microinject chemischen Lösung plus Farbstoff in jedem Embryo. Hinweise: Verstopfte Nadeln häufig auftreten, brechen Sie eine neue Nadel auf unvollständige Mikroinjektion zu vermeiden. Eine stumpfe Nadelspitze ist nicht so sauber wie einer abgewinkelten Nadelspitze gewickelt. Einstellen des Deckglases mit einem von 90 ° verschiedenen Winkel während Bruch optimal ist, um einen abgewinkelten Nadelspitze zu erzeugen. </li></ol> 5. Formaldehyd-Fixation Hinweise: Die in diesem Drosophila Fixierung verwendeten Chemikalien sind schädlich. Persönliche Schutzausrüstung (z. B. Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille) beim Umgang mit den Chemikalien. Folgen einzelnen institutionellen Richtlinien für die Entsorgung von Chemikalien geregelt. <ol><li> Nach der Verwundung und nach 15, 30, 60 oder mehr Minuten für die Transkriptionsaktivierung von wundinduzierten Genen auftreten. Embryonen aus Einspritz Folien zu entfernen, sorgfältig entleeren Halocarbonöl-Mix aus den Folien, lehnen Sie die Folie vor einem Rack und tupfen Sie das Ende mit einem Kimwipe. </li><li> Verwenden Sie eine Glaspipette zu Heptan über den Objektträger spülen und waschen die Spülflüssigkeit in eine Glaspetrischale. Heptan wird das Band auflösen und die Embryonen. Weiter zu spülen, bis alle Embryonen werden von der Folie entfernt. Gehen Sie zur nächsten Folie, bis alle Embryonen werden aus Folien entfernt. </li><li> Übertragen Sie die Heptan und Embryo-Lösung aus der Glasschale in ein 20 ml scintillation Fläschchen. Schütteln Sie die Flasche für 2-3 min, entfernen Sie die Heptan und 5 ml frischem Heptan. </li><li> 5 ml frisch, Fixierungslösung (siehe Reagenzien Liste für Rezept). Verschließe das Röhrchen und heften sich an einem Orbitalplattform Shaker. Schütteln Sie das Fläschchen, das die Embryonen für 25 Minuten bei 220 bis 230 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Nach dem Schütteln, lassen die Blasen an der Schnittstelle Pop. Vollständig entfernen Sie die untere, wässrige Phase mit einer Pipette, die Vermeidung Ziehen der Embryonen. Die untere Schicht besteht aus der Fixierungslösung und sollte entsorgt werden. </li><li> 5 ml Methanol, das Röhrchen und kräftig mit der Hand 20-30 Sek., Wirbel und legen Sie es auf die Bank. Wounded Embryonen werden auf der Interphase bleiben und nicht auf den Boden sinken. Hinweise: Nach der Fixierung der Dotterhaut eines unverwundete Embryo wird in der Regel während der Entwässerungsschritt mit Methanol platzen. Allerdings ist die Dottermembran in einem verwundeten Embryo bereits gebrochen und die Entwässerungsschritt wird die Dotter memb nicht entfernenrane. Hand devitellinzation ist erforderlich, um die Fixierung Protokoll abzuschließen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die obere Schicht Heptan und dann mit 5 ml frischem Methanol. Schütteln Sie die Flasche und die Embryonen sollten sinken. </li><li> Entfernen Sie die Methanol plus Embryo-Lösung mit einer Transferpipette Glas und sammeln in einer Nylon-Mesh Sammelrohr in einer Glasschale. </li><li> Entfernen Sie die Methanol und spülen Sie die Embryonen mit 1x PBS-Lösung. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen aus der Nylon-Mesh zu einem Apfelsaft Platte. Verbreiten Sie die Embryonen aus entlang der Oberfläche der Platte. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen zu einem Doppelklebeband Glasträger. Decken Sie die Embryonen mit 1x PBS. Anmerkungen: Die Embryonen sind in der Regel aufgrund der Dotterhaut verklumpen. Mit einem Apfelsaft Ort ermöglicht eine schnelle Trennung der verklumpten Embryonen. Die Embryonen müssen von der Platte entfernt und zu einem Doppelklebeband Glasobjektträger übertragen werden, da Embryonen sinken in der Agar-Platte, wenn Kraft aufgebracht wird, um den Embryo aus dem entfernenDotterhaut. </li><li> Drücken Sie vorsichtig die Embryonen mit einem Seziernadel zu &quot;Pop&quot; die Dotterhaut. Der Embryo in der PBS sinken. </li><li> Verwenden Sie eine Glaspipette, die 1x PBS plus Embryonen in ein 1,5-ml-Röhrchen übertragen. Spülen Sie die Embryonen mit 1x PBS und bei 4 ° C Gehen Sie, um die Embryonen mit Hilfe eines Ethanol entwässern: PBS-Serie und weiterhin mit in-situ-Hybridisierung oder Immun Protokoll 14. </li></ol>

<ol>
	<li>Germeraad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+in+Drosophila+by+microinjection+of+DNA.">Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA.</a> Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).</li><li>Payre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+epidermis+differentiation+in+Drosophila.">Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epidermal+barrier+wound+repair+pathway+in+Drosophila+is+mediated+by+grainy+head.">An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head.</a> Science. 308 (5720), 381-385 (2005).</li><li>Ting, S. B., Caddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+Drosophila+grainy+head+is+essential+for+epidermal+integrity+in+mice.">A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice.</a> Science. 308 (5720), 411-413 (2005).</li><li>Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, &. #. 2. 1. 6. ;., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+transcription+factor+codes+activate+epidermal+wound-response+genes+in+Drosophila.">Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).</li><li>Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+in+Drosophila+melanogaster+uncovers+a+novel+set+of+genes+required+for+embryonic+epithelial+repair.">Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair.</a> Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).</li><li>Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+UAS-RNAi+screen+in+Drosophila+larvae+identifies+wound+closure+genes+regulating+distinct+cellular+processes.">A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes.</a> Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).</li><li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duox,+Flotillin-2,+and+Src42A+are+required+to+activate+or+delimit+the+spread+of+the+transcriptional+response+to+epidermal+wounds+in+Drosophila.">Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila.</a> PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+light+condition+modification+on+the+circadian+rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+Drosophila+melanogaster.">Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+photoperiod+ld+12:12+of+Drosophila+melanogaster.">Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster.</a> Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).</li><li>Pierre, S. E., Thurmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyBase+101+-+the+basics+of+navigating+FlyBase.">FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase.</a> Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).</li><li>Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Phenoxy-2-propanol+is+a+useful+anaesthetic+for+gastropods+used+in+neurophysiology.">1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology.</a> J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846 (2004).</li><li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Drosophila+transgenic+reporters:+insulated+P-element+vectors+expressing+fast-maturing+RFP.">New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP.</a> BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Casso, D., Ram&#237;rez-Weber, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).</li><li>Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+proteolytic+pathway+activation+reveals+an+expanded+ensemble+of+wound+response+genes+in+Drosophila.">Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila.</a> PloS one. 8 (4), e61773 (2013).</li><li>Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+melanogaster+embryonic+hemocyte+migrations.">Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations.</a> J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).</li><li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response.">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).</li><li>Repiso, A., Berganti&#241;os, C., Corominas, M., Serras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+repair+and+regeneration+in+Drosophila+imaginal+discs.">Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs.</a> Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).</li><li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+transdetermination+in+Drosophila+imaginal+discs.">Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs.</a> Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine sofortige Transkriptionsregulations Reaktion auf externe Signale erlaubt den Zellen, eine lokalisierte Reaktion auf extrazelluläre Reize, die Stress, Schäden oder Infektion zählen kann koordinieren. Die unsachgemäße Kontrolle eines lokalisierten Antwort kann schädliche Auswirkungen auf die Nachbarzellen, sowie eine Verschwendung von Ressourcen, um die Schädigung zu reparieren. Die Drosophila-Embryo bietet ein ausgezeichnetes System, grundlegende Experimente in der Wundheilung eine kostengünstige und einfach zu pflegen Modellorganismus führen. Das Potenzial für Kooperationen zwischen Forschung in anderen Modellorganismen Drosophila und bietet eine einzigartige Gelegenheit, viele biologische Fragestellungen zu erforschen. Eine weitere Technik der Wund Reporter ist die Kombination von mutierten genetischen Hintergründen, ein effizientes Verfahren zum Testen der Beitrag der neuen Gene in die Aktivierung des epidermalen Wundreaktionsweges. Wir haben epidermalen wundinduzierten Transkriptions Reportern avTENBLÄTTER sowohl am 2. und 3. 5 Chromosomen. In dieser Studie verwenden wir GAL4 UAS-Systeme und der Überexpression 16. Für Studien mit tödlichen mutierten Allele bestimmen wir den genetischen Hintergrund mit einem fluoreszierenden Balancer-Chromosom, zB Kruppel-GFP-17. Wir haben die Wunde Reporter Lokalisierung in mehreren genetischen Hintergründen (Tabelle 1) analysiert. Eine mögliche Modifikation der Technik ist es, die Mikroinjektion und Verwundung zu kombinieren. Mikroinjektion kann verwendet werden, um eine chemische Lösung in den Embryo eingeführt werden. Mehrere chemische Verbindungen wurden getestet und es wurde gefunden, um die Aktivität der epidermalen Wund Reportern 9 regulieren. Dieses Verfahren der gleichzeitigen Verwundung und Mikroinjektion kann nützlich sein, um die Anzahl der Zellen in der Drosophila-Embryo, der eine Wunde Signal reagieren und kann direkt auf Veränderungen der Genexpression überwacht werden nach der Verwundung 18 zu erhöhen. Eine zukünftige Anwendung der Mikroinjektionstechnik wird es sein, neue Chemikalien zur Regulierung des epidermalen Wundreaktion zu testen. Drosophila als Modellsystem für genetische Studien bietet eine breite Palette von einfachen bis zu komplexen Fragen Protokolle effizient anzugehen. Jüngste Berichte über die Durchführbarkeit der Drosophila Techniken unterstreicht die Verwendung von hemocyte Migration 19 und 20 Schlupfwespe Infektion als ein Mittel, um die Auswirkungen der Drosophila-Forschung weiter auszubauen. Neben Wundheilung Studien, Drosophila bietet ein klassisches Modell für die Regeneration mit Imaginalscheibe System 21,22. Die kombinierten Fortschritte in Imaginalscheibe Regeneration Studien-und Stich / Mikroinjektion Verwundung bietet ein ausgezeichnetes System zur gut erhaltenen Komponenten des Gewebereparatur zu entdecken.

Manipulation von Drosophila-Embryonen mit einer Mikroinjektionstechnik ist eine gut etablierte Assay ein. Die Bedeutung der epidermalen Wundantwort Reporter Verfahren ist, das Protokoll für die Punktion / Mikroinjektion mit fluoreszierenden Reporter kombiniert und visualisiert eine in vivo Antwort auf epidermale Schädigung in Drosophila-Embryonen. Das Ziel dieser Methode ist es, eine breitere Gruppe von Wissenschaftlern ermöglichen, Drosophila als Werkzeug, um die Prozesse, die die Transkriptions Reaktion auf epidermalen Stichverletzung regeln untersuchen zu verwenden. Die einschichtige Epidermis in Drosophila stellt ein einfaches System, um einen epidermalen Wundreaktion nach einer Stichverletzung 2 zu studieren. Die Drosophila-Embryo ist eine robuste Modellsystem, um genetisch sezieren die Phasen der Wundheilung, einschließlich Wundreaktion, Entzündung und Reepithelialisierung 3. Dies ist zum Teil, weil viele oder die meisten zygotischen Mutanten überleben Ende embryogenesist und zu entwickeln epidermalen Barrieren, auch wenn Entwicklungs Strukturierung geht grundlegend schief. Zurück Charakterisierung eines gut erhaltenen Transkriptionsfaktor Körniger Kopf (Grh), festgestellt, dass Grh-Zielgene Dopa-Decarboxylase (DDC) und Tyrosin-Hydroxylase (PLE) transkriptionell rund um die Standorte der Verletzung 4 aktiviert. Drosophila als Modellorganismus für die Wundantwort bietet eine ergänzende Reihe von Untersuchungen, Studien in Säuger 5 Wundheilung voranzutreiben. Nachfolgende Studien haben zusätzliche Drosophila wundinduzierten Gene identifiziert und entwickelte ein &quot;Toolkit&quot; von vielen fluoreszierenden Reporter Wunde, um die in vivo epidermalen Wundreaktion überwachen zu reinigen Verwundung 6. Jüngste Berichte über die Regulierung der Drosophila-Wundheilung wurden auf der Wundverschluss Phänotyp konzentriert, so dass Entdeckung der vielen Wege Regulation der Zellmigration 7,8. Bei der Analyse derfluoreszierenden Reporter Wunde, haben unsere Untersuchungen einen neuen Satz von Genen für die lokalisierte Expression des epidermalen Wunden induzierbare Gene 9 erforderlich identifiziert. Einer der Vorzüge der Wundreaktion Reporter Verfahrens ist, daß die Ergebnisse mehr Einblick in einen Mechanismus, wie Signale von der Stelle der Verletzung zu den benachbarten Zellen transduziert. Allerdings ist einer der Nachteile der Wundreaktion Reporter Verfahren, dass die Ergebnisse nicht direkt verlinken auf Phänotypen bei der Wundheilung oder Reparatur. Breitere Nutzung der sauberen Wunde Punktion-Protokoll in der genetischen und chemischen Bildschirme ermöglichen neue Regulatoren der Transkriptions Reaktion auf epidermalen Verwundung identifiziert werden und ferner die Übersetzung von Wundheilungs Entdeckungen in Säugetiermodelle Verletzungsbehandlungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">yeast</td>
			<td style="width:124px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">51475</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apple juice</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-824-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenoxy-2-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">toluidine blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, 16%</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18814-20</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H360-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:121px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila incubator</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fly cage</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">embryo collection tube</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>46-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double-stick tape</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissection needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-965A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass cover slip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4445</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capillary needle</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microinjection needle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MINJ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Primo-Vert</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-063-172</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfer bulb</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scintillation vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-259-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fixation solution</td>
			<td>(5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% formaldehyde</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td></td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halocarbon oil mix</td>
			<td>(10 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in drosophila embryos.

Die Drosophila-Embryo entwickelt eine robuste Epidermis, die sowohl die internen Zellen aus einer harten äußeren Umwelt zu schützen sowie die zellulären Homöostase dient. Stichverletzungen mit Nadeln Glas bietet eine direkte Methode, um eine schnelle Antwort, die epidermalen Wund Wunde Transkriptions-Reporter, der von einem lokalisierten Reportersignal in lebenden Embryonen oder Larven sichtbar gemacht werden kann aktiviert auslösen. Pannen-oder Laser Verletzungen liefert auch Signale, die die Rekrutierung von Blutzellen an der Wundstelle zu fördern. Überraschenderweise schwerer (durch und durch) Stichverletzung im späten Stadium Embryonen nur selten stört die normale Embryonalentwicklung, als mehr als 90% dieser verwundet Embryonen überleben bis ins Erwachsenenalter, wenn Embryonen werden in einer Öl-Medium, das sofortige Auslaufen der Hämolymphe von Punktionsstellen minimiert injiziert . Die Wunde Verfahren erfordert Mikromanipulation der Drosophila-Embryonen, einschließlich manuelle Ausrichtung der Embryonen auf agar Platten und den Transfer der Embryonen ausgerichtet auf Objektträger. Die Drosophila epidermalen Wundreaktion Assay bietet einen schnellen System, um die genetischen Anforderungen einer Vielzahl von biologischen Funktionen, die Wundheilung, sowie ein Weg, um für potenzielle chemische Verbindungen, die die Wundheilung fördern, fördern Bildschirm testen. Die kurze Lebensdauer und einfache Kultivierung Routine zu machen Drosophila ein leistungsfähiges Modellorganismus. Drosophila Wundheilung sauber erscheint, um die epidermale regenerative Reaktion zu koordinieren, mit der angeborenen Immunantwort, in einer Weise, die noch untersucht werden, die ein ausgezeichnetes System konservierten regulatorischen zu finden bietet Mechanismen gemeinsam Drosophila und Säugetieren epidermalen Verwundung.

Die in diesem Verfahren dargestellten Ergebnisse zu erhalten, der offene Leserahmen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) zu einer Promotor / wundinduzierten Enhancer-Sequenz von Dopa-Decarboxylase (DDC) und DsRed auf eine Wunde Enhancer-Sequenz von Tyrosinhydroxylase fusioniert (verschmolzen ist PLE) 4,6. In einer Live-Drosophila-Embryo, ist die Reifung des fluoreszierenden Reporterprotein Wunde optimal 4-6 Stunden nach der Verletzung, die Zeit für die Ansammlung von genügend Protein zu visualisieren, als auch Zeit für das fluoreszierende Protein an den fluoreszierenden Zustand 15 zu oxidieren. Um die Reporter Lokalisierung zu beobachten, ist eine Verbindung Fluoreszenzmikroskop ausreichend. Um eine höhere Vergrößerung des Reporter Lokalisierung beobachten, ist ein konfokales Mikroskop optimal, um einen maximalen Vorsprung von mehreren optischen Abschnitte (Figur 1) zu erzeugen. Die konfokale in vivo Bildgebung von Drosophila-Embryonen durch die ra kompliziertpid Wellungen des Embryos. . Ein Vollansicht des Embryo kann mit 20X Ziel erreicht werden und eine Nahaufnahme der Wundstelle kann mit 40X-Objektiv erhältlich. Eine Draufsicht des epidermalen Wund Reporter Lokalisierung kann mit 10 aufeinanderfolgenden 1 um optische Schnitte abgebildet werden. Ein Seitensicht der epidermalen Wund Reporter Lokalisierung mit 40 aufeinanderfolgenden 1 um optische Schnitte abgebildet werden. Mit Standard-genetischen Kreuzungsmethoden ist es möglich, Wund Reportern mit genetischen Mutationen zu kombinieren. Ein Beispiel in diesem Papier ist Flotillin-2 (Flo-2), da loss-of-function (Null-Allel mit P-Element-Insertion generiert) und gain-of-function (Überexpression mit ubiquitäre Expression in allen Zellen generiert) Mutanten Flo-2 zeigen, die Flo-2-Gen-Produkt notwendig und ausreichend ist, um die Lokalisierung der DDC-GFP hemmen gewickelt Reportern 9 (2A und 2B). Mit der microinjection Protokoll ist es möglich, zu testen, ob Einführung von chemischen Lösungen superactivates oder hemmt die Lokalisierung der Wunde Reportern. Chemisch-Embryonen wurden verwundet gleichzeitig verletzt und mit einem 1:4-Verhältnis von 1% Toluidinblau Farbstoff und gelösten Verbindungen injiziert. Toluidinblau-Färbung für visuelle Bestätigung des gelösten Verbindungen in den Körper eingespritzt erlaubt. Steuer Embryonen wurden mit einem gebrochenen Nadel enthält 1.04 Verhältnis von 1% Toluidinblau Farbstoff-und Stoff ohne chemische verwundet. Zwei Beispiele in diesem Papier sind Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) und Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD), weil beide chemischen Lösungen ausreichend sind, um global aktiviert die Lokalisierung der DDC-GFP-Reporter gewickelt 9 (Fig. 2C und 2D) . Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) wurde in H 2 O verdünnt, um 0,6 M Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) wurde in 1 m solubilisiertM NaOH bis 3 mm. Verwendung des Embryos Fixierung Protokoll ist es möglich, die Aktivierung der Transkription von Genen, Wundreaktion in einem lokalisierten Domäne erkennen, eine Wundstelle umgibt. Ein Beispiel in diesem Papier ist die in situ Hybridisierung von RNA-Sonden DDC und weise 4,6,9-Transkripte (Fig. 3A und 3B) zu erfassen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. Ddc-GFP und DsRed-weise Wund Reporter Lokalisierung. Hell und fluoreszierende Bilder in verwundeten Wildtyp-Embryonen. (A) Top-Blick auf Ddc-GFP gewickelt Reporter. (B) Top-Ansicht der PLE-DsRed gewickelt Reporter. Alle Bilder wurden auf einem Leica SP2 konfokalen Mikroskop gesammelt, mit 20X Ziel. Pfeile kennzeichnen Ort der Wunde. Gestrichelte Linien im Datenfelds markieren die Umrisse der Embryonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> 2. Lokalisierung der DDC-GFP-Reporter aufgewickelt in der genetischen Mutanten-Hintergründe und chemische mikroinjizierten Embryonen. Hell und fluoreszierende Bilder von verwundeten Flotillin-2 (Flo-2)-Mutante Embryonen. (A) Loss-of-function Flo-2} {KG00210 Mutanten Ausbau der Reporteraktivität in allen Zellen der Epidermis. (B) Gain-of-function Flo-2 (Gürteltier-GAL4, UAS-FLO2)-Mutanten, die Hemmung der Reporteraktivität in allen Zellen der Epidermis. (C) Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 )-Lösung Mikroinjektion, Ausbau der repOrter Aktivität in allen Zellen der Epidermis. (D) Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD)-Lösung Mikroinjektion, Ausbau der Reporteraktivität in allen Zellen der Epidermis. Alle Bilder wurden auf einem Leica SP2 konfokalen Mikroskop gesammelt, mit 20X Ziel. Pfeile kennzeichnen Ort der Wunde. Gestrichelte Linien in den Datenplatten markieren die Umrisse der Embryonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> 3. Nachweis der Wundreaktion Gens RNA-Transkripte. Fluoreszenzbilder von in-situ-Hybridisierung und RNA-Detektion in verwundeten Wildtyp-Embryonen. Ddc (A) und PLE (B) RNA-Transkripte akkumulieren um die Wunde. Alle Bilder waren Sammlungten auf einem Leica SP2 konfokalen Mikroskop mit 20X Ziel. Pfeile kennzeichnen Ort der Wunde. Gestrichelte Linien in den Datenplatten markieren die Umrisse der Embryonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tabelle 1. Zusammenfassung der epidermalen Wundreaktion Reportern. Insertionen der vier Wundreaktion Reporter (DDC, ple, msn, kkv) sind sowohl auf den zweiten und dritten Chromosomen vorhanden. Alle der Wundreaktion Reportern aktivieren die Fluoreszenz-Gen (GFP oder DsRed) in einer begrenzten Anzahl von epidermalen Zellen rund um den Ort der Stichverletzung in der Wildtyp-Hintergrund (zB &quot;lokale&quot; Phänotyp). Ddc und msn Wundreaktion Reportern verlangen Grh für Aktivierung des FLUORESCENce-Gen nach Stichverletzungen (z. B. &quot;keine&quot; Phänotyp). Alle der Wunde Reportern verlangen Flo-2 für die Lokalisierung der Fluoreszenz-Gen nach Stichverletzung (zB &quot;global&quot; Phänotyp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos. at JoVE.com

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Die embryonalen Epidermis der sehr späten Stadium Drosophila-Embryonen stellt eine in vivo-System für die schnelle Stichwunde Response-Analyse und kann mit genetischen Manipulationen oder chemische Mikroinjektion Behandlungen kombiniert, um Studien in der Wundheilung für die Übersetzung in Säugetier-Modelle voranzubringen.

Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

12.3K Aufrufe.  The City College of New York.  Die embryonalen Epidermis der sehr späten Stadium Drosophila-Embryonen stellt eine in vivo-System für die schnelle Stichwunde Response-Analyse und kann mit genetischen Manipulationen oder chemische Mikroinjektion Behandlungen kombiniert, um Studien in der Wundheilung für die Übersetzung in Säugetier-Modelle voranzubringen. 

Serie: Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Forschung

Biotechnik

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Gentransfer und Transfektion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen mit Epidermal Growth Factor Gelatin-Based Engineered Nanovektoren Rezeptor-gezielte

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of cutaneous wound healing on the skin. Existing methods, however, still rely on visual inspections through various microscopic tools and devices that normally include high-cost, sophisticated systems and require well trained personnel for operation and data analysis. Here, we describe methods and protocols to fabricate a conformal, skin-like electronics system that enables conformal lamination to the skin surface near the wound tissues, which provides recording of high fidelity electrical signals such as skin temperature and thermal conductivity. The methods of device fabrication provide details of step-by-step preparation of the microelectronic system that is completely enclosed with elastomeric silicone materials to offer electrical isolation. The experimental study presents multifunctional, biocompatible, waterproof, reusable, and flexible/stretchable characteristics of the device for clinical applications. Protocols of clinical testing provide an overview and sequential process of cleaning, testing setup, system operation, and data acquisition with the skin-like electronics, gently mounted on hypersensitive, cutaneous wound and contralateral tissues on patients.

This article presents methods to fabricate and characterize a conformal, skin-like electronic system and protocols for the use in clinical applications, particularly on cutaneous wound management.

Herstellung und Charakterisierung eines Conformal-Haut-like Electronic System for Quantitative, kutane Wundmanagement

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...