Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI Zuschuss R01 HL082689 zu Scott I. Simon und Anthony G. Passerini unterstützt.

1. Zellkultur und Untergrundvorbereitung <ol><li> Schneiden Sie 3-Zoll-kreisförmigen Substraten aus einem 100 x 20 mm Gewebekulturschale (BD Falcon) mit einer Drehbank. Sterilisieren von Substraten durch Eintauchen in 70% Ethanol. Platz in einer Petrischale und Mantel mit 4 ml Typ-I-Kollagen (100 pg / ml) für 1 Stunde bei Raumtemperatur, dann mit 4 ml 1 x PBS spülen. </li><li> Suspend menschliche Endothelzellen (HAEC, Passage 4-6) auf 6.5x10 5 Zellen / ml und Samen, indem 1 ml direkt auf das Substrat. In einen 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator und ermöglichen Zellen auf dem Substrat 1 h lang anhaften. </li><li> In 9 ml Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) mit 1x Antibiotika-Antimykotika Lösung zu den Zellen ergänzt. Ändern Medien alle 2 Tage, bis die Zellen 90% Konfluenz erreichen. </li><li> Pflegen THP-1 Zellen in RPMI 1640 Medium mit 10% FBS und 1x Antibiotika-Antimykotika Lösung ergänzt. Passage Zellen, wenn sie eine Dichte von 1 zu erreichen0 6 Zellen / ml. </li></ol> 2. Zelle Shearing Protokoll Die Zellen werden in einem benutzerdefinierten Kegel-Platte-Zelle Schervorrichtung (CSD) konditioniert. Angaben zum Gerät und Design-Spezifikationen sind in Tabelle 1 und Abbildung 4 dokumentiert. <ol><li> Bereiten Sie den CSD. Sterilisieren Sie das Kammergehäuse mit Ethanol und Spülen mit sterilem PBS. Erhitzen des Gehäuses auf 37 ° C und Höhe, um sicherzustellen, dass der Kegel senkrecht zu der Zell-Monolayer. Montieren des Substrats mit den Zellen vom Boden des Gehäuses und stellen Sie den Kegel auf die gewünschte Höhe. </li><li> Verwendung Leibovitz-15 (L-15)-Medium mit Endothelzellen BulletKit als Scherung Medium richtigen pH-Wert in Abwesenheit von CO 2 zu halten ergänzt. Um Entzündung stimuliert, fügen Tumornekrosefaktor-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) zu dem Medium und Scheren zu injizieren 6 ml in der Vorrichtung über eine Spritze mit einem Einlass-Anschluss, dabei nicht um Luft einzuführenBlasen in der Kammer. </li><li> Schere Zellen mit einer hohen Größe stationären Scherspannung (HSS, 15 dyn / cm 2) oder eine oszillierende Schubspannung (OSS, 0 ± 5 dyn / cm 2, 1 Hz) für 4 Stunden. Die gewünschte SS wird durch Drehen des Konus über den Zellen, die genau mit einem Mikro-Schrittmotor, wie zuvor beschrieben gesteuert wird, erreicht 6 Die Wand SS an der Oberfläche (τ w) durch angenähert.: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> wobei μ die Viskosität des Mediums ist, ω die Winkelgeschwindigkeit des Kegels, und α ist der Kegelwinkel (0,5 °). Der Kegel Ausrichtung mit dem Substrat innerhalb 0,05 ° bis Präzisionsnivellement und Spalthöhe bei 20 ± 10 mm eingestellt unter Verwendung eines Tiefenmesser Umfangsrichtung und radiale Variation τ w zu minimieren eingestellt. Das Gerät wurde validiert, um Laminar-Flow-Eigenschaften zu gewährleisten. Entfernen cEllen aus dem Gerät und bereiten Sie für die Analyse von Monozytenadhäsion. </li></ol> 3. Herstellung von PDMS Mikrofluidische Kammer <ol><li> Erhalten Master-Form zum gewünschten Mikrofluidkanal und Kanal Höhe abhängig von der Anwendung. Die Eigenschaften der spezifischen Design im Sinne dieses Protokolls sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Methode für die Erstellung dieser bereits gut in der Literatur dokumentiert. 1 Kurz gesagt, das Netz der Kanäle wurde entwickelt, unter Verwendung von CAD-Software (Autodesk Inventor) und bei 5000 dpi gedruckt auf Transparenz. Negativen Fotolacks (SU8) auf einem Silizium-Wafer mit einer Dicke von 100 um gesponnen. Die Transparenz überlagert und UV-Licht ausgesetzt. Nicht polymerisierten Photoresists entfernt wird, um die positive Replikat-Master zu erzeugen. </li><li> Um PDMS Lösung Mix Silikonbasis mit Silikon-Härter 10:1 nach Gewicht in einem Boot zu machen wiegen und rühren Sie mit einem 5 ml serologische Pipette. Achten Sie darauf, den Wänden zu kratzender wiegen Boot zu verhindern, dass zusätzliche Kunststoff-Flocken zur Lösung. </li><li> Legen Sie die Master-Wafer in einem 100x15mm Petrischale und gießen Sie die PDMS-Lösung in die Schüssel. </li><li> Decken Sie die Schüssel und legen Sie sie in einen Vakuum-Behälter für 15 Minuten, um Luftblasen zu entfernen. Nach 15 Minuten nehmen Sie die Petrischale heraus und entfernen Sie überschüssiges Luftblasen durch vorsichtiges Einblasen von Luft über die Oberfläche. </li><li> Platzieren Sie die Petrischale in einem Ofen für 1 Stunde bei 70 ° C Entfernen Sie die Schale und schneiden Sie die Mikrofluidik-Kammern mit einer scharfen Klinge. </li></ol> 4. Montage der Geräte auf Mikroskop <ol><li> Schalten Sie die Lichtquelle zu inversen Mikroskop und setzen Heizung bis 37 ° C. Befestigen Sie einen Schlauch mit einer 10 ml-Spritze und füllen Sie mit destilliertem Wasser so, dass sich keine Blasen. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe und eingestellten Durchsatz, eine Mauer zu SS von 1 Dyn / cm 2 zu induzieren. Die Wandschubspannung (τ w) entlang der Mittellinie des Kanals erzeugt wird, angenähert unter Verwendung des StandardGleichung für eine Parallelplatten-Strömungskammer: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /> wobei μ die Viskosität des Mediums, Q die volumetrische Flußrate ist, h die Kanalhöhe, und w ist die Kanalbreite. Hinweis: da die Kanäle mit endlicher Breite sind die tatsächlichen τ w mit w abhängig vom Kanal variieren Seitenverhältnis, und Messungen werden mit 25% am nächsten zu den Seitenwänden vermieden. 1,7 </li><li> Platzieren Sie PDMS Kammer in Wasser und verwenden Sie ein 100 &amp;mgr; Mikropipette um die Luft aus den einzelnen Kanälen zu entfernen. Bringen Vakuum-Adapter, um die Kammer darauf achten, dass das Ventil ausgeschaltet ist. </li><li> Platzieren Sie Petrischale mit HAEC Monoschicht gegenüber dem Ziel. Legen Sie die PDMS Kammer über der Petrischale und legen Sie es vorsichtig auf der HAEC Monoschicht gleichzeitig sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen dem Gerät und der Monolage zu bilden. Drehen Sie das Ventil so dass das Vakuum eingeschaltet ist und die Kammer fest angeschlossen ist. </li&gt; <li> Schnitt 19 Gauge-Nadeln stumpf, so dass es nur 5 mm Metall links. Füllen Sie den Behälter mit Kunststoff-Puffer und in PDMS Kammer Eingang. Wiederholen geeignete Anzahl von Kanälen verwendet werden. Befestigen Sie Schlauch von Spritzenpumpen auf PDMS-Kanal beendet. </li></ol> 5. Monozytenadhäsion Assay unter Scherbeanspruchung <ol><li> Suspend THP-1-Zellen in 2x10 6 Zellen / ml in HBSS + Ca 2 + / Mg 2 + + 0,1% HSA. Aktivieren THP-1-Zellen durch Inkubation mit Stromazellen abgeleiteten Faktor-1 (SDF-1, 50 ug / ml) für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Schalten Sie Spritzenpumpe zum Fließen zu etablieren, dann werden 50 ul Zellsuspension zu Reservoir ohne Einbringen von Luftblasen. Sobald Flow voll entwickelt ist, beginnt die Datenerfassung. </li><li> Ausführen für 5 min bei passende Strömungsgeschwindigkeit Hinzugeben von Puffer zu dem Reservoir, wenn die Lösung zur Neige geht. Weiter fließt Puffer in die Kanäle zu waschen alle ungebundenen Zellen in der Strömung. </li></ol> 6. Datenerfassung und-analyse <ol><li> Erwerben Sie digitale Bildsequenzen bei 3 Bildern / s für 2 min nach voll ausgebildete Strömung entlang der Längsachse des Kanals an 3 Standorten in den Kanal, dabei nicht zu unmittelbar nach Eingang oder vor Austrittsöffnungen oder in der 25% am nächsten der Seite aufzeichnen Wänden. </li><li> Zähle die Anzahl der Zellen pro Feld verhaftet durch die Identifizierung ihrer Phase-hellen Erscheinungsbild in der gleichen Bildebene als Monolayer. </li><li> Firm Zelle Verhaftung wird durch die Bewegung definiert &lt;½ Zelldurchmesser in 10 s. Durchschnittliche Daten über 3 zufällige Felder / Kanal und Quantifizierung mittels ImageJ Software. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Obwohl das Gefäßendothel, wird gleichmäßig auf Agonisten, die eine systemische Entzündung beitragen ausgesetzt, Atherosklerose ist ein Schwerpunkt Krankheit entwickelt, die vorzugsweise an den Stellen der Strömungsstörung in Arterien, woraus folgt räumliche Heterogenität der endothelialen Funktion. 8 </sup&gt; Zirkulierende inflammatorische Mediatoren wie TNF-α werden im menschlichen Serum unter metabolischem Stress erhöht und korrelieren mit gestörter Endothelfunktion. 9, 10 TNF-α induziert eine gut charakterisierte Reaktion, die in der EG-up-Regulierung der Zelladhäsionsmoleküle (CAMs umfasst ; zB VCAM-1, ICAM-1, E-Selektin) und Chemokine rekrutieren dass Monozyten aus dem Blutkreislauf, ein Markenzeichen des frühen atherosklerotischen Läsion 11 Hämodynamik ein wichtiger Regulator der endothelialen entzündlichen Phänotyp ist 12 High Größenordnung Schubspannung (HSS..; z. B. 15 dyn / cm 2) oder pulsatilen Scherspannung (PSS, z. B. 15 ± 5 dyn / cm 2) mit Seiten des Widerstandes gegen Atherosklerose in Arterien nach unten zu regulieren TNF-α-induzierte Antworten zugeordnet. Umgekehrt geringer Größe Scherspannung (LSS, zB 2 dyn / cm 2) oder oszillierende Schere (OSS; zB 0 ± 5 dyn / cm 2), die charakteristisch für Plattformen anfällig vivo verstärken cytokine-induzierte Entzündung. 13, 14 vorzusehen Unsere mikrofluidischen PDMS-Geräte eine Plattform für die Durchführung mechanistische Studien Hypothesen in Bezug auf die Überlagerung von metabolischem Stress mit hydrodynamischen Faktoren bei der Regulation der endothelialen Funktion und Pathologie zu testen. Der Nutzen und die Vielseitigkeit des Ansatzes wird im Großen und Ganzen durch die folgenden repräsentative Ergebnisse dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Schubspannung differentiell moduliert THP-1-Zell-Adhäsion an TNF-α entzündeten Endothel-Monolayer. Diese Daten erworben wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Protokoll detailliert dokumentiert und in dem Video. HAEC Monoschichten wurden gleichzeitig zu einer niedrigen Dosis des inflammatorischen Zytokins TNF-α (0,5 ng / ml, ~ EC 50 für VCAM-1-Hochregulierung) und entweder HSS (15 Dyn / cm 2) oder OSS (0 ± 5 dyn ausgesetzt / cm 2, 1 Hz) in einem benutzerdefinierten CSD für 4 Stunden, wie beschrieBett im ausführliches Protokoll. THP-1-Zelle Verhaftung wurde unter Scherströmung in einem PDMS Flusskammer quantifiziert. Diese Zelllinie, die den Phänotyp von menschlichen Monozyten imitiert wurde auf seine Reproduzierbarkeit und einfache Verwendung ausgewählt. HSS abgeschwächte die entzündliche Reaktion auf OSS im Vergleich, was zu einer verminderten THP-1-Zelle Verhaftung. Die Daten wurden mittels Student t-Test analysiert und sind als Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten dargestellt. Adaptiert mit Erlaubnis aus DeVerse et al. 5 Die folgenden Daten zeigen die Vielseitigkeit unseres Ansatzes anhand von Beispielen aus unserer Arbeit veröffentlicht. Abweichungen von dem obigen Protokoll angegeben, wo zutreffend. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Die Modulation der Zytokin-induzierten VCAM-1 Expression und Monozytenrekrutierung in einer Schubspannung Gradienten. A) HAEC Monoschichten wurden mit TNF-α (0,3 ng / ml) für 4 h unter flo stimuliertw in einem VMMC ausgebildet basierend auf Hele-Shaw Flußtheorie. 15 A lineare Abnahme der SS Größe entlang der Mittellinie des Kanals wurde durch die Entwicklung der Seitenwände der Kammer, um mit den Stromlinien einer zweidimensionalen Staupunktströmung zusammenfallen und Formen des Endes erreicht der Kanal sind der ISO-Potentialleitungen. Die Wandschubspannung (τ w) entlang der Mittellinie des Kanals in einem axialen Abstand von dem Eingang (x) erzeugt wird, gegeben durch: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="Gleichung 3" /> wobei μ die Viskosität des Mediums, Q die volumetrische Flußrate ist, h die Kanalhöhe ist, w 1 die Kanaleingang Breite und L die Gesamtlänge Kanallänge. Q gewählt wurde, um einen Gradienten in SS Größenordnung von 16 zu erzeugen Dyn / cm 2 am Einlass auf 0 im Staupunkt &quot;a&quot; direkt proximal des outlet. B)-C) VCAM-1-Expression wurde in situ durch Immunfluoreszenz mit Antikörpern konjugiert mit Quantenpunkten und als prozentuale mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von unstimulierten Static Control gemessen. SS nicht modulieren Grundniveau von VCAM-1, welche eine geringe unstimulierten HAEC (graue Dreiecke) ist. Jedoch erhöhte VCAM-1-Expression relativ zu TNF-α an LSS Größen, Spitzenwerte liegen bei etwa 2 Dyn / cm 2 und Zurückkehren zu dem TNF-α Baseline oder unten in Scherung Größen&gt; 5 dyn / cm 2 (schwarze Quadrate). D) Monozyten (10 6 / ml) wurden bei 2 Dyn / cm 2 für 5 min in parallelen Strömungskanälen über Monoschichten wie in A) vorkonditioniert perfundiert. Monozytenrekrutierung an das Endothel quantitativ mit den VCAM-1-Expression bei einer gegebenen Scherbeanspruchung Größe korreliert. Vor allem die Fähigkeit, VCAM-1 Expression und Monozytenrekrutierung mit feiner räumlicher Auflösung in einem monolaye sondierenr zeigten signifikante Unterschiede in einem engen Bereich in SS-Größe, die nicht durch die Anwendung nur einige diskrete Werte der Scherung in getrennten Experimenten wird gebeten. Die Daten wurden mittels ANOVA mit wiederholten Messungen und Differenzen von Newman-Keuls Posttest beurteilt analysiert, * P &lt;0,05 TNF-α aus unter statischen Bedingungen. Die Daten sind Mittelwert ± SEM 3-6 unabhängigen Experimenten. Adaptiert mit Erlaubnis aus Tsou et al. 2 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Triglycerid-reichen Lipoproteinen (TGRL) modulieren Cytokin-induzierte Entzündung im Verhältnis zu Donor Serumtriglyceridspiegel und VCAM-1-Expression. HAEC Monoschichten wurden mit TNF-α (0,3 ng / ml) für 4 Stunden gleichzeitig mit TGRL (10 mg / dl stimuliert ApoB) aus menschlichen Probanden nach einer fettreichen Mahlzeit in statischer Kultur isoliert. A) VCAM-1-Expression wurde separat in abgehängten EG mittels Durchflusszytometrie gemessenund Monozytenadhäsion quantifiziert mit einem VMMC wie in der detaillierten Protokoll beschrieben. Die Daten sind als% Wechsel von TNF-α dargestellt. Monozytenarrest in direktem Verhältnis zur endothelialen VCAM-1-Expression, die direkt mit der Höhe der Serum-Triglycerid-Donor erhöht. B) Monozytenarrest für eine Teilmenge von pro-inflammatorischen Spender in der Gegenwart eines VCAM-1 blockierenden Antikörpers aufgehoben wurde variiert. Bedeutung von gepaarten Student t-Test wurde ermittelt, bedeutet ± SEM 3-5 unabhängigen Experimenten. Adaptiert mit Erlaubnis von Wang et al. 4

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir beschreiben die Verwendung von mikrofluidischen PDMS Vorrichtungen zur On-Chip-Bewertung der endothelialen entzündlichen Phänotyp durch die Echtzeit-Bildgebung von CAM-Expression und Monozytenadhäsion. Ein großer Vorteil unseres Ansatzes liegt in der Fähigkeit, die Ergebnisse mit einer endothelialen Dysfunktion in Zellen, die Entzündungsmediatoren wie diätetische Lipide und Zytokine unter definierten hydrodynamischen Bedingungen, die Schubspannung spiegeln in atherogenen Gefäßen zu quantifizieren. Die VMMC ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 100 x 20 mm Petrischalen </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Ethanol 95% </td><td> EMD Chemicals </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 bis 031-CV </td></tr><tr><td> Typ I-Kollagen-Rat Tail Abgeleitete </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> Menschliche Endothelzellen </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotika-Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Endothelial BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Endothelial Basal Medium-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10 ml Spritzen </td><td> BD Falcon </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Polyurethan-Schlauch </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz-15 Medien </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Siliconelastomergrundstoff </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Siliconelastomer Härter </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 Fotolack Master-Wafer </td><td> UC Davis Pan Lab </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Eclipse-TE200 Inverses Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse-TE200 </td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19-Gauge-Injektionsnadel </td><td> Kendall </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 Monozytenzelllinie </td><td> ATCC </td><td> TIB-202 </td></tr><tr><td> HBSS (Hanks gepufferter Kochsalzlösung) mit Ca 2 + / Mg 2 + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Stroma-Derived Factor - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 350-NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10 bis 040-CV </td></tr><tr><td> Human Serum Albumin (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spezifischen Reagenzien und Geräte.

on-chip endothelial inflammatory phenotyping

Atherogenese wird durch Stoffwechselstörungen, die zu einem erhöhten Zustand des systemischen Entzündung was zu einer endothelialen Dysfunktion beitragen potenziert. Allerdings sind frühe funktionelle Veränderungen im Endothel, dass die individuelle Höhe des Risikos bedeuten nicht direkt zu klinisch therapeutische Strategie Guide helfen zu beurteilen. Darüber hinaus trägt die Regulierung der Entzündung, die durch lokale Hämodynamik zu dem nicht-zufällige räumliche Verteilung der Atherosklerose, aber die Mechanismen sind schwer in vivo zu beschreiben. Wir beschreiben ein Lab-on-a-Chip-basierten Ansatz zur quantitativen Assay metabolischen Störung der entzündlichen Ereignisse in humanen Endothelzellen (EC) und Monozyten unter genauen Strömungsverhältnisse. Standardmethoden der Soft-Lithographie verwendet werden, um vaskuläre mimetischen mikrofluidischen Kammern (VMMC), die direkt an kultivierten EG Monoschichten gebunden microfabricate. 1 Diese Vorrichtungen haben den Vorteil der Verwendung von kleinen Mengen von Reagenzien, währendBereitstellung einer Plattform für direkte Abbildung der entzündlichen Ereignissen an der Membran der EG ausgesetzt zu einer gut definierten Scherfeld. Wir haben erfolgreich diese Geräte angewandt, um Zytokin-, 2 Lipid-3, 4 und RAGE-induzierte Entzündung in fünf menschlichen Aorten-EG (HAEC) zu untersuchen. Hier dokumentieren wir die Nutzung des VMMC zu Assay Monozytenzelllinie (THP-1) Roll-und Festnahme am HAEC Monoschichten, die unter Scher-Differential Eigenschaften bedingt sind und aktiviert durch die inflammatorischen Zytokins TNF-α. Studien wie diese bieten mechanistische Einblicke in atherosusceptibility unter metabolischen Risikofaktoren.

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On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K Aufrufe.  University of California, Davis. Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

Serie: On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Forschung

Biotechnik

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree On-Chip-tomographischen Mikroskopie beschäftigt Multi-Angle-Beleuchtung und Super-Pixel-Auflösung

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

Ferromagnetische Bare Metal Stent für Endothelzellen-Abscheidung und Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Hefestamm-Phänotypisierung mit Droplet-basierter RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

Charakterisierung von Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) aus porcinem peripherem Blut

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Ein mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion während einer Entzündung

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...