Bei Patientinnen, bei denen solide Tumoren der Brust oder der Bauchspeicheldrüse diagnostiziert wurden, besteht eine starke Korrelation zwischen Krankheitsverlaufsereignissen wie Metastasen oder Therapieresistenz und schlechten Ergebnissen. Es ist bekannt, dass die zellulären molekularen Mechanismen, die die Homöostase und Fibrose des Gewebes steuern, auch das Fortschreiten solider Tumore steuern. Mein Labor ist daran interessiert, diese Mechanismen zu verstehen, damit wir Therapien und diagnostische Maßnahmen besser entwickeln können, um Patienten zu helfen.
Eine der größten experimentellen Herausforderungen besteht darin, dass es einen dringenden Bedarf an 3D-Krebsmodellen gibt, die interzelluläre Interaktionen während physiologischer und pathophysiologischer Prozesse erfassen können, und dann durch das Verständnis dieser Wechselwirkungen zusätzliche Einblicke in die Krankheiten gewinnen können, um dann neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. Unser Protokoll wird eine kostengünstige und reproduzierbare 3D-Zellkulturmethode bieten, die in vivo Merkmale der Mikroumgebung von Geweben repliziert. Unser Protokoll wird eine einfache und schnelle gerüstfreie und gerüstbasierte 3D-Zellkulturmethode bieten, mit der wir heterogene zelluläre Interaktionen quantifizieren können.
Wir haben einen Weg gefunden, 3D-Sphäroidkulturen effizient zu formulieren, die mit gerüstfreien Modellen verwendet werden können, aber auch mit gerüstbasierten Systemen zusammengeführt werden können, um die Zellinvasion und das Zellverhalten zu messen. Schalten Sie zunächst das ultraviolette Licht ein, um das Innere der Biosicherheitswerkbank 15 Minuten lang zu desinfizieren. Öffnen Sie den Fensterflügel der Biosicherheitswerkbank, um den Luftstrom zu stabilisieren, und schalten Sie das Vakuumabsaugsystem ein.
Reinigen Sie die Oberfläche der Innenhaube und die Schläuche des Vakuumabsaugsystems mit 70 % Ethanol. Erwärmen Sie das Zellkulturmedium, PBS und 0,25 % Trypsin-EDTA in einem Bead-Bad auf 37 Grad Celsius. Untersuchen Sie nun die Zellen unter einem Mikroskop, um eine Konfluenz von 70 bis 80 % zu bestätigen.
Aspirieren und verwerfen Sie mit einem Vakuumsauger das Kulturmedium aus den plattierten Zellen. Waschen Sie das restliche Medium einmal mit zwei Millilitern PBS, aspirieren Sie das PBS und entsorgen Sie es nach dem Waschen. Geben Sie anschließend mit einer Mikropipette einen Milliliter Trypsin in die Zellkulturschale und stellen Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.
Geben Sie nun einen Milliliter Sojabohnen-Trypsin-Hemmer in PBS auf den Teller, um das Trypsin zu inaktivieren. Um die Zellcluster zu dispergieren, pipettieren Sie die flüssige Mischung mit einer P-1000-Mikropipette. Sammeln Sie die Zellsuspension vom Boden der Platte und geben Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Das Röhrchen wird bei 100 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand mit dem Vakuumsauger entsorgt. Lassen Sie die molekularen Fluoreszenzsonden 15 Minuten lang in einem bei 37 Grad Celsius temperierten Bead-Bad auf Raumtemperatur erwärmen. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer Mikropipette in zwei Millilitern der jeweiligen Arbeitszelltracker-Farbstoffmedienlösungen.
Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Nach 30 Minuten Inkubation werden die Röhrchen bei 100 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Verwenden Sie dann einen Vakuumsauger, um den Überstand abzusaugen und zu entsorgen.
Resuspendieren Sie das Pellet gründlich in einem Milliliter 10%FBS-haltigem DMEM mit einer Mikropipette. Sammeln Sie nun 10 Mikroliter der Zellsuspension und überführen Sie sie in ein Mikroröhrchen, das das gleiche Volumen Trypanblau enthält. Geben Sie nach dem Mischen der Zellen 20 Mikroliter der Zelltrypanlösung in einen Objektträger der Zellzählkammer.
Führen Sie die Folie in einen automatischen Zellzähler ein, um die Zellzahl zu bestimmen. Berechnen Sie die durchschnittliche Gesamtzahl lebender Zellen aus zwei Messungen. Bereiten Sie für jeden Zelltyp Arbeitszellbestände in einer Konzentration von 6,67 mal 10 hoch drei Zellen pro Milliliter vor, was 2.000 Zellen pro 300 Mikroliter entspricht.
Übertragen Sie mit einer Mikropipette das erforderliche Volumen für drei technische Repliken plus ein weiteres in ein Mikroröhrchen. Nachdem Sie gründlich mit einer Pipette gemischt haben, geben Sie 300 Mikroliter der Probe in eine Vertiefung einer U-förmigen Boden-Mikroplatte mit extrem niedrigem Aufsatz. Stellen Sie die 96-Well-Platte in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Bilde das Wachstum und die Morphologie der Sphäroide alle 24 Stunden, bis zu 96 Stunden, mit einem Phasenkontrastmikroskop. Schalten Sie die Imaging- und automatischen Inkubatorgeräte ein. Erstellen Sie ein neues Bildgebungsprotokoll im Task-Manager der Bildgebungssoftware, um das 48-Stunden-Wachstum von BT-474-Sphäroiden zu erfassen, die mit BJ-5ta-Fibroblasten kokultiviert wurden, und von EA.hy926-Endothelzellen, die mit den Zelltracker-Farbstoffen blau, orange bzw. tiefrot gefärbt wurden.
Füllen Sie einen Eiskübel mit Eis, um die Basalmembranextraktlösung kalt zu halten, und legen Sie die Lösung auf Eis. Mit einer Mehrkanalpipette werden ca. 170 Mikroliter Medium aus der Kulturschale abgesaugt. Besorge dir eine Lupe und einen Mini-Leuchtkasten, um die kleinen Sphäroide genau zu beobachten.
Platzieren Sie die 96-Well-Sphäroidplatte über dem Leuchtkasten und positionieren Sie die Lupe darüber. Setzen Sie eine P-200-Pipette auf 30 Mikroliter und sammeln Sie den Basalmembranextrakt, um drei Mikrotröpfchen zu erzeugen. Stellen Sie sicher, dass die 96-Well-Platte flach ist, und positionieren Sie die Pipette senkrecht über dem Sphäroid.
Lassen Sie nun das Tröpfchen los, ohne den Boden der Vertiefung zu berühren. Stellen Sie die Platte für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Nach der Inkubation überlagern Sie die Sphäroide mit weiteren 50 Mikrolitern der Basalmembran-Extraktlösung pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Geben Sie dann mit einer Mikropipette 100 Mikroliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung. 72 Stunden nach der Beschichtung zeigten MCF-10A-, MCF-10Ca1H- und BT-474-Zellen, die mit EA.hy926 und THP-1 oder mit BJ5-ta und THP-1 kokultiviert wurden, eine signifikante Zunahme der Sphäroidfläche im Vergleich zu epithelialen Sphäroiden in Monokultur. Im Gegensatz dazu zeigten co-kultivierte MDA-MB-468-Zellen eine signifikante Abnahme der Sphäroidfläche im Vergleich zu Monokulturen.
Die Anwendung des Zelltracker-Farbstoffs auf BT-474-tumorigene Epithelzellen und Stromazellen vor der Etablierung der Sphäroide zeigte, dass Stromazellen, einschließlich EA.hy926 und BJ-5ta, die knospenden Strukturen am Rand der zentralen BT-474-Sphäroide bildeten. 24 Stunden nach der Platingierung wurde eine Basalmembran auf BT-474 tumorigene Epithelzellen gelegt, die mit Stromazellen kokultiviert wurden, was die Bildung invasiver Strukturen zeigt.
