Hier stellen wir Protokolle zur Kultivierung von Knochenzellen innerhalb einer anpassungsfähigen Lab-on-a-Chip-Plattform vor. Diese Techniken können verwendet werden, um unser Verständnis der Mechanismen zu fördern, die mechanisch induzierte Knochenremodellierung regulieren. Unser System ermöglicht eine langfristige Kultivierung von Knochenzellen, was eine direkte Quantifizierung der Knochenbildung und Resorption als Reaktion auf veränderte mechanische Belastungsumgebungen ermöglicht.
Der Einsatz dieser grundlegenden Techniken kann zu Entdeckungen führen, die sich auf eine Reihe von knochenbezogenen Fragen wie Osteoporose, Frakturheilung und periprosthetische Osteolyse erstrecken. Um die Brunnen- und Mikrokanalschicht zu erzeugen, kombinieren Sie das PDMS-Prepolymer und das Härtungsmittel im Verhältnis 10 zu eins in einem Kunststoffbecher und mischen Sie sie kräftig, und entgasen Sie das Polymer dann 30 Minuten lang. Gießen Sie die Mischung langsam über die entsprechende vorlevelierte Maske.
Lassen Sie es für 30 Minuten sitzen und backen Sie es bei 45 Grad Celsius für 18 Stunden. Lösen Sie die Ränder des PDMS mit einem verjüngten Laborspachtel und schälen Sie es vorsichtig von der Maske, schneiden Sie dann einzelne Chips mit einem Skalpell und einer 3D-gedruckten Schablone aus und reinigen Sie sie mit Verpackungsband. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte zum Mischen, Gießen und Backen des PDMS, um die PDMS zu erstellen.
Entfernen Sie das PDMS-Blatt aus der Natellbox, und schneiden Sie einzelne Membranen, die den Abmessungen der Bohrloch- und Mikrokanalschicht entsprechen. Verwenden Sie Sättel, um die Membrandicke in der Mitte zu messen und alle Membranen zu entsorgen, die außerhalb der gewünschten Dicke sind, dann reinigen Sie die Membranen sorgfältig mit Verpackungsband und legen Sie sie auf ein Stück Paraffinfolie. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte zum Mischen, Gießen und Backen des PDMS, um die PDMS zu erstellen.
Nach dem Schneiden einzelner Deckel auf größe, Stanzen Zugangslöcher durch das PDMS mit einem Ein-Millimeter-Biopsie-Stempel und dann Oberfläche reinigen sie mit Verpackungsband. Aktivieren Sie die Oberflächen der Schichten eins und zwei mit einem Plasmareiniger für 30 Sekunden bei einer mittleren Hochfrequenz-Leistungseinstellung, richten Sie dann die Zugangslöcher in Schicht eins mit den Mikrokanälen in Schicht zwei aus und drücken Sie die beiden Schichten fest zusammen. Für das Tiefbrunnen-Design wiederholen Sie diesen Vorgang mit den Schichten zwei und drei mit doppelseitigem Klebeband, um den Paraffinfilm der Schicht drei während der Plasmabehandlung an einer ebenen Oberfläche zu befestigen.
Überschüssiges Material von der PDMS-Membran abschneiden und das Blatt Paraffinfolie vorsichtig von der Unterseite des Chips abziehen. Backen Sie den Chip bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Bindungsfestigkeit zwischen den PDMS-Schichten zu erhöhen, dann legen Sie Winkeldosierspitzen in die Zugangslöcher im Deckel ein und sichern Sie sie mit einem zweiteiligen Epoxid mit einer Mikropipette-Spitze, um das Epoxid um jede Spitze aufzutragen. Nachdem das Epoxid vollständig ausgehärtet ist, reinigen Sie den Chip mit 70% Ethanol und übertragen Sie ihn in einen Biosicherheitsschrank.
Schließen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit sterilen Silikonschläuchen an die Dosierspitzen an und füllen Sie den gesamten Chip mindestens 30 Sekunden lang mit 70% Ethanol. Entfernen Sie das Ethanol vom Chip und sterilisieren Sie es über Nacht mit UV-Licht. Am nächsten Tag den Chip dreimal mit destilliertem Wasser waschen, mit Wasser füllen und die Schläuche von den Dosierspitzen entfernen.
Inkubieren Sie den Chip für mindestens 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Legen Sie eine Kompressionsfeder um die Welle der Platte und stecken Sie sie in das zentrale Loch auf der Unterseite der Basis, und befestigen Sie dann den Zifferblattblock mit vier selbstschneidenden Schrauben an der Unterseite der Basis. Legen Sie eine zweite Kompressionsfeder um die Mittelschraube.
Setzen Sie die Schraube in die sechseckige Bohrung in der Unterseite des Zifferblatts ein und schrauben Sie die Baugruppe in die Gewindebohrung in der Mitte des Zifferblattblocks. Schrauben Sie vier männlich-weibliche Aussen in den Boden der Basis. Entfernen Sie die Pufferzeit vom Gerät, indem Sie das Zifferblatt gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis sich die Oberseite der Platte unter der Oberseite der Basis befindet, und drehen Sie dann langsam das Zifferblatt im Uhrzeigersinn, bis die Oberseite der Platte mit der Oberseite der Basis eben ist.
Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, um das Wasser aus dem Tiefbrunnen-Chip zu entfernen und den Boden des Brunnens mit 200 Mikrolitern des Typs I Kollagen in Essigsäure für eine Stunde zu beschichten. Spülen Sie den Chip dreimal mit DPBS mit Kalzium und Magnesium und legen Sie ihn in den Chiphalter. Samen Sie den Chip mit MLO-Y4-Osteozyten in MEM alpha Medium, ergänzt mit Kalbsserum, FBS und Penicillin/Streptomycin.
Entfernen Sie die Schläuche von den Dosierspitzen, legen Sie den Chip in eine Tiefbrunnen-Kulturschale und bebrüten die Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Nach der Inkubation sterile Schläuche an Dosierspitzen befestigen und mit einer Fünf-Milliliter-Spritze das verbrauchte Kulturmedium vom Chip entfernen und den Chip dann langsam mit frischem Medium auffüllen. Legen Sie den Chiphalter in den rechteckigen Einschub auf der Oberseite der Ladevorrichtungsbasis, füttern Sie die Schläuche durch die Schlitze auf dem Deckel und befestigen Sie den Deckel an der Basis.
Tragen Sie die Last auf die Zellen auf, indem Sie das Zifferblatt im Uhrzeigersinn drehen, bis die gewünschte Plattenverschiebung erreicht ist, dann legen Sie die Ladevorrichtung in eine leere P1000-Mikropipette-Spitzenbox und inkubieren Sie die Zellen mit der Last für 15 Minuten. Entfernen Sie nach der Inkubation die Last aus den Zellen, indem Sie das Zifferblatt gegen den Uhrzeigersinn in die ursprüngliche Ausgangsposition drehen, entfernen Sie dann den Deckel vom Gerät, legen Sie den Spanhalter in die Tiefbrunnenkulturplatte und inkubieren Sie die Zellen für eine 90-minütige Nachlast-Wiederherstellungsphase. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, um das konditionierte Medium vom Chip zu entfernen und den Chip aus dem Chiphalter zu entfernen, und verwenden Sie dann einen verjüngten Spachtel, um die Bindung zwischen dem PDMS-Deckel und der Brunnenschicht zu brechen.
Die Zellen können nun analysiert werden. Die Flachgutkonfiguration kann zur Analyse der funktionellen Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten verwendet werden. Die Knochenbildung durch Präosteoblasten wurde mit Alizarin-Rot- und Von-Kossa-Färbungen quantifiziert.
Die Knochenresorption von Osteoklasten wurde mit Toluidinblaufärbung quantifiziert und die Rasterelektronenmikroskopie wurde verwendet, um das Vorhandensein von Resorptionsgruben zu überprüfen. Die Tiefbrunnen-Chip-Konfiguration wurde verwendet, um Osteozyten-Mechanotransduktion zu induzieren, indem die Zellen über eine statische aus der Ebene Distension dehnbar. Bilder von In Chips gesätem Osteozyten zeigen, dass die 48-stündige Inkubation des Chips mit destilliertem Wasser entscheidend für die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit in der typischen Morphologie ist.
Während der Belastungsanfälle wurden Osteozyten einem Dehnungsgradienten ausgesetzt, der auf der PDMS-Membran induziert wurde. Das Verhältnis zwischen durchschnittlicher Äquivalentdehnung und Plattenverschiebung für Werte zwischen einem und zwei Millimetern wurde ermittelt und eine repräsentative Wärmekarte der induzierten Dehnung erzeugt. Nach der Belastung wurde die Zelllebensfähigkeit mit Laktatdehydrogenase-Färbung und dem Annexin V und dem Totzellen-Assay analysiert.
Laktat-Dehydrogenase-Färbung von gestreckten Osteozyten zeigte eine leichtere Färbung in der Nähe des äußeren Rands des Brunnens, was der Position höherer Dehnungswerte entspricht. Unsere Plattform bietet ein hohes Maß an Vielseitigkeit und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Faktoren zu untersuchen, die Knochenumbau regulieren, wie lastinduzierte Mechanotransduktion, Entzündungen und Arzneimitteleffekte. Die hier vorgestellten Techniken bilden die Grundlage für die Entwicklung eines echten Knochenorgans auf einem Chip, das unser Verständnis der multizellulären Feinheiten, die die Knochengesundheit regulieren, erheblich verbessern könnte.
