Die Autoren danken Chalid Ghadban für seine hervorragende technische Hilfe, Andreas Wodarz und Stephan Heermann für ihre technischen Beratung über die konfokale und Zeitraffer-Mikroskopie. Es gibt keinen Interessenkonflikt für einen der Autoren. Diese Arbeit wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) in Project 2 von Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1) gefördert, von den Dres.. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Deutschland) und durch das Forschungsprogramm der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen, Deutschland.

Dieses neue Modell ist eine Adaption eines bereits veröffentlichten organotypischen hippocampalen Hirnschnitt Ansatz 9-12. Änderungen und Ergänzungen wurden eingeführt, um die Gewebe-Wechselwirkungen Krebszellen Gehirn zu optimieren und um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die Studie wurde überprüft und von der lokalen Ethikkommission genehmigt. Die Tiere wurden sorgfältig nach den Richtlinien für die Tierpflege an der Universitätsmedizin Göttingen behandelt. Die organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur kann in zwei Schritte unterteilt werden. Schritt eins ist die Herstellung der organotypischen Hirnschnitt. Schritt zwei besteht aus der Tumorzelle Vorbereitung und Ablagerung in der Co-Kultur-Modell. 1. Organotypische Hirnschnitt <ol><li> Vorbereitung der Dissektion Medium, bestehend aus Minimum Essential Medium (MEM), mit 0,2 mM Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin und 4,5 mg / ml Glucose. </li><li> Enthaupten die Mäuse aus jeder Maus-Stamm zwischen postnatalen Tagsechs und acht (P6-8). </li><li> Entfernen Sie das Gehirn schnell aus dem Schädel unter aseptischen Bedingungen und überträgt es auf eiskalte Dissektion Medium. </li><li> Entfernen Sie die Frontstange und das Kleinhirn von der Ganzhirnschnitt. </li><li> Fix und stabilisieren das Gehirn auf einer Bühne mit Kryo Leim und 5% Agarose. </li><li> Schneiden Sie die Gehirnschnitte horizontal zu einer Dicke von 350 um mit einem Vibratom. </li><li> Sammeln Sie vier Minuten vor sechs ganze Hirnschnitten von einem einzigen Gehirn der Maus, je nach Art und Alter. </li><li> Vorbereitung des Kulturmediums, bestehend aus 50% MEM, 25% Hanks &#39;ausgewogener Salzlösung (HBSS), 25% normalem Pferdeserum (NHS), 0,2 mM Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin (Sigma, München, Deutschland) und 4,5 mg / ml Glucose. </li><li> Setzen Sie jede organotypischen Hirnschnitt auf einem 0,4 um Polycarbonat Transwell Membraneinsatz in einem Sechs-Well-Platte mit 1 ml Kulturmedium in der unteren auch. </li><li> Kultur organotypischen Hirnschnitten über Nacht in einem humidified Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C Inkubator. </li></ol> 2. Die Scheibe Cokultur Modell <ol><li> Embed 10 5 von GFP-transfizierten Tumor oder anderen Zellen (zB MCF-7-GFP-Zellen) in 20 ul Gel-Matrix, bestehend aus 15% RPMI-Medium und 85% ECM-Gel. </li><li> Platzieren Sie den MCF-7-Gelmatrix Mischung in einem sterilen metallischen Abstandshalter (3,8 mm Durchmesser) unmittelbar neben dem kortikalen Bereich der organotypischen Hirnschnitt und Inkubation für 2 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die Abstandshalter und ermöglichen die 3D-Tumor Sphäroid mit der organotypischen 24-96 h Kokultur. </li><li> Ändern Sie jeden zweiten Tag das Kulturmedium. </li></ol> 3. Immunfluoreszenz-Färbung von Astrozyten und Mikroglia im Gehirn Organotypische Scheibe Cokultur <ol><li> Befestigen Sie den organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur mit 4% Paraformaldehyd für 8 h bei 4 ° C </li><li> 5 min waschen die Scheibe Kokultur mit PBST (PBS mit 0,5% Triton X-100). </li><li> Blockieren Sie die sBeispiele mit normalem Ziegenserum in PBST (1:20) bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Färben die Astrozyten durch Inkubation der Kokultur mit Hirnschnitt anti-saure Gliafaserprotein monoklonalen Antikörper (GFAP, 1:200 in PBST) für 36 h bei 4 ° C, gefolgt von Ziege-Anti-Maus-TRITC (1:100 in PBST)-Färbung 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Dreimal mit PBST für 5 min Waschen der Proben. </li><li> Färben die Mikroglia-Zellen mit ILB 4-Alexa Fluor 647 (1:100 in PBST) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Gegenfärbung der Hirnschnitt Co-Kultur mit DAPI (1:1000) für 3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Berg-und Deckglas den Hirnschnitt Co-Kultur mit DAKO-Leuchtstoffmontagemedium. </li><li> Bewertung der Grad der Tumorinvasion der Basis der folgenden Bewertungssystem: 0 = keine der Zellen; + &lt;1/3, + + = 1/3 - 2/3, + + + ≥ 2/3 der Zellen eingedrungen (erster messen Sie die Länge der Kontaktbereich zwischen Tumor-Stecker und in Scheiben schneiden, dann messen Sie die fraction Kontakt nachweisbar durch die eindringenden Zellen). </li></ol> 4. Live-Imaging von der Interaktion zwischen Glia-und Tumorzellen <ol><li> Führen Sie das Experiment unter einem umgekehrten Leica DMI 6000B Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung und einem Objektiv Leica DFC 350 FX CCD-Kamera. </li></ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. 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Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. 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Wir haben nichts zu offenbaren.

Zurück histologische Untersuchungen der zerebralen Metastasierung zeigten schnelle und drastische Veränderungen der ansässigen Gliazellen, vor allem von Astrozyten und Mikroglia 13. Um diese Veränderungen und Wechselwirkungen mit den Karzinomzellen zu studieren, ist diese neue Co-Kultur-System gut geeignet. Weitere Forschungsfelder haben bereits langjährige Erfahrung mit organotypischen hippokampalen Hirnschnitten. Ein Vorteil ist, dass die organotypischen hippocampalen Hirnschnittkulturen sind lebensfähig und effektiv Wochen für Tag erhalten, so dass es für Langzeitexperimente geeignet. Da Stoppini Die Einführung der organotypischen hippocampalen Schnitt-System 1991 ist es weit verbreitet, beispielsweise in der Forschung von degenerativen Erkrankungen. Somit stellt diese innovativen Co-Kultur-System eine Modifikation einer etablierten Ansatz mit einer Reihe von Anwendungen in der Tumorbiologie 9,11. Die Modifikation bot uns ein reproduzierbares Modell, um den Grad der Tumorinvasion af bewertenterwards und Kulturen durch das Interface-Verfahren gewachsen sind ideal für Experimente, die eine dreidimensionale Struktur erfordern. Verschiedene Techniken sind verwendet worden, um organotypischen hippocampalen Schnitten Kokultur mit anderen Zellen. Dazu gehören ein indirektes System zwischen Makrophagen-Zellen und der organotypischen Hirnschnitt 14 und eine direkte Co-Kultur von zwei verschiedenen Scheiben aus der Region des Hippocampus 15. Gliom-Aggregate sind auch mit Hirnschnitten 16 kokultiviert worden. Diese Modelle können verwendet werden, um zelluläre und molekulare Ereignisse in den Gehirnschnitten zu analysieren, aber nicht direkt, physiologische Kontakt zwischen Tumorzellen, Mikroglia und das Hirnparenchym ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die Beobachtung der Mikroglia ohne Kontamination von Knochenmark abgeleiteten peripheren Monozyten / Makrophagen. Die Verwendung von CCR2 und CX3CR1 transgenen Mausmodell ist ein kritischer Verbesserung aufgrund der Tatsache, dass es schwierig ist, den Bewohner von Mikroglia eindringenden Monozyten zu unterscheidenauf der Grundlage ihrer ähnlichen Eigenschaften 17,18,19. Obwohl intrazerebrale Injektion von Krebszellen erlaubt die Untersuchung der Tumorprogression, nicht sagen kann wesentlich, ob die umgeben Makrophagen-ähnlichen Zellen von Gehirn-residenten Mikroglia Population oder aus dem Knochenmark stammenden peripheren Monozyten / Makrophagen 17. Das Team von Kettenmann führte eine organotypischen Hirnschnittmodell, das Impfen von Gliom-Zellen in Gehirnschnitten mit einem Mikromanipulator 20 beteiligt. Allerdings unterscheiden sich primäre maligne Gliome in vieler Hinsicht von metastasierten Karzinome. Erstens sind mesenchymalen Ursprungs malignen Gliomen, nicht außerhalb des Nervensystems metastasieren, und wandern / einzufallen als Einzelzellen ohne Grenze zwischen Tumor und Hirngewebe. Im Gegensatz dazu ist infiltrative Wachstum eine typische pathologische Merkmal, und solche Karzinome in der Regel wandern / einzufallen als Kohorten. Zweitens versuchen Karzinome oft epithelialen Strukturen im Gehirn wieder aufzubauen, während Gliazellenversuchen, den Tumor aus dem Hirngewebe von einer (pseudo-) Kapsel trennen. Unter Berücksichtigung der biologischen und morphologischen Eigenschaften, malignes Gliom und Metastasierung von Karzinomen sind nicht wirklich vergleichbar. Aus diesen Gründen, modifiziert und eine Co-Kultur-System, wo wir nicht spritzen, sondern eine Co-Kultur-Karzinom-Zell Stecker neben dem Hirnschnitt entwickelten wir. Darüber hinaus beobachteten wir Mikroglia und Astrozyten Akkumulation an der Grenze des Tumors Stecker, was bedeutet, dass Mikroglia geben Sie die Tumor-Stecker und könnte leicht durch Hellfeldmikroskopie erkannt und anschließend durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden. Die Krebszellen dringen in das Gehirn in Scheiben schneiden, die vergleichbar mit der realen Situation in vivo und einer Beobachtung von Baumert und Kollegen, die in 63% der Fälle eine Autopsie Infiltration Zone gefunden mit Hirnmetastasen 21 gemacht ist. Aufgrund der fehlenden Durchblutung, gibt es nur Makrophagen / Mikroglia in dieser Kultur. Darüber hinaus kann aufgrund der mIssing T-Zellen und daher fehlt allo-Reaktivität, menschliche Karzinomzellen könnte sogar Kokultur mit Gehirnschnitten von immunkompetenten Mäusen oder Ratten (NMRI, B6 oder Wistar) verwendet werden. Dies könnte als Alternative zum Nacktmausmodell zu dienen. Da vier vor fünf Scheiben kann von jeder Maus erhalten werden, deutlich reduziert die Anzahl der Tiere erforderlich ist, im Vergleich zu den bestehenden Pritzer. Hinzu kommt, dass die Tiere über einen längeren Zeitraum von Metastasen zu leiden und sie nicht operativen Verfahren 22 wiederholt durchlaufen. Mit dieser Cokultur-System haben wir die Aktivierung der Mikroglia durch Krebszellen und die Fähigkeit zur Förderung der Invasion von Krebszellen nachgewiesen. Außerdem ist dies das erste Mal, nach unserer Kenntnis wurden Mikroglia gefunden, sich aktiv zu transportieren Karzinomzellen 23. Trotz all dieser Vorteile weist das Kokultursystem zwar auch Einschränkungen. Es ist noch ein in vitroModell fehlt die Schritte der Metastasierung vor der Kolonisation. Wegen der fehlenden Perfusion, ist es nicht möglich, die Extravasation studieren. Somit ist die alternative Möglichkeit, um die Extravasation zu studieren, um entweder die in vivo-Injektion-Modell oder die modifizierten Boyden-Kammer-System mit der extrazellulären Matrix, HUVEC und Astrozyten, um die Blut-Hirn-Schranke 22,24 imitieren. Die Hirnschnitt Kokultur Verfahren ist noch ein zuverlässiges und reproduzierbares Modell mit vielen Vorteilen und ein Potential für eine breite Vielfalt von Anwendungen, wie beispielsweise Analyse der Besiedlung, insbesondere mit einem Fokus auf der Rolle der residenten Zellen. Die Kombination mit anderen etablierten Techniken (wie Immunhistochemie, konfokaler Mikroskopie und Zeitraffer-Mikroskopie) unterstützt die Untersuchung der direkten Zell-Zell-Interaktionen. Es ist eine einfache Alternative und Ergänzung anderer Techniken und bietet Zugang zu der Untersuchung der Signale und Effekte, wie von der Mikroumgebung metastasierendem auferlegt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

Patienten mit zerebralen Metastasierung von Karzinomen haben eine schlechte Prognose. Allerdings hat das Verfahren bei der metastatischen Website kaum untersucht worden, insbesondere die Rolle der Wohn (Stroma-Zellen). Studien in der Primärkarzinome zeigen den Einfluss der Mikroumgebung auf Metastasen, auch auf die Prognose 1,2. Vor allem die Tumor-assoziierten Makrophagen (TAM) Unterstützung Migration, Invasion und Proliferation 3. Interessanterweise sind die Hauptzielstellen von Metastasen besitzen gewebespezifischen Makrophagen, wie Kupffer-Zellen der Leber oder Mikroglia im ZNS. Darüber hinaus sind die Metastasen besitzen auch andere gewebespezifischen Zellen, wie Astrozyten. Kürzlich wurden Astrozyten gezeigt, um die Proliferation und Persistenz von Krebszellen 4,5 fördern. Daher Funktionen dieser Gewebe-spezifischen Zelltypen scheinen sehr wichtig im Prozess der Hirnmetastasen 6,7 sein. Trotz dieser Beobachtungenaber bis jetzt gibt es keine geeigneten in vivo / in vitro-Modell zur Verfügung, um Glia-Reaktionen während der Hirnmetastasenbildung, insbesondere durch Hellfeldmikroskopie direkt sichtbar zu machen. Aktuelle Live-Bildgebung in vivo von Karzinomzellen zeigten ihre Hirn Kolonisation Verhalten 8. Jedoch ist dieses Verfahren sehr aufwendig, kostenintensiv und technisch komplex. Darüber hinaus sind diese Arten von Tierversuchen auf den Kleinserien beschränkt und kommen mit einem erheblichen Stress für die Tiere (durch Implantation der Glasplatte, Injektion von Tumorzellen, sich wiederholende Anästhesie-und langfristige Fixierung). Weiterhin wird in vivo Bildgebung bislang auf die Visualisierung der Karzinomzellen beschränkt, während Wechselwirkungen mit residenten Zellen noch nicht dargestellt worden. Schließlich sind Untersuchungen der menschlichen Karzinomzellen in immunkompetenten Tieren unmöglich 8. Aus diesen Gründen haben wir ein Co-Kultur-System consiStachel eines organotypischen Hirnschnitt Maus und epithelialen Zellen in Matrigel (3D-Zell Kugel) eingebettet. Die 3D-Karzinomzellkugeln wurden direkt neben der Hirnschnittkante, um die Invasion des benachbarten Hirngewebe zu untersuchen platziert. Dies ermöglicht es uns, morphologische Veränderungen und Wechselwirkungen zwischen den Gliazellen und Karzinomzellen durch Fluoreszenz und sogar von hellen Feldmikroskopie sichtbar zu machen. Nach der Co-Experiment kann das Hirngewebe oder die 3D-Zellkügelchen gesammelt und für die weitere molekulare Analysen (z. B. qRT-PCR, IHC oder Immunoblot) sowie für Untersuchungen durch konfokale Mikroskopie verwendet werden. Dieses Verfahren kann angewendet werden, um die Ereignisse in einem lebenden Gehirn Gewebe Tagen ohne schädliche Wirkungen auf die Hirnschnitten überwachen. Das Modell ermöglicht auch selektive Unterdrückung und Ersatz von residenten Zellen von Zellen aus einem Spendergewebe, um die unterschiedlichen Auswirkungen einer bestimmten Genotyp zu bestimmen. Schließlich ist die Co-Kultur-Modell eine praktikable AlternativeIn-vivo-Ansätze bei der Prüfung gezielte pharmakologische Manipulationen.

Erstens, alle verwendeten Karzinomzellen (human: MCF-7-und Maus: 410,4) drangen in die Maus organotypischen Hirnschnitt. Die Invasion war daher artenunabhängig (1A), die eine breite Palette von Anwendungen in einer Art unabhängig angibt. Zusätzlich Mikroglia und Astrozyten an der Grenzfläche angesammelt, wie zuvor in vivo und in Patientenproben 13 beschrieben. Zeitraffer-Bildgebung über einen längeren Zeitraum nicht nur ergeben, die Lebensfähigkeit der Scheibe, sondern bot auch eine gute Plattform, um die zellulären Wechselwirkungen zu beobachten. Mit Zeitraffer-Experimente wurden die Mikroglia-Zellen aufgenommen, um die 3D-Zellbereich eingeben, während wiederum fallen Krebszellen auch die Hirnschnitt (Abb. 1B1-B2). Darüber hinaus haben wir bereits die Fähigkeit der Mikrogliazellen auf Karzinomzellen transportieren von einem immer noch rätselhaften Mechanismus, um dadurch im Karzinom Invasion zu unterstützen gezeigt haben. Mit Immunfluoreszenzmarkierungstechniken, die wirbeschriebenen Co-Lokalisation von Tumorzellen und Stromazellen (zB Mikroglia und Astrozyten), die beide in dem Hirngewebe und in die Tumorzelle Stecker (Fig. 1C-D), was auf eine enge Wechselwirkung zwischen den Zellen während der Invasionsprozess. Vergleichbare Ergebnisse wurden erzielt, wenn Maus Hirnschnitten wurden entweder mit menschlichen (Abbildungen 1C1-C3) oder Maus (Abbildungen 1D1-D3)-Karzinom-Zellen kokultiviert - zeigt die breite Palette von Anwendungen für das Studium Zellen von verschiedenen Arten, Genotypen und Sorten. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> Fig. 1 ist. Hirnschnitt Kokultur-Modell mit einem 3D-Sphäroid von Maus und Mensch Karzinomzellen. A) Quantifizierung der Invasion von Krebszellen in organotypischen Hirnschnitt ganze Kokulturen mit einer Maus BrustkrebsZelllinie 410,4 oder eine menschliche Brustkrebs-Zelllinie MCF-7. Die Daten stellen den Prozentsatz der Grad der Zellinvasion in Hirnschnitten in jeder Gruppe mit n ≥ 38. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen (Kruskal-Wallis-Test). B) Zeitraffer-Bilder der organotypischen Hirnschnitt ganze Kokulturen mit MCF-7-GFP-Zellen und repräsentative Bilder von Tag 2 (B1) und Tag 5 (B2) waren gezeigt. CD) konfokale Mikroskopie-Bilder zeigten Kohorten von Karzinomen, Astrozyten und Mikroglia. Doppelfärbung von Astrozyten (anti-GFAP-TRITC, rot) und Mikroglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violett) des gesamten Co-Kultur mit der 350 um dicken organotypischen Hirnschnitt und dem GFP-transfizierten Tumorzell Stecker (grün): 3D- MCF-7-GFP-(C1-C3) und 3D-410.4-GFP (D1-D3). Weiße Striche zeigte den Rand des Hirnschnitt und dem Tumorinvasionsfront. Maßstabsbalken repräsentieren 50 um. Mikroglia, Astrozyten einnd Tumoren Kolokalisationen (C1 und D1), Astrozyten-Tumoren Kolokalisationen (C2 und D2) und Mikroglia-Tumor-Kolokalisationen (C3 und D3) in der Scheibe Co-Kultur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a>

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Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Die organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur mit Karzinomzellen ermöglicht die Visualisierung morphologische Veränderungen durch Fluoreszenz sowie Hellfeld-(Video)-Mikroskopie während des Prozesses der Karzinomzellinvasion von Hirngewebe. Dieses Modellsystem ermöglicht auch für die Zellaustausch und die Wiederauffüllung Ansätze und bietet eine Vielzahl von Manipulationen und Analysen.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

20.5K Aufrufe.  University of Göttingen.  Die organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur mit Karzinomzellen ermöglicht die Visualisierung morphologische Veränderungen durch Fluoreszenz sowie Hellfeld-(Video)-Mikroskopie während des Prozesses der Karzinomzellinvasion von Hirngewebe. Dieses Modellsystem ermöglicht auch für die Zellaustausch und die Wiederauffüllung Ansätze und bietet eine Vielzahl von Manipulationen und Analysen. 

Serie: Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

Mammary Transplantation von Stromazellen und Carcinoma Cells in C57BL/6J-Mäuse

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Forschung

Medizin

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Ein orthotopen Mausmodell des Anaplastic Schilddrüsenkarzinom

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

Symmetrische Bihemispheric Postmortem Gehirn Schneiden Gesund und krankhafte Gehirnbedingungen beim Menschen zu studieren

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

Organotypic Slice Cultures as Preclinical Models of Tumor Microenvironment in Primary Pancreatic Cancer and Metastasis

Realistic preclinical models of primary pancreatic cancer and metastasis are urgently needed to test the therapy response ex vivo and facilitate personalized patient treatment. However, the absence of tumor-specific microenvironment in currently used models, e.g., patient-derived cell lines and xenografts, only allows limited predictive insights. Organotypic slice cultures (OTSCs) comprise intact multicellular tissue, which can be rapidly used for the spatially resolved drug response testing.
This protocol describes the generation and cultivation of viable tumor slices of pancreatic cancer and its metastasis. Briefly, tissue is casted in low melt agarose and stored in cold isotonic buffer. Next, tissue slices of 300 &#181;m thickness are generated with a vibratome. After preparation, slices are cultured at an air-liquid interface using cell culture inserts and an appropriate cultivation medium. During cultivation, changes in cell differentiation and viability can be monitored. Additionally, this technique enables the application of treatment to viable human tumor tissue ex vivo and subsequent downstream analyses, such as transcriptome and proteome profiling.
OTSCs provide a unique opportunity to test the individual treatment response ex vivo and identify individual transcriptomic and proteomic profiles associated with the respective response of distinct slices of a tumor. OTSCs can be further explored to identify therapeutic strategies to personalize treatment of primary pancreatic cancer and metastasis.

This protocol describes the preparation of organotypic slice cultures (OTSCs). This technique facilitates the ex vivo cultivation of intact multicellular tissue. OTSCs can be used immediately to test for their respective response to drugs in a multicellular environment.