Ce protocole a été élaboré en collaboration avec les anciens membres du laboratoire McGinnis, Kim A. Mace et Joseph C. Pearson. Nous remercions les efforts continus de la drosophile Stock Center Bloomington pour leur travail pour organiser et distribuer les stocks de valeur. Ce travail a été soutenu par un financement de la National Institutes of Health (R01 GM077197 et K12 GM68524) et la famille de Herbert Stern. MTJ est actuellement soutenu par Grant Nombre 5G12RR003060-26 du National Center for Research Resources et Grant Number 8G12MD7603-27 de l&#39;Institut national sur la santé des minorités et les disparités en santé. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national de la minorité de la santé et les disparités en santé ou les National Institutes of Health.

Le protocole de la plaie embryonnaire chez la drosophile peut se résumer en cinq étapes: (1) l&#39;embryon, de la collection (2) Préparation d&#39;embryons (3) Embryon Blessant, (4) l&#39;embryon microinjection, et (5) d&#39;embryons de fixation. Une. Embryon Collection <ol><li> Recueillir les mouches adultes, 2-3 jours après eclosing, ajouter 50 femmes et 25 hommes pour une cage de collecte d&#39;embryons. </li><li> Placez une gélose frais de jus de pomme ainsi que la plaque de levure chaque matin pendant 3 jours. Notes: Pour la collecte des embryons optimale, le cycle des mouches sur un horaire de 12 heures diurne dans un incubateur à 25 ° C (05:00 lumières &quot;ON&quot; et 17h00 les lumières &quot;OFF&quot;); mouches femelles réagissent aux changements dans le cycle de lumière et déposera grandes quantités d&#39;œufs pendant un interrupteur de feux &quot;ON&quot; pour les lumières &quot;OFF&quot; 10,11. </li><li> Dans l&#39;après-midi du Jour-3, placer un jus de pomme frais, plus la levure plaque de gélose sur la cage et recueillir des embryons pendant 2 heures. Placez une nouvelle plaque de levure sur la cage et enregistrer le2 plaque de collection de h. </li><li> Conservez la plaque de collection pour un 14 heures supplémentaires à 25 ° C à l&#39;âge des embryons. Notes: La cicatrisation peut être dosés à n&#39;importe quel stade de développement de la drosophile, les journalistes de la transcription induite plaies décrites dans ce document ont une activité optimale entre les étapes 15 à 16 déc. À la fin de l&#39;étape 17, l&#39;embryon est trop vieux pour percer facilement la cuticule de maturation et d&#39;activer efficacement les journalistes de la plaie ou de détecter la transcription induite par blessure. Pour laisser le temps à la collecte et l&#39;heure blessures se produisent pendant les heures de pointe de laboratoire, nous suivons un programme de collecte d&#39;embryons pendant 2 heures (16h00-18h00), échanger la plaque de collection avec une nouvelle plaque à 18h00, l&#39;âge la plaque de recouvrement à 25 ° C pendant 14 heures (la nuit), et enroulé les embryons à 08h00 (le lendemain). </li></ol> 2. Préparation d&#39;embryons Notes: Ce protocole comprend l&#39;utilisation de nombreux outils et objets tranchants ou faites de glass. Gérer tous les objets tranchants et les objets en verre avec soin pour éviter les blessures. <ol><li> Retirez délicatement les embryons à partir de plaques de collecte avec un pinceau en ajoutant 2-3 ml d&#39;eau à la plaque et tourbillonnant. Transférer de l&#39;eau et d&#39;embryons de l&#39;assiette au filet de nylon et le tube collecteur. </li><li> Ajouter 4-5 ml d&#39;eau de Javel à la coiffe d&#39;une Pétri de plat de plastique et laisser tremper l&#39;extrémité couverte de maille du tube contenant les embryons dans l&#39;eau de Javel pendant 2 min, ce qui supprime la coquille externe de l&#39;embryon. Faites tourner manuellement le tube de collecte une couple de fois pour empêcher les embryons de l&#39;agglutination dans l&#39;eau de Javel. Rincez embryons 10x de l&#39;eau et sécher le tube de collection de maille couverte contenant les embryons dechorionated sur une serviette en papier. </li><li> Utiliser une aiguille de dissection de transférer ~ 50 embryons de maille de nylon pour une plaque de gélose. Nous ajoutons de colorant alimentaire vert à la plaque de gélose pour ajouter du contraste et de l&#39;aide à l&#39;alignement de l&#39;embryon. Sous un microscope de dissection, faire deux rangées parallèles de ~ 25 embryons, l&#39;alignement de la Embryos sur le coulisseau de sorte qu&#39;ils seront à angles droits par rapport à l&#39;aiguille de ponction sur l&#39;appareil de micro-injection. Laisser un peu d&#39;espace (environ 1 longueur de l&#39;embryon) entre les embryons à des fins d&#39;échange de gaz. Les deux rangées parallèles devraient être d&#39;environ 5 mm. </li><li> Placez une lame à double bande de bâton sur des embryons alignés et appuyez délicatement sur la lame de transférer les embryons de la plaque verte à la diapositive. Puis sécher à l&#39;air les embryons ~ 25 min pour réduire la pression interne sur l&#39;embryon et empêcher une explosion quand blessant. </li><li> Placer 2-3 gouttes d&#39;halocarbures mélange d&#39;huile sur les embryons pour éviter une déshydratation. </li></ol> 3. Embryon Blessant <ol><li> Placer la lame d&#39;embryons dans la platine du microscope par injection. Trouver les embryons dans le champ de vision et la pratique de déplacer le stade du microscope inversé. Notes: Avant de travailler avec l&#39;aiguille, se concentrer sur plan médian de l&#39;embryon le long de l&#39;axe dorso-ventral. Pour permettre blessure efficace de laembryons alignés, commencent blessant la ligne plus proche de l&#39;appareil de l&#39;aiguille. Déplacez le stade pour apporter le haut de la ligne d&#39;embryons alignés dans le champ de vision. </li><li> Placez délicatement et garantir une aiguille tiré dans le porte-aiguille. Utilisez le micromanipulateur pour déplacer l&#39;aiguille vers le bas vers la diapositive. Aligner l&#39;aiguille avec l&#39;embryon, dans le même plan focal. Une fois que l&#39;aiguille est en discussion avec l&#39;embryon, ne déplacez pas l&#39;aiguille avec le micromanipulateur. </li><li> Déplacez le stade de l&#39;embryon percer de part en part, puis passer à la prochaine embryon dans la rangée. Lorsque vous avez terminé blessant la première ligne, utilisez le micromanipulateur pour déplacer l&#39;aiguille complètement et loin de la scène avant de passer la lame; tourner manuellement la lame de 180 ° et la plaie de la deuxième rangée. </li><li> Stocker les embryons dans l&#39;huile d&#39;halocarbures à la température ambiante et de procéder à la fixation embryon si cela hybridation in situ ou la coloration des anticorps dans (voir procédure de l&#39;étape 5). Sinon, stocker les embryons pour 4-6 heuresdans l&#39;huile d&#39;halocarbures et de procéder à des plaies visualisation rapporteur fluorescent transcription (de résultats représentatifs). Remarques: Pour la visualisation du rapporteur fluorescent, nous anesthésier les embryons à l&#39;aide de 50% de 1-phénoxy-2-propanol 13. Les embryons sont enlevés de l&#39;huile d&#39;hydrocarbure halogéné et on les place sur une nouvelle diapositive. Nous mettons perles de verre autour des embryons, ajouter quelques gouttes de l&#39;anesthésie, et placer un morceau de couverture sur les embryons. </li></ol> 4. Embryon microinjection Notes: L&#39;appareil de micro-injection que nous utilisons dans le protocole n&#39;est pas automatisé de livrer le volume spécifique pendant le test. Nous ajoutons un colorant à la solution de visualiser la micro-injection et d&#39;essayer de normaliser le volume livré. Si trop de solution est injectée dans l&#39;embryon, la membrane vitelline va éclater. <ol><li> aiguille de chargement à l&#39;arrière avec 1 pl de solution chimique, plus colorant (par exemple 0,6 MH 2 O 2). Autoriser capillairel&#39;action de tirer de la solution chimique à la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Pour casser une aiguille, placez une lamelle à un angle sur une lame et recouvrir le bord avec halocarbures mélange d&#39;huile. Apportez de l&#39;aiguille monté en discussion avec le bord de la lamelle inclinée et déplacez doucement bord lamelle sur la pointe de l&#39;aiguille jusqu&#39;à cassé. Appliquer une pression sur un appareil de micro-injection et vérifier que la solution chimique, plus colorant coule l&#39;aiguille. </li><li> Placez la diapositive contenant les embryons alignés sur la platine du microscope. Passez à concentrer l&#39;embryon et l&#39;aiguille dans le même plan. Simultanément percer et solution micro-injection chimique, plus teindre dans chaque embryon. Notes: aiguilles bouchés se produisent fréquemment; briser une nouvelle aiguille pour éviter la micro-injection incomplète. Une pointe d&#39;aiguille émoussée ne blesse le plus proprement une pointe de l&#39;aiguille inclinée. Réglage de la lamelle à un non-angle de 90 ° pendant la rupture est optimale pour produire une pointe de l&#39;aiguille inclinée. </li></ol> 5. Formaldéhyde Fixation Note: Les produits chimiques utilisés dans cette fixation drosophile sont nuisibles. Utiliser un équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité) lors de la manipulation des produits chimiques. Suivez les directives institutionnelles individuelles pour l&#39;élimination des produits chimiques réglementés. <ol><li> Après la blessure, attendre 15, 30, 60, ou plus de minutes pour l&#39;activation transcriptionnelle des gènes induite par la plaie de se produire. Pour supprimer des embryons à partir de diapositives d&#39;injection, égouttez les soigneusement le mélange d&#39;huile d&#39;halocarbures de la glisse, pencher la lame contre un rack et épongez la fin avec un Kimwipe. </li><li> Utiliser une pipette en verre pour rincer heptane sur la lame et laver le liquide de rinçage dans une boîte de Pétri en verre. Heptane va dissoudre la bande et de libérer les embryons. Continuer à rincer jusqu&#39;à ce que tous les embryons sont enlevés de la diapositive. Passez à la diapositive suivante, jusqu&#39;à ce que tous les embryons sont prélevés à partir de diapositives. </li><li> Transférer la heptane associé à une solution de l&#39;embryon de la boîte de verre dans 20 ml de sciencentillation flacon. Agiter le flacon pendant 2-3 min, retirer la heptane et ajouter 5 ml d&#39;heptane frais. </li><li> Ajouter 5 ml de solution fraîche, de fixation (voir la liste des réactifs pour la recette). Boucher le flacon et le joindre à une plate-forme agitation. Agiter le flacon contenant les embryons de 25 min à 220-230 rpm. </li><li> Après agitation, laisser les bulles à la pop de l&#39;interface. Supprimer complètement la phase aqueuse inférieure avec une pipette, évitant tirant les embryons. La couche inférieure est constituée de la solution de fixation et doit être éliminé correctement. </li><li> Ajouter 5 ml de méthanol, boucher le flacon et agiter vigoureusement à la main pendant 20-30 secondes, tourbillon et le placer sur le banc. Embryons blessés resteront à l&#39;interphase et ne seront pas couler au fond. Notes: Après fixation de la membrane vitelline d&#39;un embryon non lésée sera normalement de salve au cours de l&#39;étape de déshydratation avec du méthanol. Cependant, la membrane vitelline en un embryon blessé est déjà rompue et l&#39;étape de déshydratation ne supprime pas la memb vitellinerane. Main-devitellinzation est nécessaire pour achever le protocole de fixation. </li><li> Retirez délicatement la couche d&#39;heptane dessus et ajoutez 5 ml de méthanol frais alors. Agiter le flacon et les embryons doivent couler. </li><li> Retirer la solution de methanol plus embryon avec une pipette de transfert en verre et recueillir dans un tube de collecte de maille de nylon dans un plat en verre. </li><li> Retirez le méthanol et rincer les embryons avec une solution PBS 1x. </li><li> Transférer les embryons à partir de la maille de nylon pour une plaque de jus de pomme. Etaler les embryons le long de la surface de la plaque. </li><li> Transférer les embryons sur une lame de verre à double bande de bâton. Couvrir les embryons avec 1x PBS. Remarques: Les embryons ont tendance à s&#39;agglomérer à cause de la membrane vitelline. L&#39;utilisation d&#39;un jus de pomme lieu permet une séparation rapide des embryons agglomérées. Les embryons doivent être retirés de la plaque et transférées sur une lame de verre de l&#39;adhésif double face car les embryons s&#39;enfoncent dans la plaque de gélose lorsqu&#39;une force est appliquée pour enlever l&#39;embryon de l&#39;membrane vitelline. </li><li> Poussez doucement les embryons avec une aiguille de dissection de &quot;pop&quot; de la membrane vitelline. L&#39;embryon doit couler dans le PBS. </li><li> Utiliser une pipette en verre pour transférer l&#39;1x PBS plus des embryons à un tube de 1,5 ml. Rincer les embryons avec PBS 1x et conserver à 4 ° C. Passez à déshydrater les embryons en utilisant un mélange éthanol: la série de PBS et continuer avec l&#39;hybridation in situ ou protocole immunolocalisation 14. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Une réponse de régulation transcriptionnelle immédiate aux signaux externes permet aux cellules de coordonner une réponse localisée à des stimuli extracellulaires, qui peuvent inclure le stress, les dommages, ou d&#39;infection. Le contrôle abusif d&#39;une réponse localisée peut avoir des effets néfastes sur les cellules voisines, ainsi que d&#39;un gaspillage de ressources pour réparer le préjudice. L&#39;embryon de drosophile est un excellent système pour mener des expériences de cicatrisation des plaies de base dans un à entretenir facile organisme modèle peu coûteux et. Le potentiel de collaborations entre la recherche dans d&#39;autres organismes modèles et Drosophila offre une occasion unique d&#39;explorer de nombreuses questions biologiques. Une autre technique de reporters de la plaie est la combinaison génétique des mutants de milieux, en fournissant une méthode efficace pour tester la contribution de nouveaux gènes à l&#39;activation de la voie de réponse épidermique de la plaie. Nous avons épidermiques journalistes transcription induite plaies avDISPONIBLES à la fois sur la 2 ème et 3 ème chromosomes 5. Dans cette étude, nous utilisons SAMU et des systèmes de GAL4 de la surexpression 16. Pour les études avec des allèles mutants létaux nous déterminons le fond génétique utilisant un chromosome d&#39;équilibrage fluorescent, par exemple Kruppel-GFP 17. Nous avons analysé la localisation blessure de journaliste dans plusieurs fonds génétiques (tableau 1). Une modification possible de la technique est de combiner la micro-injection et blessures. La micro-injection peut être utilisée pour introduire une solution chimique dans l&#39;embryon. Plusieurs composés chimiques ont été testés et ont été trouvés à réglementer l&#39;activité des journalistes épidermique de la plaie 9. Cette méthode de la blessure et la micro-injection simultanée peut être utile d&#39;augmenter le nombre de cellules dans l&#39;embryon de drosophile qui répondent un signal de la plaie et peut être directement utilisé pour surveiller les changements d&#39;expression génique après la blessure 18. Une application future de la technique de micro-injection sera de tester de nouveaux produits chimiques pour la régulation de la réponse épidermique de la plaie. Drosophile comme système modèle pour les études génétiques propose une large gamme de protocoles simples pour répondre efficacement à des questions complexes. Les récents rapports sur la faisabilité des techniques de Drosophila souligne l&#39;utilisation de la migration des hémocytes 19 et l&#39;infection de guêpe parasite 20 comme un moyen d&#39;élargir encore davantage l&#39;impact de la communauté de recherche drosophile. En plus des études de cicatrisation des plaies, la drosophile est un modèle classique pour la régénération avec le système de disque imaginai 21,22. Les progrès combinés à imaginaux études de régénération de disque et ponction / microinjection blessure fournit un excellent système pour découvrir les composants bien conservées de la réparation des tissus.

La manipulation d&#39;embryons de Drosophila en utilisant une technique de micro-injection est un dosage bien établi 1. L&#39;importance de la méthode épidermique plaie réponse rapporteuse est de combiner le protocole pour la perforation / une micro-injection avec les reporters fluorescents et de visualiser in vivo une réponse à une lésion de l&#39;épiderme dans les embryons de Drosophila. Le but de cette méthode est de permettre à un plus large éventail de scientifiques à utiliser la drosophile comme un outil pour étudier les processus qui régulent la réponse transcriptionnelle des blessures épidermique de ponction. L&#39;épiderme seule couche chez la drosophile fournit un système simple à étudier une réponse épidermique de la plaie après une blessure perforante 2. L&#39;embryon de drosophile est un système de modèle robuste pour disséquer génétiquement les stades de la cicatrisation des plaies, y compris la réponse des plaies, l&#39;inflammation et la réépithélialisation 3. C&#39;est en partie parce que beaucoup ou la plupart des mutants zygotiques survivent à la fin de embryogenesest et de développer des barrières épidermiques, même si la structuration de développement va profondément mal. La caractérisation précédente d&#39;un facteur de transcription tête bien conservée grenue (Grh), identifiés que les gènes Grh-cibles Dopa décarboxylase (DDC) et la tyrosine hydroxylase (exemple) sont la transcription activés autour des sites de lésion 4. Drosophile comme un organisme modèle pour la réponse de la plaie fournit une ligne complémentaire d&#39;enquête pour faire progresser les études chez les mammifères cicatrisation 5. Des études ultérieures ont identifié des gènes supplémentaires induites par la plaie de drosophile et développé une «boîte à outils» de nombreux journalistes de la plaie fluorescents pour suivre in vivo épidermique réponse dans la plaie pour nettoyer blessant 6. Des rapports récents sur la réglementation de la guérison des plaies chez la drosophile ont porté sur le phénotype de fermeture de plaie, permettant la découverte de nombreuses voies de régulation la migration des cellules 7,8. Avec l&#39;analyse de l&#39;journalistes de la plaie fluorescentes, nos études ont identifié une nouvelle série de gènes nécessaires à l&#39;expression localisée de l&#39;épiderme inductibles par une blessure gènes 9. L&#39;un des mérites de la méthode réaction à la blessure de journaliste, c&#39;est que les résultats fournissent plus de perspicacité dans un mécanisme de comment les signaux sont transduction du site de la lésion aux cellules voisines. Cependant, un des inconvénients de la méthode réaction à la blessure de journaliste, c&#39;est que les résultats ne renvoient directement à des phénotypes pas dans la guérison ou la cicatrisation des plaies. Utilisation plus large du protocole piqûre propre dans les écrans génétiques et chimiques permettra de nouveaux régulateurs de la réponse transcriptionnelle à épidermique blessant être identifiés et d&#39;autres la traduction de cicatrisation des plaies découvertes dans les modèles de mammifères de traitements de blessures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">yeast</td>
			<td style="width:124px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">51475</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apple juice</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-824-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenoxy-2-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">toluidine blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, 16%</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18814-20</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H360-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:121px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila incubator</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fly cage</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">embryo collection tube</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>46-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double-stick tape</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissection needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-965A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass cover slip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4445</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capillary needle</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microinjection needle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MINJ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Primo-Vert</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-063-172</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfer bulb</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scintillation vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-259-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fixation solution</td>
			<td>(5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% formaldehyde</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td></td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halocarbon oil mix</td>
			<td>(10 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in drosophila embryos.

L&#39;embryon de drosophile développe une couche épidermique robuste qui sert à la fois pour protéger les cellules internes d&#39;un environnement externe exigeants ainsi que pour maintenir l&#39;homéostasie cellulaire. Blessure de ponction avec des aiguilles de verre fournit une méthode directe pour déclencher une réponse rapide de la plaie de l&#39;épiderme qui active la transcription, la plaie reporters qui peuvent être visualisées par un signal du gène rapporteur localisé dans les embryons ou les larves vivantes. Ponction ou laser blessure fournit également des signaux qui favorisent le recrutement des hémocytes au site de la plaie. Étonnamment, sévère (par et à travers) les blessures de ponction dans les embryons à un stade avancé perturbe que très rarement le développement embryonnaire normal, que plus de 90% de ces embryons blessés survivent à l&#39;âge adulte lorsque les embryons sont injectés dans un milieu d&#39;huile qui minimise les fuites immédiate de l&#39;hémolymphe des sites de ponction . La procédure de la plaie exige de micromanipulation sur des embryons de drosophile, y compris l&#39;alignement manuel des embryons sur agplaques d&#39;ar et le transfert des embryons alignés sur des lames de microscope. Le dosage de la réponse épidermique de la plaie Drosophila fournit un système rapide pour tester les exigences génétiques d&#39;une variété de fonctions biologiques qui favorisent la cicatrisation des plaies, ainsi que d&#39;un moyen pour cribler des composés chimiques potentiels qui favorisent la cicatrisation des plaies. Le cycle de vie court et facile routine de culture font la drosophile un modèle de l&#39;organisme puissant. Drosophila propre cicatrisation semble coordonner l&#39;épiderme réponse régénérative, avec la réponse immunitaire innée, de façons qui sont encore à l&#39;étude, qui fournit un excellent système pour trouver conservée réglementaire des mécanismes communs pour la drosophile et les mammifères épidermique blessures.

Pour obtenir les résultats présentés dans le présent procédé, le bâti de la protéine fluorescente verte (GFP) de lecture ouvert est fusionné à un / séquence d&#39;activateur de promoteur induit bobiné à partir de la dopa décarboxylase (DDC) et la DsRed est fusionnée à une séquence plaie activatrice de la tyrosine hydroxylase ( exemple) 4,6. Dans un embryon de drosophile en direct, la maturation de la protéine rapporteur fluorescent plaie est optimal 4-6 h après la blessure, ce qui laisse du temps pour l&#39;accumulation de la protéine suffisante pour visualiser, ainsi que le temps pour la protéine fluorescente à oxyder à l&#39;état fluorescent 15. Pour observer la localisation de journaliste, un microscope à fluorescence composé est suffisante. Pour observer un plus fort grossissement de la localisation de reporter, un microscope confocal est optimal pour générer une projection maximale de multiples sections optiques (figure 1). Confocale imagerie in vivo d&#39;embryons de drosophile est compliquée par le rapid ondulations de l&#39;embryon. . Une vue complète de l&#39;embryon peut être obtenue avec 20X objectif et une vue en gros plan d&#39;un site de la plaie peut être obtenue avec objectif 40x. Une vue de dessus épidermique blessure reporter localisation peut être imagée avec 10 sections optiques 1 um successives. Un latérale vue de l&#39;épiderme blessure reporter localisation peut être visualisée à l&#39;aide de 40 successives 1 um sections optiques. En utilisant des méthodes de croisement génétique standard, il est possible de combiner les journalistes de la plaie avec des mutations génétiques. Un exemple présenté dans cet article est Flotillin-2 (Flo-2), en raison de gain de fonction (surexpression généré avec l&#39;expression omniprésente dans toutes les cellules) mutants perte de fonction (allèle nul générée à l&#39;insertion P-élément) et de flo-2 démontrent le produit du gène Flo-2 est nécessaire et suffisante pour inhiber la localisation de la GFP-Ddc enroulé reporters 9 (Figures 2A et 2B). Utilisation de la microinjection protocole, il est possible de tester si l&#39;introduction de solutions chimiques superactivates ou inhibe la localisation de reporters de la plaie. Embryons chimiquement blessés ont été simultanément blessés et injectés avec un rapport de 1:4 de 1% toluidine colorant bleu et composés solubilisés. Un colorant bleu de toluidine autorisé pour confirmation visuelle des composés solubilisés étant injectés dans la cavité du corps. embryons de contrôle ont été blessés avec une aiguille brisée contenant 1:4 de 1% toluidine colorant bleu et soluté sans produit chimique. Deux exemples présentés dans ce document sont le peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) et le méthyl-β-cyclodextrine (MβCD), parce que les deux solutions chimiques sont suffisantes pour activer globalement la localisation de la DDC-GFP enroulé journalistes 9 (figures 2C et 2D) . Le peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) a été dilué dans H 2 O à 0,6 M. méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) a été solubilisé dans une mM NaOH à 3 mM. En utilisant le protocole embryon de fixation, il est possible de détecter l&#39;activation de la transcription des gènes de la réponse enroulés dans un domaine localisé, entourant une plaie. Un exemple présenté dans cet article est l&#39;hybridation in situ de sondes d&#39;ARN pour détecter Ddc et transcriptions ples 4,6,9 (figures 3A et 3B). <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. Ddc-GFP et plé-DsRed enroulés journaliste localisation. Brightfield et images fluorescentes dans blessés embryons de type sauvage. (A) Haut-vue de DDC-rapporteur GFP plaies. (B) Haut-vue de plé-DsRed enroulés journaliste. Toutes les images ont été recueillies sur un Leica SP2 microscope confocal, avec 20X objectif. Les flèches marquent le site de la plaie. Les lignes pointillées dans le panneau de donnéess marquent les contours d&#39;embryons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Figure 2. Localisation de la journaliste Ddc-GFP enroulé en milieux mutants génétiques et chimiques micro-injection d&#39;embryons. Clair et images fluorescentes de blessés Flotillin-2 (Flo-2) embryons mutants. (A) Perte de fonction Flo-2 {} KG00210 mutants, expansion de l&#39;activité de journaliste dans toutes les cellules de l&#39;épiderme. (B) Gain de fonction Flo-2 (tatou-GAL4, SAMU-Flo2) mutants, l&#39;inhibition de l&#39;activité de journaliste dans toutes les cellules de l&#39;épiderme. (C) de peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2 ) micro-injection de la solution, l&#39;expansion de reporter activité tout au long de l&#39;ensemble des cellules de l&#39;épiderme. (D) méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) la micro-injection de la solution, l&#39;expansion de l&#39;activité du rapporteur dans toutes les cellules de l&#39;épiderme. Toutes les images ont été recueillies sur un Leica SP2 microscope confocal, avec 20X objectif. Les flèches marquent le site de la plaie. Les lignes pointillées dans les panneaux de données marquent les contours d&#39;embryons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Figure 3. Détection de réponse de la plaie transcrits d&#39;ARN du gène. Des images fluorescentes d&#39;hybridation in situ et la détection de l&#39;ARN dans des blessés embryons de type sauvage. DDC (A) et exemple (B) des transcrits d&#39;ARN s&#39;accumulent autour du site de la plaie. Toutes les images sont la collecteted sur un Leica SP2 microscope confocal, avec l&#39;objectif 20X. Les flèches marquent le site de la plaie. Les lignes pointillées dans les panneaux de données marquent les contours d&#39;embryons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Tableau 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tableau 1. Résumé des journalistes de réponse épidermique de la plaie. Insertions des journalistes quatre d&#39;intervention de la plaie (DDC, exemple, msn, KKV) sont disponibles sur les deuxième et troisième chromosomes. Tous les journalistes de réponse de la plaie activer le gène de fluorescence (GFP ou DsRed) dans un nombre limité de cellules épidermiques entourant le site de la lésion de ponction dans le type sauvage fond (par exemple de phénotype &quot;locale&quot;). Journalistes de réponse Ddc et msn plaies exigent Grh pour activation de la fluorescgène CE après la ponction blessures (ex: &quot;none&quot; phénotype). Tous les journalistes de la plaie nécessitent Flo-2 pour la localisation du gène de fluorescence après ponction blessures (par exemple de phénotype &quot;globale&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos. at JoVE.com

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

L&#39;épiderme embryonnaires d&#39;embryons de drosophile au stade très tardif fournit un système in vivo pour l&#39;analyse rapide de réponse ponction de la plaie et peuvent être combinés à des manipulations génétiques de micro-injection ou de traitements chimiques, pour faire avancer les études dans la cicatrisation des plaies pour la traduction dans les modèles de mammifères.

Microinjection plaies dosage et<em&gt; In vivo</em&gt; Localisation des épidermique plaies Reporters réponse dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

12.4K vues.  The City College of New York.  L'épiderme embryonnaires d'embryons de drosophile au stade très tardif fournit un système in vivo pour l'analyse rapide de réponse ponction de la plaie et peuvent être combinés à des manipulations génétiques de micro-injection ou de traitements chimiques, pour faire avancer les études dans la cicatrisation des plaies pour la traduction dans les modèles de mammifères. 

Vidéo: Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

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Bio-ingénierie

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantification de Global diastolique fonction de l&#39;analyse basée sur la modélisation cinématique de transmitral débit via le formalisme de remplissage diastolique paramétrée

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of cutaneous wound healing on the skin. Existing methods, however, still rely on visual inspections through various microscopic tools and devices that normally include high-cost, sophisticated systems and require well trained personnel for operation and data analysis. Here, we describe methods and protocols to fabricate a conformal, skin-like electronics system that enables conformal lamination to the skin surface near the wound tissues, which provides recording of high fidelity electrical signals such as skin temperature and thermal conductivity. The methods of device fabrication provide details of step-by-step preparation of the microelectronic system that is completely enclosed with elastomeric silicone materials to offer electrical isolation. The experimental study presents multifunctional, biocompatible, waterproof, reusable, and flexible/stretchable characteristics of the device for clinical applications. Protocols of clinical testing provide an overview and sequential process of cleaning, testing setup, system operation, and data acquisition with the skin-like electronics, gently mounted on hypersensitive, cutaneous wound and contralateral tissues on patients.

This article presents methods to fabricate and characterize a conformal, skin-like electronic system and protocols for the use in clinical applications, particularly on cutaneous wound management.

Fabrication et caractérisation d&#39;un système électronique conforme de la peau comme pour la gestion quantitative, cutanée plaies

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

L&#39;étude de la Stœchiométrie Epidermal Growth Factor Receptor dans des cellules intactes en utilisant la microscopie corrélative

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rigide incrustation du fixe et tachée, ensemble, échelle millimétrique spécimens pour histologie exempt de Section 3D de Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Manipulation de cellules souches neurales et de neurones dans les tranches de cerveau à l’aide de microinjection robotique

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...