פרוטוקול זה פותח בשיתוף פעולה עם חברים קודמים של המעבדה מקגיניס, קים א מייס ויוסף ג פירסון. אנו מודים להמשך מאמצים על ידי מרכז מניות דרוזופילה Bloomington עבור עבודתם לארגן ולהפיץ מניות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM077197 וK12 GM68524) ומשפחתו של הרברט שטרן. MTJ נתמכת כיום על ידי גרנט מספר 5G12RR003060-26 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר וגרנט מספר 8G12MD7603-27 מהמכון הלאומי לבריאות מיעוט ופערים בבריאות. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי על פערים בבריאות ובריאות מיעוט או המכון הלאומי לבריאות.

פרוטוקול הפצע העוברי דרוזופילה ניתן לסכם בחמישה שלבים: (1) אוסף עובר, (2) עובר הכנה (3) העובר פציעה, (4) Microinjection עובר, ו( 5) קיבוע עובר. 1. אוסף עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף זבובים בוגרים, 2-3 ימים לאחר eclosing, להוסיף 50 נקבות וזכרים 25 לכלוב אוסף עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח אגר טרי תפוחי מיץ בתוספת שמרי צלחת בכל בוקר במשך 3 ימים. הערות: לאוסף עובר אופטימלי, מחזור הזבובים על לוח זמנים יומי שעות 12 בחממה 25 ° C (05:00 אורות &quot;ON&quot; ו -17:00 אורות &quot;OFF&quot;); זבובים נשיים להגיב לשינויים במחזור האור ו יפקיד כמויות גדולות יותר של ביצים במתג אורות &quot;ON&quot; לאורות &quot;OFF&quot; 10,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעתי אחר הצהריים של יום 3, במקום מיץ טרי תפוח בתוספת צלחת אגר שמרים על הכלוב ולאסוף עובר במשך שעה 2. הנח שמרי צלחת חדשה בכלוב ולשמור2 צלחת אוסף משאבי אנוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את צלחת האוסף ל14 שעות נוספות ב ° C25 לגיל העוברים. הערות: ריפוי פצע יכול להיות assayed בכל שלב במהלך פיתוח דרוזופילה, יש לי כתבי תעתיק מושרה הפצע המתואר במאמר זה פעילות אופטימלית בין שלבי 15-16 דצמבר. בשלב מאוחר 17, העובר הוא זקן מדי כדי לחדור בקלות לציפורן ההתבגרות וביעילות להפעיל את כתבי פצע או לזהות שעתוק מושרה פצע. כדי לאפשר את זמן האיסוף וזמן הפציעה להתרחש במהלך מעבדה שעות שיא, אנו עוקבים אחר לוח זמנים של אוסף עובר במשך שעה 2 (16:00-18:00), להחליף את צלחת האוסף עם צלחת חדשה בשעת 18:00, גיל צלחת האוסף ב25 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות (לילה), ופצע העוברים בשעה 08:00 (למחרת). </li></ol> 2. הכנת עובר הערות: פרוטוקול זה כולל את השימוש בכלים רבים וחפצים שאינם חדים או עשוי gילדה. לטפל בכל המכשירים החדים וחפצי זכוכית בזהירות כדי למנוע פגיעה בגוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות עוברים מצלחות אוסף עם מכחול על ידי הוספת 2-3 מיליליטר מים לצלחת ומתערבל. העבר את המים ועוברים מצלחת לרשת ניילון וצינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 4-5 מיליליטר של אקונומיקה לכובע של צלחת פטרי צלחת פלסטיק ולספוג סוף המכוסה הרשת של צינור האוסף המכיל את העוברים באקונומיקה למשך 2 דקות, אשר מסיר את קליפת הביצה החיצונית של העובר. באופן ידני לסובב את צינור האיסוף כמה פעמים כדי למנוע מעוברים שהלם באקונומיקה. יש לשטוף את העוברים עם 10x מים ולייבש את צינור איסוף הרשת מכוסה המכיל את עוברי dechorionated על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באיזמל מנתחים להעביר ~ 50 עוברים מרשת הניילון לצלחת אגר. אנו מוסיפים צבע מאכל ירוק לצלחת אגר להוסיף קונטרסט וסיוע ביישור עובר. תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות שתי שורות מקבילות של ~ 25 עוברים, יישור אמברימערכת הפעלה בשקופית, כך שהם יהיו בזווית ישרה למחט לנקב על מנגנון microinjection. השאר מעט מקום (כ 1 עובר אורך) בין העוברים לצורכי חילוף גזים. שתי שורות מקבילות צריכים להיות כ 5 מ&quot;מ זה מזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית עם קלטת כפולה מקל על גבי העוברים המיושרים ובזהירות לחץ על השקופיות להעברת עוברים מהצלחת הירוקה לשקופית. ואז אוויר יבש עובר ~ 25 דקות כדי להפחית את הלחץ פנימי על העובר ולמנוע פרץ כשפצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 2-3 טיפות של תערובת שמן halocarbon על העוברים על מנת למנוע התייבשות נוספת. </li></ol> 3. עובר פציעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף העובר בשלב מיקרוסקופ ההזרקה. מצא את העוברים בשדה הראייה ולתרגל להזיז את הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה. הערות: לפני העבודה עם המחט, להתמקד במישור אמצע העובר לאורך ציר dorsoventral. כדי לאפשר לפציעתם יעילה שלעוברים מיושרים, מתחילים פוצעים השורה קרובה יותר למנגנון המחט. הזז את הבמה כדי להביא את החלק העליון של השורה של עוברים מיושרים לשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום ולהבטיח את משך מחט בבעל המחט. השתמש micromanipulator להזיז את המחט לכיוון שקופיות. יישר את המחט עם העובר, באותו מישור מוקד. ברגע שהמחט נמצאת בפוקוס עם העובר, לא להזיז את המחט עם micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבמה כדי לנקב את העובר ולפנים, ולאחר מכן לעבור לעובר הבא בשורה. כאשר נעשה פצעו את השורה הראשונה, השתמש בmicromanipulator להזיז את המחט לגמרי, הרחק מהבמה לפני שעברתי את השקופית; ידני לסובב את השקופית 180 ° ופצע בשורה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את העוברים תחת שמן halocarbon בטמפרטורת חדר ולהמשיך עם קיבעון עובר אם עושה הכלאה באתרו או מכתים נוגדן (ראה שלב נוהל 5). לחלופין, לאחסן את העוברים ל4-6 שעותתחת שמן halocarbon ולהמשיך בויזואליזציה פצע תעתיק כתב ניאון (נציג תוצאות). הערות: לקבלת ההדמיה של כתב הניאון, אנחנו מרדימים את העוברים באמצעות 50% 1-phenoxy-2-propanol 13. העוברים יוסרו משמן halocarbon והניחו בשקופית חדשה. אנחנו שמים חרוזי זכוכית סביב העוברים, להוסיף כמה טיפות של חומר ההרדמה, ולמקם את תלוש לכסות על העוברים. </li></ol> 4. Microinjection עובר הערות: מנגנון microinjection שאנו משתמשים בפרוטוקול אינו אוטומטי כדי לספק נפח מסוים במהלך assay. אנו מוסיפים צבע לפתרון כדי להמחיש את microinjection ולנסות לנרמל את הנפח נמסר. אם יותר מדי פתרון מוזרק לתוך העובר, קרום vitelline יתפוצץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט עומס מאחור עם 1 μl של תמיסה כימית בתוספת צבע (למשל 0.6 MH 2 O 2). לאפשר נימיםפעולה כדי לצייר את הפתרון הכימי לקצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את מחט, במקום להחליק כיסוי בזווית בשקופית ומעיל הקצה עם תערובת שמן halocarbon. להביא את המחט רכוב אל מוקד עם קצה להחליק את המכסה בזווית ובעדינות להעביר קצה לכסות להחליק על פני קצה המחט עד שבורה. להפעיל לחץ על מנגנון microinjection ולבדוק כי הפתרון הכימי בתוספת הצבע זורם החוצה את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף המכיל עובר מיושרים על הבמה מיקרוסקופ. המשך למקד את העובר ואת המחט באותו המטוס. במקביל לנקב ותמיסה כימית microinject בתוספת צבע לתוך כל עובר. הערות: מחטי סתימה מתרחשות בתדירות גבוהה; לשבור מחט חדשה, כדי למנוע microinjection שלם. קצה מחט בוטה אינו פצע כמו נקי ככל קצה מחט בזווית. התאמת coverslip להלא 90 ° זווית במהלך השבירה היא אופטימלית לייצר קצה מחט בזווית. </li></ol> 5. Fi פורמלדהידxation הערות: הכימיקלים המשמשים לקיבוע דרוזופילה זה מזיקים. יש להשתמש בציוד מגן אישי (למשל, כפפות, מעיל מעבדה, ומשקפי בטיחות) בעת טיפול בכימיקלים. פעל לפי הנחיות מוסדיות פרט לסילוק של כימיקלים מוסדרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פציעתו, חכה 15, 30, 60, או יותר דקות להפעלת תעתיק של גנים מושרה פצע כדי להתעורר. כדי להסיר עוברי משקופיות הזרקה, לנקז בזהירות את תערובת שמן halocarbon מהשקופיות, להישען השקופיות נגד מתלה ולמחוק את הסוף עם Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית לשטוף heptane על השקופית ולשטוף את נוזל השטיפה לתוך צלחת פטרי זכוכית. Heptane יהיה לפזר את הקלטת ולשחרר את העוברים. תמשיך לשטוף עד שכל העוברים יוסרו מן השקופיות. המשך לשקופית הבאה, עד שכל העוברים יוסרו משקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את heptane בתוספת פתרון עובר מצלחת הזכוכית למדע 20 מיליליטרבקבוקון ntillation. נער את הבקבוקון ל2-3 דקות, להסיר את heptane ולהוסיף 5 מיליליטר של heptane הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של תמיסה טרי, קיבעון (ראה רשימת חומרים כימיים למתכון). מכסה את הבקבוקון ולצרף ייקר פלטפורמה מסלולית. נער את הבקבוקון המכיל את העוברים ל25 דקות ב220-230 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלחץ, בואו הבועות בפופ הממשק. להסיר לחלוטין את השלב התחתון, מימית עם טפטפת, הימנעות מושכת את העוברים. השכבה התחתונה מורכבת מפתרון הקיבעון וצריכה להיות מסולקת כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של מתנול, מכסה את הבקבוקון ולנער במרץ ביד ל20-30 שניות, מערבולת ולמקם אותו על הספסל. עוברים פצועים יישארו בשלבי ביניים ולא לשקוע בתחתית. הערות: לאחר קיבוע קרום vitelline של עובר unwounded יהיה בדרך כלל פרץ במהלך שלב ההתייבשות עם מתנול. עם זאת, קרום vitelline בעובר פצוע כבר נשבר וצעד ההתייבשות לא יסיר את memb vitellineRANE. יד devitellinzation נדרש כדי להשלים את פרוטוקול הקיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את שכבת heptane העליונה ולאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר של מתנול הטרי. נער את הבקבוקון ואת העוברים צריכים לשקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתנול בתוספת פתרון עובר עם טפטפת העברת זכוכית ולאסוף בצינור איסוף רשת ניילון בצלחת זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתנול ולשטוף את העוברים עם פתרון 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים מרשת הניילון לצלחת מיץ תפוחים. מורחים את העוברים החוצה על פני השטח של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים לשקופית זכוכית סרט דו מקל. כסה את העוברים עם 1x PBS. הערות: העוברים נוטים גוש בגלל קרום vitelline. שימוש במקום מיץ תפוחים מאפשר הפרדה מהירה של העוברים בכבדות. העוברים יש להסיר מן הצלחת והועברו לשקופית זכוכית קלטת מקל כפול משום שעוברים לשקוע בצלחת אגר כאשר הכוח מוחל כדי להסיר את העובר מןקרום vitelline. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף בזהירות את העוברים עם מחט לנתח ל&quot; פופ &quot;קרום vitelline. העובר צריך לשקוע בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית להעביר PBS 1x בתוספת עובר לצינור 1.5 מיליליטר. יש לשטוף את העוברים עם 1x PBS ולאחסן ב 4 ° C. המשך ליבש את העוברים באמצעות אתנול: סדרת PBS וימשיך עם הכלאה באתר או בפרוטוקול immunolocalization 14. </li></ol>

<ol>
	<li>Germeraad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+in+Drosophila+by+microinjection+of+DNA.">Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA.</a> Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).</li><li>Payre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+epidermis+differentiation+in+Drosophila.">Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epidermal+barrier+wound+repair+pathway+in+Drosophila+is+mediated+by+grainy+head.">An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head.</a> Science. 308 (5720), 381-385 (2005).</li><li>Ting, S. B., Caddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+Drosophila+grainy+head+is+essential+for+epidermal+integrity+in+mice.">A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice.</a> Science. 308 (5720), 411-413 (2005).</li><li>Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, &. #. 2. 1. 6. ;., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+transcription+factor+codes+activate+epidermal+wound-response+genes+in+Drosophila.">Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).</li><li>Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+in+Drosophila+melanogaster+uncovers+a+novel+set+of+genes+required+for+embryonic+epithelial+repair.">Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair.</a> Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).</li><li>Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+UAS-RNAi+screen+in+Drosophila+larvae+identifies+wound+closure+genes+regulating+distinct+cellular+processes.">A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes.</a> Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).</li><li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duox,+Flotillin-2,+and+Src42A+are+required+to+activate+or+delimit+the+spread+of+the+transcriptional+response+to+epidermal+wounds+in+Drosophila.">Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila.</a> PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+light+condition+modification+on+the+circadian+rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+Drosophila+melanogaster.">Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+photoperiod+ld+12:12+of+Drosophila+melanogaster.">Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster.</a> Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).</li><li>Pierre, S. E., Thurmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyBase+101+-+the+basics+of+navigating+FlyBase.">FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase.</a> Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).</li><li>Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Phenoxy-2-propanol+is+a+useful+anaesthetic+for+gastropods+used+in+neurophysiology.">1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology.</a> J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846 (2004).</li><li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Drosophila+transgenic+reporters:+insulated+P-element+vectors+expressing+fast-maturing+RFP.">New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP.</a> BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Casso, D., Ram&#237;rez-Weber, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).</li><li>Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+proteolytic+pathway+activation+reveals+an+expanded+ensemble+of+wound+response+genes+in+Drosophila.">Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila.</a> PloS one. 8 (4), e61773 (2013).</li><li>Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+melanogaster+embryonic+hemocyte+migrations.">Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations.</a> J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).</li><li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response.">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).</li><li>Repiso, A., Berganti&#241;os, C., Corominas, M., Serras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+repair+and+regeneration+in+Drosophila+imaginal+discs.">Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs.</a> Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).</li><li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+transdetermination+in+Drosophila+imaginal+discs.">Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs.</a> Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תגובת רגולציה תעתיק מיידית לרמזים חיצוניים מאפשרת לתאים כדי לתאם את תגובה מקומית לגירויים תאיים, אשר יכול לכלול מתח, נזק, או זיהום. השליטה לא נכונה של תגובה מקומית יכולה להיות השפעה מזיקה על תאי שכנים, כמו גם בזבוז של משאבים כדי לתקן את הפציעה. עובר דרוזופילה מספק מערכת מצוינת לבצע ניסויי ריפוי פצע בסיסיים באורגניזם מודל-to-לשמור קל זול ו. הפוטנציאל לשיתופי פעולה בין המחקר באורגניזמים מודל אחרים ודרוזופילה מספק הזדמנות ייחודית לחקור שאלות רבות ביולוגיות. טכניקה נוספת של כתבי הפצע היא שילוב הגנטי של רקע מוטציה, המספקת שיטה יעילה לבדיקת תרומתם של גנים חדשים להפעלה של מסלול תגובת הפצע באפידרמיס. יש לנו כתבי תעתיק מושרה פצע אפידרמיס אבailable בשני nd 2 ו 3 rd כרומוזומים 5. במחקר זה אנו משתמשים בכלי טייס ומערכות GAL4 של ביטוי יתר 16. ללימודים עם אללים מוטציה קטלניים אנו קובעים רקע הגנטי באמצעות כרומוזום איזון ניאון, למשל Kruppel-GFP 17. יש לנו ניתחנו את לוקליזציה כתב פצע בכמה רקע גנטי (טבלה 1). שינוי אפשרי של הטכניקה הוא לשלב microinjection ופציעתם. Microinjection ניתן להשתמש כדי להציג את הפתרון כימי לעובר. כמה תרכובות כימיות נבדקו ונמצאו להסדיר את פעילותם של כתבי פצע אפידרמיס 9. שיטה זו של פציעה וmicroinjection בו זמנית יכולה להיות שימושית כדי להגדיל את מספר התאים בעובר דרוזופילה שיגיב אות פצע וניתן להשתמש בם ישירות כדי לעקוב אחר שינויי ביטוי גנים לאחר פצע 18. יישום עתידי של טכניקת microinjection יהיה לבחון כימיקלים חדשניים לויסות תגובת הפצע באפידרמיס. דרוזופילה כמערכת מודל למחקרים גנטיים מציעה מגוון רחב של פרוטוקולים פשוטים כדי לטפל ביעילות בשאלות מורכבות. הדיווחים אחרונים על ההיתכנות של טכניקות דרוזופילה מדגיש את השימוש של הגירת hemocyte 19 וזיהום הצרעה טפילית 20 כאמצעי להרחבת השפעתה של קהילת מחקר דרוזופילה נוספת. בנוסף ללימודי תיקון פצע, דרוזופילה מספקת מודל קלאסי להתחדשות עם מערכת הדיסק דמותי 21,22. ההתקדמות בשילוב במחקרי התחדשות דיסק דמותי ופציעה לנקב / microinjection מספקת מערכת מצוינת לגלות רכיבים נשמרים היטב של תיקון רקמות.

מניפולציה של עוברי דרוזופילה בטכניקת microinjection היא assay מבוסס היטב 1. המשמעות של שיטת כתב תגובת פצע אפידרמיס היא לשלב את הפרוטוקול ללנקב / microinjection עם כתבי ניאון ולדמיין תגובת in vivo לפגיעה באפידרמיס בעוברי דרוזופילה. מטרתה של שיטה זו היא לאפשר למגוון רחב יותר של מדענים להשתמש דרוזופילה ככלי לחקור את התהליכים המווסתים את תגובת תעתיק לפציעה לנקב באפידרמיס. האפידרמיס חד שכבתי בדרוזופילה מספק מערכת פשוטה ללמוד תגובת פצע אפידרמיס לאחר פציעה לנקב 2. עובר דרוזופילה הוא מערכת מודל חזקה גנטי לנתח את השלבים של תיקון פצע, לרבות תגובת פצע, דלקת, וreepithelialization 3. מדובר בין שאר משום שרבים או zygotic רוב מוטציות לשרוד עד סוף embryogenesהוא ולפתח מחסומי אפידרמיס גם כאשר דפוסים התפתחותיים הולך עמוק השתבש. אפיון קודם של ראש נשמרים היטב גורם שעתוק מגורען (Grh), זיהה כי גנים Grh יעד decarboxylase דופא (DDC) וhydroxylase טירוזין (ple) מופעלים תעתיק מסביב לאתרים של פגיעה 4. דרוזופילה כאורגניזם מודל לתגובת פצע מספק קו משלים של חקירה כדי לקדם מחקרים בריפוי פצע יונקים 5. מחקרים מאוחרים יותר זיהו גנים הנגרמים פצע דרוזופילה נוספים ופיתחו &quot;ארגז כלים&quot; של רבים כתבי פצע ניאון כדי לפקח על in vivo תגובת פצע אפידרמיס לנקות פצע 6. דיווחים אחרונים על הרגולציה של ריפוי פצע דרוזופילה התמקדו בפנוטיפ סגירת פצע, ומאפשרים גילוי של מסלולים רבים המסדירים תא הגירה 7,8. עם הניתוח שלכתבי פצע ניאון, המחקרים שלנו זיהו סט רומן של גנים הנדרשים לביטוי המקומיים של גנים פצע מושרה אפידרמיס 9. אחד היתרונות של שיטת כתב תגובת הפצע הוא שהתוצאות מספקות תובנה רבה יותר על מנגנון של כמה אותות transduced מהאתר של פגיעה בתאים השכנים. עם זאת, אחד החסרונות של שיטת כתב תגובת הפצע הוא שהתוצאות לא לקשר ישירות לפנוטיפים בריפוי או תיקון פצע. שימוש רחב יותר של הפרוטוקול לנקב פצע הנקי במסכים גנטיים וכימיים יאפשר רגולטורים חדשים של תגובת תעתיק לאפידרמיס ופצעו להיות מזוהים ולקדם את התרגום של תגליות ריפוי פצע לתוך מודלים של יונקים של טיפולי פציעה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">yeast</td>
			<td style="width:124px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">51475</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apple juice</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-824-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenoxy-2-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">toluidine blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, 16%</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18814-20</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H360-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:121px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila incubator</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fly cage</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">embryo collection tube</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>46-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double-stick tape</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissection needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-965A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass cover slip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4445</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capillary needle</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microinjection needle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MINJ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Primo-Vert</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-063-172</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfer bulb</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scintillation vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-259-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fixation solution</td>
			<td>(5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% formaldehyde</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td></td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halocarbon oil mix</td>
			<td>(10 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in drosophila embryos.

עובר דרוזופילה מפתחת שכבת האפידרמיס חזק המשמשת גם להגנה על התאים הפנימיים מסביבה חיצונית קשה, כמו גם לשמור על הומאוסטזיס הסלולר. פציעה לנקב עם מחטי זכוכית מספקת שיטה ישירה כדי לעורר תגובת אפידרמיס פצע מהירה שמפעילה כתבי תעתיק פצע, אשר ניתן דמיינו ידי אות כתב מקומית בעוברים או זחלי חיים. פציעה לנקב או לייזר מספקת גם אותות המקדמים הגיוס של hemocytes לאתר הפצע. באופן מפתיע, פציעה לנקב חמור (ולפנים) בעוברים בשלב מאוחר רק לעתים רחוקות משבשת התפתחות עוברית נורמלית, כמו יותר מ 90% מעוברים נפצעו כזה לשרוד לבגרות, כאשר עוברים מוזרקים במדיום שמן שממזער זליגה מיידית של hemolymph מאתרים לנקב . הליך הפצע דורש המיקרומניפולציה של עוברי דרוזופילה, כוללים יישור ידני של העוברים על AGצלחות ar והעברת העוברים המיושרים לשקופיות מיקרוסקופ. Assay תגובת פצע אפידרמיס דרוזופילה מספק מערכת מהירה כדי לבדוק את הדרישות הגנטיות של מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים המקדמים ריפוי פצע, כמו גם דרך מסך עבור תרכובות כימיות פוטנציאליות המקדמות ריפוי פצע. מחזור החיים הקצר והשגרתי culturing קל לעשות דרוזופילה אורגניזם מודל רב עוצמה. ריפוי פצע נקי דרוזופילה מופיע לתאם את תגובת משובי אפידרמיס, עם התגובה החיסונית המולדת, בדרכים שנמצאות עדיין בחקירה, המספקת מערכת מצוינת למצוא שימור רגולציה מנגנונים נפוצים לדרוזופילה ופציעת אפידרמיס יונקים.

כדי להשיג את התוצאות שמוצגים בשיטה זו, מסגרת הקריאה הפתוחה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא קבעה את אמרגן / מושרה פצע רצף משפר מדופא decarboxylase (DDC) וDsRed הוא קבע את רצף משפר פצע מhydroxylase טירוזין ( ple) 4,6. בעובר דרוזופילה חי, התבגרות של חלבון כתב פצע הניאון היא 4-6 שעות אופטימליות אחרי פציעתם, המאפשרת זמן להצטברות של חלבון מספיק כדי להמחיש, כמו גם זמן לחלבון פלואורסצנטי לחמצן למדינת הניאון 15. כדי לבחון את לוקליזציה הכתב, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתחם מספיק. כדי לצפות בהגדלה גבוהה יותר של לוקליזציה הכתב, מיקרוסקופ confocal הוא אופטימלי כדי ליצור הקרנה המרבית של חלקים אופטיים מרובים (איור 1). Confocal בתחום ההדמיה vivo של עוברי דרוזופילה הוא מסובך ידי raגליות PID של העובר. . ניתן להשיג מלא מבט של עובר עם 20X אובייקטיבי וניתן לקבל מבט מקרוב על אתר פצע עם 40X אובייקטיבי. העליון נוכח לוקליזציה כתב פצע אפידרמיס ניתן הדמיה עם 10 סעיפים אופטיים 1μm רצופים. לרוחב תצוגה של לוקליזציה כתב פצע אפידרמיס ניתן הדמיה עם 40 1 מיקרומטר סעיפים אופטיים רצופים. שימוש בשיטות מעבר גנטי סטנדרטיות, ניתן לשלב כתבי פצע עם מוטציות גנטיות. דוגמא אחת שהוצגה במאמר זה היא Flotillin-2 (Flo-2), כי פסד של פונקציה (אלל null שנוצר עם כניסה P-אלמנט) ומוטציות לזכות-of-פונקציה (ביטוי יתר שנוצר עם ביטוי בכל מקום בכל התאים) של Flo-2 להדגים את מוצר גן Flo-2 הוא הכרחי ומספיק כדי לעכב את הלוקליזציה של DDC-GFP פצע כתבים 9 (2A דמויות ו2B). שימוש במיילפרוטוקול croinjection, ניתן לבחון האם כניסתה של superactivates פתרונות כימיים או מעכבת את הלוקליזציה של כתבי פצע. עוברים כימיים פצועים נפצעו בו זמנית והוזרקו להם ביחס של 1:4 של 1% צבע הכחול toluidine ותרכובות solubilized. צבע הכחול Toluidine אפשר לאישור חזותי של תרכובות solubilized שהוזרקו לתוך חלל הגוף. עוברי בקרה נפצעו במחט שבורה המכילה 1:04 יחס של 1% צבע כחול toluidine ומומס ללא כימי. שתי דוגמאות שהוצגו במאמר זה הן מי חמצן (H 2 O 2) ותיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD), משום שהפתרונים הכימיים שני יש בם כדי גלובלי להפעיל הלוקליזציה של DDC-GFP פצע כתבים 9 (2C דמויות ו2D) . מי חמצן (H 2 O 2) היה מדולל בH 2 O ל0.6 מ &#39;מתיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD) היה solubilized ב1 מ&#39;M NaOH עד 3 מ&quot;מ. באמצעות פרוטוקול קיבעון עובר, ניתן לזהות את הפעלת השעתוק של גנים תגובת פצע בתחום מקומי, המקיף את אתר פצע. דוגמא אחת שהוצגה במאמר זה היא הכלאה באתר של בדיקות RNA כדי לזהות DDC ותמלילי ple 4,6,9 (3A דמויות ו3B). <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. DDC-GFP וple-DsRed פצע כתב לוקליזציה. Brightfield ותמונות ניאון בעוברי סוג בר פצועים. Top-אור כתב פצע DDC-GFP (). (ב) Top-אור ple-DsRed פצע עיתונאי. כל התמונות נאספו על מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, עם 20X אובייקטיבי. חצים מסמנים את אתר של פצע. קווים מקווקווים בנתוני הפנלs לסמן את קווי המתאר של עוברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. לוקליזציה של כתב DDC-GFP פצע ברקע מוטציה גנטי ועוברים כימיים microinjected. Brightfield ותמונות ניאון של עוברים נפצעו Flotillin-2 (Flo-2) שעברו מוטציה. () הפסד-of-פונקצית Flo-2 מוטציות {KG00210}, התרחבותה של פעילות עיתונאית בכל תאי האפידרמיס. (ב) רווח של פונקצית Flo-2 (ארמדיל-GAL4, כטב&quot;מ-Flo2) מוטנטים, עיכוב של פעילות עיתונאית בכל תאי האפידרמיס. (ג) מי חמצן (H 2 O 2 ) Microinjection פתרון, הרחבה של נציגORTER פעילות לאורך כל תאי האפידרמיס. (ד &#39;) מתיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD) microinjection פתרון, הרחבת הפעילות עיתונאית בכל תאי האפידרמיס. כל התמונות נאספו על מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, עם 20X אובייקטיבי. חצים מסמנים את אתר של פצע. קווים מקווקווים בלוחות נתונים לסמן את קווי המתאר של עוברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> איור 3. זיהוי של מולקולות RNA גן תגובת פצע. תמונות ניאון של הכלאה באתר וזיהוי RNA בעוברים פצועים סוג בר. DDC () וple (ב) תעתיקי רנ&quot;א לצבור סביב אתר הפצע. כל התמונות היו קולקטיביתטד על מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, עם מטרת 20X. חצים מסמנים את אתר של פצע. קווים מקווקווים בלוחות נתונים לסמן את קווי המתאר של עוברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="טבלת 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> טבלת 1. סיכום של כתבי תגובת הפצע באפידרמיס. הוספות של ארבעה כתבי תגובת פצע (DDC, ple, MSN, kkv) זמין בשני כרומוזומים השניה והשלישי. כתבי תגובת DDC ופצע msn כל כתבי תגובת הפצע להפעיל את גן הקרינה (GFP או DsRed) במספר מצומצם של תאי האפידרמיס המקיפים את האתר של פציעה לנקב ברקע הסוג בר (פנוטיפ לדוגמא: &quot;המקומי&quot;). דורשים Grh עבור הפעלה של fluorescenגן ce לאחר פציעה לנקב (פנוטיפ לדוגמא: &quot;אף אחד&quot;). כל כתבי הפצע דורשים Flo-2 ללוקליזציה של גן הקרינה לאחר פציעה לנקב (פנוטיפ לדוגמא: &quot;הגלובלי&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos. at JoVE.com

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

12.4K Views.  The City College of New York.  האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים. 

Video: Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of cutaneous wound healing on the skin. Existing methods, however, still rely on visual inspections through various microscopic tools and devices that normally include high-cost, sophisticated systems and require well trained personnel for operation and data analysis. Here, we describe methods and protocols to fabricate a conformal, skin-like electronics system that enables conformal lamination to the skin surface near the wound tissues, which provides recording of high fidelity electrical signals such as skin temperature and thermal conductivity. The methods of device fabrication provide details of step-by-step preparation of the microelectronic system that is completely enclosed with elastomeric silicone materials to offer electrical isolation. The experimental study presents multifunctional, biocompatible, waterproof, reusable, and flexible/stretchable characteristics of the device for clinical applications. Protocols of clinical testing provide an overview and sequential process of cleaning, testing setup, system operation, and data acquisition with the skin-like electronics, gently mounted on hypersensitive, cutaneous wound and contralateral tissues on patients.

This article presents methods to fabricate and characterize a conformal, skin-like electronic system and protocols for the use in clinical applications, particularly on cutaneous wound management.

ייצור ואפיון של מערכת אלקטרונית כמו-עור קונפורמי לניהול כמותי, עורית פצע

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

מניפולציה של תאי גזע עצביים יחיד ונוירונים בפרוסות מוח באמצעות Microinjection רובוטי

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Assay וMicroinjection פצע

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video