Zweidimensionale Zellkulturen imitieren das In-vivo-Tumorwachstum nicht ausreichend. Zur Verbesserung wurden 3D-Verfahren mit Sphäroiden entwickelt. Unser 3D-Glioblastom-Sphäroid-basierter Assay eignet sich besonders gut, um die Invasion von Hirntumoren in die gesunde Hirntumorumgebung zu untersuchen.
Dreidimensionale Kulturmodelle können verwendet werden, um eine multizelluläre Architektur, Heterogenität und metabolischen Zustand von Tumoren zu rekapitulieren, was eine strengere Bewertung der Arzneimittelwirkungen ermöglicht. Achten Sie darauf, nicht den Boden des Brunnens zu berühren oder den Überstand vollständig zu entfernen, um das Gel auf Eis zu halten, und die Zellen schnell zum Gel hinzuzufügen. Um einheitlich große Tumorsphäride zu erzeugen, waschen Sie zunächst die Tumorzellkultur von Interesse mit fünf MilliliterPBS und behandeln die Zellen mit 0,5 bis einem Milliliter Dissoziationsenzym.
Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius die Reaktion mit vier bis 4,5 Milliliter PBS stoppen und die abgetrennten Zellen in ein 15 Milliliter konisches Rohr mit 10 Millilitern komplettem Wachstumsmedium übertragen. Nach dem Zählen die Zellen um ein mal 10 bis sechs Milliliter komplettes Wachstumsmedium, ergänzt um zwei Milliliter 2%Methylcellulose-Konzentration, wieder aussetzen und die Suspension in einen sterilen Systembehälter übertragen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Zellen zu jedem Brunnen einer 96-gut runden Bodenplatte und legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius 5%Kohlendioxid-Inkubator für drei bis vier Tage.
Um einen Invasionstest durchzuführen, wenn die Tumorzellen gleichmäßig große Sphäroide gebildet haben, übertragen Sie jede Zellstruktur in ein 500-Mikroliter-Rohr und waschen Die Sphäroide einmal mit 200 Mikroliter PBS. Nach dem zweiten Waschen die Sphäroide vorsichtig in 100 Mikroliter frisch zubereitete Kollagenmatrix geben und jede Sphäroidsuspension in die Mitte jedes Brunnens einer flachen 96-Well-Platte geben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius, fügen Sie 100 Mikroliter komplettes Wachstumsmedium auf dem Gel in jedem Brunnen.
Achten Sie darauf, alle Sphäroide in der Mitte jedes Brunnens für die beste Bildgebung der Tumorzellinvasion zu platzieren. Um einen Migrationstest durchzuführen, wenn die Tumorzellen gleichmäßig große Sphäroide gebildet haben, beschichten Sie eine Sechs-Well-Platte mit 0,2 Milligramm pro Milliliter Matrigel im Wachstumsmedium für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation entfernen Sie das Matrigel und fügen Sie jedem Brunnen zwei Milliliter komplettes Wachstumsmedium hinzu.
Die Sphäroide von der runden Bodenplatte in 50 Mikroliter Volumen in einzelne Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte übertragen und 24 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator legen. Am nächsten Tag färben Sie die Sphäroide mit 10 Nanogramm pro Milliliter Hoechst für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Zur Bildaufnahme nach einer Invasion oder Migrationsuntersuchung legen Sie die Platte auf die Bühne eines Brightfield Konfokalmikroskops, das mit einer Videokamera ausgestattet ist, und erhalten Sie Bilder über den entsprechenden Versuchszeitraum.
Um die Bilder halbautomatisch zu analysieren, importieren Sie die Bilder nach Fidschi und klicken Sie auf Plugins, Makros, Interaktiver Interpreter. Kopieren und fügen Sie die angepasste violette Schleife ein. Halten Sie die violetten Sätze und fügen Sie die grünen Sätze von Interesse nach Bedarf.
Klicken Sie dann auf Analysieren und Messen, um die Fläche jedes Sphäroids zu messen. Um Hypoxie in verschiedenen Bereichen der sphärischen Struktur zu messen, kann Kohlensäure-Anhydrase-IX-Färbung verwendet werden, um die hypoxische Aktivität zu bestimmen. In dieser repräsentativen Analyse wurden weitere kohlensäurehaltige Anhydrase IX-positive Zellen im Sphäroidzentrum beobachtet.
Hypoxische Zellen im Sphäroidkern neigen dazu, glykolytischer zu sein als die Zellen, die den Kern umgeben. Mitochondrien können durch Elektronenmikroskopie zur weiteren Analyse abgebildet werden. Der Sphäroiddurchmesser steht in direktem Zusammenhang mit der Dichte der Zellen, aus denen die 3D-Zellstruktur besteht, und Fidschi-Makros können verwendet werden, um die Proliferation, Invasion oder Migration der Zellen innerhalb jedes Sphäroids oder die Migration der Zellen innerhalb jedes Sphäroids zu quantifizieren.
Erhöhungen des Sphäroidkerns spiegeln die Stimulation der Zellproliferation wider. Nach der Hemmung des Komplexes I der mitochondrialen Atmungskette wird die überwiegende Mehrheit der ATP-Produktion in den Mitochondrien beeinträchtigt, wodurch die Proliferation nach 72 Stunden um 20 % reduziert wird. Die Behandlung von Chlorwasserstoff verbessert die Kollagen-Invasion Typ I über einen Zeitraum von 24 Stunden, reduziert aber den Migrationsbereich der Sphäroide 1,5-fach im Vergleich zu unbehandelten Sphäroiden.
Wie durch Live-Bildgebung beurteilt, zeigen die Sphäroide eine hohe innere Dynamik und bewegen sich schnell. Die Größe der Sphäroide sollte relativ gleichmäßig sein und darauf geachtet werden, die Sphäroide in der Mitte der Brunnen zu manipulieren, um die besten Bildergebnisse zu erzielen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Proliferation von Tumorzellen, Migration und Tod sowie die Expression von extrazellulären Matrix, Zellrezeptoren oder intrazellulären Proteinen von Interesse zu untersuchen.
Die Sphäroide können auch verkapselt werden und die Wirkung einer erhöhten Zelloberflächenspannung kann bei Entfernung der Kapseln untersucht werden.
