Diese Arbeit wurde durch ein Wellcome Trust Klinische Promotionsstipendium (ECAT) unterstützt.

1. Herstellung von Parylene Muster auf SiO 2: Ablauf (siehe Abbildung 1) <ol><li> Design-Wunsch Parylene-C-Konfiguration mit einem Layout-Editor-Software-Paket, der fähig ist Lesen / Schreiben CIF (Caltech Zwischenform) oder GDS-II (Grafik Datenbanksystem-II)-Dateien. CIF und GDS-II sind Industriestandard-Dateiformate für die integrierte Schaltung Grafik-Layout. </li><li> Kommission Photomaske herzustellen, um eine geeignete Anlage Mikroelektronik, oder machen Sie im Haus, wenn Einrichtungen vorhanden sind. </li><li> Oxidieren einen Silizium-Wafer in einem atmosphärischen Horizontalofen (H 2 1.88 SLM und O 2 1,25 SLM) bei 950 ° C für 40 min, um eine 200 nm SiO 2-Schicht (Dicke bestätigen mit einer kleinen Spot-spektroskopische Reflektometer) zu produzieren. </li><li> Prime das oxidierte Wafer mit einem Silan-Haftvermittlers. Jetzt einzahlen Parylen-C auf 22 ° C bei einer Rate von 1,298 nm / mg Dimer unter Verwendung einer Vakuumabscheidungssystem speziell für Parylen abzulagern. A 100nm dicke Parylene-C-Beschichtung wurde für alle unten gezeigten Beispiele verwendet. </li><li> Nächste Einzahlung Hexamethyldisilazan (HMDS) Haftvermittler auf der Parylen-beschichtete Wafer mit einem geeigneten Photoresist-Beschichtungssystem. </li><li> Jetzt dreht den Wafer bei 4000 Upm für 30 sec, während die Anwendung positiven Photoresist (was zu einer theoretischen Dicke von 1 &amp;mgr; m) unter Verwendung der gleichen Fotolackbeschichtungssystem, wie oben beschrieben. </li><li> Softbake der Wafer für 60 Sekunden bei 90 ° C. </li><li> Legen Sie sowohl die Wafer-und Foto vorgefertigte Maske in einem Mask Aligner. </li><li> Belichten den Photoresist-beschichtete Wafer mit einer UV-negativen Darstellung des gewünschten Parylen-C-Konfiguration. </li><li> Backen belichteten Wafer 60 Sekunden lang bei 110 ° C. </li><li> Entfernen Sie alle belichtete Fotolack von dem Wafer durch die Entwicklung in einer geeigneten Entwicklerlösung. </li><li> Ätzen von der ungeschützten Parylene. Verwenden Sie ein Sauerstoffplasma Etch-System (bei ​​einem Kammerdruck 50 Torr, 49 sccm O 2, 100 W HF-Leistung bei 13,56 MHz undeine Ätzrate von 100 nm / min), um die darunter liegende SiO 2 offenbaren. </li><li> Würfeln Wafer unter Verwendung eines geeigneten Schneidsäge (Spindeldrehzahl 30.000 min, Vorschubgeschwindigkeit 7 mm / s). </li><li> Spülen Chips in deionisiertem H 2 O und trocken blasen mit Stickstoff. </li><li> Shop-Chips (unbegrenzt) in staubfreien Schachteln, bis sie benötigt. </li></ol> 2. Chip Reinigung und Aktivierung: Protokoll <ol><li> Rückstände von Photoresist von Chips durch Waschen in Aceton für 10 Sekunden. </li><li> Spülen in entionisiertem destilliertem H 2 O 3x. </li><li> Make-up frisch Piranha-Säure (a 05.03 Quote von 30% Wasserstoffperoxid und 98% Schwefelsäure). ACHTUNG: Bereiten Piranha-Säure mit großer Sorgfalt. Es ist ein extrem starkes Oxidationsmittel, stark sauer ist, und Mischen von Wasserstoffperoxid mit Schwefelsäure eine exotherme Reaktion ist. Führen Sie diesen Schritt in einem sauren Abzug. Lassen Sie 2 min nach dem Mischen der Piranha-Säure passieren aber verwenden Sie innerhalb von 20 min. </li><li> Reinigen und Ätzen Chips durch Eintauchen in piranha Säure für 10 min. </li><li> Spülen Chips 3x in VE-H 2 O und übertragen in eine sterile Kulturschale. </li><li> Aktivieren Sie nun Chips für Mobil Musterung. Fügen Sie beispielsweise zwei Chips pro Vertiefung einer 6-Well-Platte und dann 2 ml fetales Rinderserum, um alle Chips voll einzutauchen. Führen Sie das, und alle nachfolgenden Stufen der Zellkultur, unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Gewebekultur Kapuze. </li><li> Chips in Serum für 3-12 h bei 37 ° C. HINWEIS: Schritte 2,4-2,7 sollten nacheinander und ohne Verzögerung zwischen den Schritten durchgeführt werden. Wenn Serum Aktivierung wird durch ≥ 24 h verzögert, nachdem Piranha-Behandlung, Zell Strukturierung aufgrund der reduzierten Zell Abstoßung von SiO 2-Regionen beeinträchtigt. Alternative Lösungen Aktivierung spezifischer Zellhaftproteine ​​enthält, kann anstelle des fötalen Rinderserum verwendet werden. Solche Lösungen verändern die Zellhaftungseigenschaften der zwei kontras Substraten (siehe repräsentative Ergebnisse für ein Beispiel). </li&gt; </ol> 3. Plating Zelllinien On-Chip: Protokoll <ol><li> Chips entfernen von ihren Aktivierungslösung und einmal waschen für 10 Sekunden in Hanks Balanced Salt Solution. </li><li> Zeigen Chip in einer Kultur gut und Platte gewählt Zelltyp als Suspension in seiner üblichen Wachstumsmedien. Optimale Zell Beschichtungs-Dichte hängt sowohl vom Zelltyp und geometrische Muster der Parylene-C auf dem Chip. Einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / ml ist ein vernünftiger Ausgangspunkt. </li><li> Imaging ist auf die zugrunde liegende Motivation für die Zell Musterung aber Lebendzellverhalten kann leicht mit einem Binokular und eine Digitalkamera mit einem geeigneten Relais-Linse beurteilt werden zugeschnitten. </li></ol>

<ol>
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Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Immersion von Chips in Piranha-Säure dient nicht nur, um restliche organische Material zu entfernen, sondern auch ätzt der Substratoberflächen. Dies ist der Schlüssel, um eine effektive Aktivierung mit fetales Rinderserum. Andernfalls verhindert Zell-Strukturierung und verändert das Verhalten der Zelle auf dem Chip zutiefst. Es ist nicht erforderlich, um Chips nach der Reinigung mit Piranha-Säure zu sterilisieren. Tatsächlich Sterilisation durch UV-Exposition wurde gezeigt, dass Zell Strukturierung in einer Dosis-abhängigen Weise 13 zu untergraben. Es ist darauf zu nach der Photolithographieprozess abwaschen gesamte restliche Photolack werden. Die anhaltenden Photoresist als unerwünschte Zyto-Klebeschicht, die Strukturierung durch parylene-C/SiO 2 Geometrie diktiert schreibt handeln. Aceton ist wirksam, wenn sie unter Verwendung der oben und mit den angegebenen Reagenzien beschrieben Photolithographieprozess. Jedoch können andere Arten von Photoresist erfordern eine andere Lösungsmittel. Um die Wirkung und den Erfolg der differe bewertennt Herstellungsschritte kann der Kontaktwinkel der zwei kontras Substraten gemessen werden. Fig. 2 zeigt die Veränderungen, die während des Chipaktivierungsprozess auftreten. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass spezifische Haft und abstoßenden Proteinkomponenten im Serum schließlich ermöglichen die Parylene-Chip strukturiert, um in das Zyto-Klebstoff oder Zyto-abstoßenden Eigenschaften ausüben. Alle repräsentative Ergebnisse verwendeten Chips mit einer Parylene Dicke von 100 nm, allerdings haben wir erfolgreich sowohl mit dickeren und dünneren Parylenschichten gemustert. Wichtig ist, ermöglicht diese photolithographischen Ätztechnik viel größere dreidimensionale Steuerung von Parylen als hier die Konfiguration veranschaulicht. Beispielsweise unter Verwendung einer Kombination von Photomasken, ist es möglich, Parylen Regionen Misch Dicke zu schaffen. Dies öffnet den Weg zur Schaffung Zellkulturen mit definierten dreidimensionalen Topographie, über die einfache Diktieren Regionen der Zelladhäsion / Abstoßung gehension, die möglicherweise eine Mittel zur Integration von mikrofluidischen Kanälen in das Konstrukt. Wie gezeigt, ist dies jedoch nicht Strukturierungs Plattform universell wirksam für Zelltypen. Verschiedene Zelllinien, mit ihren vielfältigen cell adhesion molecule-Profile, wenig überraschend anders verhalten, wenn auf dieser Plattform kultiviert. Wir haben noch nicht identifiziert die wichtigsten Komponenten im Serum, noch die kostenlose Zellmembran-Rezeptoren, die diese Zelle Strukturierungsplattform zu untermauern. Dies in Zukunft verspricht, seinen Nutzen und Spezifität zu erweitern. Zum Beispiel könnte ein &quot;Nicht-Muster&quot; Zelllinie genetisch modifiziert werden, um die erforderliche Adhäsionsmolekül zu exprimieren und so die Förderung Strukturierung.

Mechanismen zu verstehen, die die Zelladhäsion und Strukturieren diktieren synthetischer Materialien ist für Anwendungen wie beispielsweise Gewebe-Engineering, Arzneimittelforschung und die Herstellung von Biosensoren 1-3. Viele Techniken sind verfügbar und weiterentwickelt, die jeweils unter Ausnutzung der unzähligen biologischen, chemischen und physikalischen Faktoren, die Zelladhäsion zu beeinflussen. Hier beschreiben wir eine zellStrukturierungsTechnik, die ursprünglich für die Mikroelektronik-Fertigung Zwecke entwickelte Verfahren nutzt. Als solches ist die Plattform gut positioniert, um stromabwärts Integration von mikroelektronischen Technologien wie MEAs zu ermöglichen, in die Muster Plattform. Die Schnittstelle zwischen einer Zelle und einer benachbarten Membranmaterial ist bidirektional und komplex. In vivo extrazellulären Matrixproteinen bereitzustellen Struktur und Festigkeit und Auswirkungen auf das Verhalten der Zelle über Wechselwirkungen mit Zelladhäsionsrezeptoren. Ebenso Zellen in vITRO mit synthetischen Substraten zu interagieren über absorbiert Schichten von Proteinen 4, während die physikalisch-chemischen Einflüssen modulieren auch die Haftung. Zum Beispiel kann ein Polymeroberfläche kann mehr &quot;benetzbar&quot; (hydrophil) mit Ionen oder UV-Lichtbestrahlung, Ätzen oder durch Behandlung mit Säure oder Hydroxid 5 wiedergegeben werden. Etablierte Methoden zur Zell Strukturierung profitieren Sie von diesen und anderen Zell-Adhäsion Mediatoren. Beispiele sind Tintenstrahldruck 6, Mikropräge 7, physikalische Immobilisierung 8, 9 Mikrofluidik, Echtzeit-Manipulation 10 und selektive molekulare Anordnung Strukturierung (SMAP) 11. Jeder hat spezifische Vorteile und Grenzen. Ein wesentlicher Treiber in unserer Arbeit, ist aber zu Zelle Strukturierung mit mikroelektromechanische Systeme (MEMS) zu integrieren. MEMS beziehen sich auf extrem kleine mechanische Geräte mit Strom angetrieben. Diese überschneidet sich mit der Nanoskala äquivalent, nanoelectromechanischer Systemen. Dieses Konzept wurde praktisch nur bei Halbleiterfertigungsstrategien aktiviert, um Platz auf der Mikro nehmen. Mikrofertigungstechniken, die ursprünglich für Halbleiterelektronik entwickelt versehentlich nützlich für andere Anwendungen, wie Mobilelektro gefunden worden, zum Beispiel. Ein Schlüsselabwärts Ziel ist es, wie mikroelektronischen Technologien mit einem High-Fidelity-Zelle Strukturierungsprozess (Bildung einer bioMEMS Gerät) zu kombinieren. Mehrere bestehende und ansonsten zuverlässig und praktisch zellStrukturierungsTechniken sind mit dieser Idee nicht vereinbar. Zum Beispiel ist eine genaue Ausrichtung der eingebettete Mikroelektronik oder Biosensoren Grund ihre Wirksamkeit ist jedoch extrem schwierig mit einer Technik wie Mikroprägung zu erreichen. Um dieses Problem zu umgehen, sind wir auf einem SiO 2-Basis-Plattform, die Strukturierung fotolithographisch gedruckt Parylene-C verwendet tätig. Die Photolithographie beinhaltet Transfer von geometrischen Merkmalen voneine Maske auf ein Substrat mittels UV-Beleuchtung. Eine Maske wird unter Verwendung einer geeigneten Computer-Aided Design-Programm. Auf einer Glasplatte, eine dünne Schicht von nicht-transparenten Chrom stellt das gewünschte geometrische Muster (eine Funktion Auflösung von 1-2 mm ist möglich). Das Substrat, das strukturiert werden soll, mit einer dünnen Schicht aus Photoresist (ein UV-empfindliches Polymer) beschichtet. Das beschichtete Polymer wird dann ausgerichtet und in engem Kontakt mit der Maske gebracht. Ein UV-Quelle ist so aufgebracht, dass ungeschützte Bereiche bestrahlt werden und somit löslich und Wechsel werden in der nächsten Entwicklungsschritt, so dass eine Parylene-C Darstellung der Maske Muster hinter. Dieser Prozess während der Entwicklung von Halbleitervorrichtungen entstanden. Als solche sind Siliziumscheiben häufig als Substrat verwendet. Photolithographische Ablagerung von Parylene-C auf SiO 2 ist daher eine einfache und sichere Verfahren, die routinemäßig in der Mikroelektronik Reinraum stattfindet. Während Parylene hatmehrere wünschenswerte Eigenschaften Bioengineering (chemisch inert, nicht biologisch abbaubar), ist ein Faktor, jedoch in ihrem direkten Einsatz in der Zell Strukturierung seiner Natur aus schlechte Haftzelle, zum Teil auf seine extreme Hydrophobie zugeschrieben. Dennoch Parylen-C zuvor indirekt für Zellmusterungs als Ablöse zellulären Vorlage 12,13 verwendet, zum Beispiel. Dieser Ansatz wird durch schlechte Auflösung beschränkt und erfordert mehrere Schritte. Das hier beschriebene Verfahren nutzt stattdessen eine Säure Ätzschritt, gefolgt von Serum inkubiert, um sicherzustellen, dass die Parylen-C-Regionen werden zelladhäsive, durch eine Kombination von Verminderung der Hydrophobie und Serumproteinbindung. Das Endergebnis ist ein Konstrukt aus zwei verschiedenen Substraten, die nach der biologischen Aktivierung, manifestieren jeweiligen Cyto-Klebstoff oder Cyto-abstoßende Eigenschaften und damit für eine wirksame Zellmusterungs Plattform besteht. Wichtig ist, gibt es keine Notwendigkeit, die biologische ag einführenEltern in den Reinraum-Anlage, wie die gemusterte Substrate unbegrenzt vor der Verwendung gelagert werden (worauf sie mit fötalem Kälberserum oder eine andere Aktivierungslösung aktiviert sind). Diese parylene-C/SiO 2 Muster Plattform ist daher ein guter Kandidat für eine Koalition mit MEMS-Komponenten, da die Herstellungsprozesse so eng spiegeln die für die Mikroelektronik-Fertigung eingesetzt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

Handy Strukturierung Plattformen unterstützen breiten Forschungsziele, wie den Bau von vordefinierten in vitro neuronale Netze und die Erforschung bestimmter zentrale Aspekte der Zellphysiologie. Um einfach kombinieren Zelle Strukturierung mit Multi-Elektroden-Arrays (MEAs) und Silizium-basierte &quot;Lab on a Chip&quot;-Technologien, wird ein Mikro-kompatible Protokoll erforderlich. Wir beschreiben eine Methode, die Abscheidung der Polymer Parylene-C auf SiO 2-Wafer verwendet. Fotolithografie ermöglicht eine genaue und zuverlässige Strukturierung Parylene C bei Mikrometerauflösung. Anschließender Aktivierung durch Eintauchen in fötalem Rinderserum (oder ein anderes spezielles Aktivierungslösung) zu einem Substrat, in dem kultivierten Zellen haften, oder von Parylen oder SiO 2-Regionen bzw. abgestoßen. Diese Technik wurde Strukturierung von einem breiten Spektrum von Zelltypen (einschließlich primären murinen Hippocampus-Zellen, HEK 293-Zelllinie, menschliche Neuronen-wie Teratokarzinom erlaubtZelllinie, primären murinen Kleinhirnkörnerzellen und primären humanen Gliom-Stammzellen aus-ähnliche Zellen). Interessanterweise ist die Plattform nicht universell, was die Bedeutung der Zell-spezifische Adhäsionsmoleküle. Diese Zelle Strukturierungsprozess ist kostengünstig, zuverlässig, und vor allem kann in Standard-Mikrofabrikation (Chip-Herstellung)-Protokolle integriert werden, die den Weg für die Integration von mikroelektronischen Technologie.

Das photolithographische Verfahren zur Strukturierung SiO 2 mit Parylen-C ist in Fig. 1 dargestellt. Einmal hergestellt, die Aktivierung von Chips in fötalem Rinderserum ermöglicht eine Vielzahl von Zelltypen in Kultur strukturiert werden. Unsere Gruppe hat erfolgreich primären murinen Hippocampus-Zellen 14-16, die HEK 293-Zelllinie 17, die menschliche Neuronen-wie Teratokarzinom (hNT) Zelllinie 18, primären murinen Kleinhirnkörnerzellen und primären humanen Gliom-Stammzellen aus-ähnlichen Zellen strukturiert. Abbildung 3 zeigt robuste Strukturierung von HEK 293 Zellen auf einer Parylene Muster aus kreisförmigen Knoten mit &quot;Fadenkreuz&quot;-Erweiterungen. Chip-Aktivierung in diesem Beispiel war mit fötalem Rinderserum. Im Gegensatz dazu zeigt Fig. 4 die Möglichkeit, die Musterung Plattform durch alternative Aktivierungslösungen erhöhen. Verwendung einer Lösung von Rinderserumalbumin (3 mg / ml) und<html> Fibronectin (1 ug / ml) in HBSS, das vorherige Strukturierung Vorschrift invertiert wurde. Abbildung 5 zeigt einen anderen Zelltyp (ein Haupt Menschen stammenden Stammzelllinie aus einem hochgradigen Gliom). Hier ist die Geometrie des zugrundeliegenden Musters Auswirkungen Zellverhalten, mit dem in Fig. 4A gezeigten Muster Förderung des Zellwachstumsprozesses entlang dünne Parylen-C verfolgt, wie in Fig. 4B und 4C gezeigt. Einige Zelltypen nicht Muster bei Verwendung der etablierten fetales Rinderserum Aktivierung Protokoll. Abbildung 6 zeigt 3T3-L1-Zellen, die zu ohne erkennbaren Zyto-abstoßend oder Zyto-Klebstoff Unterschied zwischen Parylene-C und SiO 2-Regionen Konfluenz. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Flussdiagramm, welches das Verfahren zur Herstellung von Parylen C-Muster auf SiO 2. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> 2. Flussdiagramm, das die Änderungen des Kontaktwinkels für strukturierte Parylen C und SiO 2-Domänen bei der Chipaktivierungsschritte. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> 3. Lebenden Zellen von HEK 293-Zellen nach drei Tagen in vitro auf parylene-C/SiO 2 kultiviert. Chips für 3 h in fötalem Rinderserum inkubiert, danach wurden die Zellenin Suspension bei einer Konzentration von 5 x 10 4 Zellen / ml plattiert. Parylene-C fördert die Zellhaftung, während nackten SiO 2-Zellen abstößt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> 4. Lebenden Zellen von HEK 293-Zellen auf parylene-C/SiO 2 kultiviert nach drei Tagen in vitro-Chips 3 h in verschiedenen rationalisierten Aktivierungslösungen aktiviert:. A: fötales Rinderserum, B: Vitronectin (1 ug / ml) in HBSS, C: Rinderserumalbumin (3 mg / ml) + Vitronectin (1 ug / ml) in HBSS, D: Rinderserumalbumin (3 mg / ml) + Fibronectin (156, g / ml) in HBSS. Zellen ausplattiert wurden in Suspension bei einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / ml. Beachten Sie, wie die unterschiedliche Behandlung des Chips ist in Umkehrung der bisherigen Strukturierung Dogma, mit SiO 2 nun klebrig und Parylene-C abstoßend geführt. Parylene-C Knotendurchmesser 250 um, von Hughes et al. Angepasst 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">​​Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> 5. . Immunfluoreszenz-Bilder von primären humanen Gliom-Stammzellen aus-ähnlichen Zellen auf verschiedene Muster von Parylene-C auf SiO 2 A gewachsen: schematische Darstellung der in B und C gezeigt retikulären Parylene Design </strong&gt; B:.. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von fixierten Zellen (nach 4 Tagen in vitro) für gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) gefärbt C:. Lichtmikroskopische Aufnahme von lebenden Zellen auf demselben Chip D: Fluoreszenzbild darstellt, GFAP-gefärbten Zellen auf einem anderen Parylen . Design E:. Reflexions Bild des Knotens und sprach Parylene Design in D abgebildet <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> 6. Live-Cell-Imaging von 3T3 L1-Zellen nach vier Tagen in vitro an parylene-C/SiO 2 kultiviert. Chips für 3 Stunden in fetales Rinderserum nach w aktiviertelche Zellen wurden in Suspension (3 x 10 4 Zellen / ml) ausplattiert. In diesem Fall ist die Plattform nicht aktivieren Musterung, mit Zellen konfluent immer gleich auf Parylene-C und SiO 2-Regionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-kompatible Methode zur Zellstrukturierung auf SiO 2. Eine vordefinierte Parylene-C Design ist fotolithographisch auf SiO 2-Wafer gedruckt. Nach der Inkubation mit Serum (oder andere Aktivierungslösung) Zellen anhaften speziell auf (und wachsen nach der Konformität) zugrunde liegenden Parylene-C, und dabei von SiO 2-Regionen zurückgeschlagen.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

13.2K Aufrufe.  The University of Edinburgh.  Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-kompatible Methode zur Zellstrukturierung auf SiO 2. Eine vordefinierte Parylene-C Design ist fotolithographisch auf SiO 2-Wafer gedruckt. Nach der Inkubation mit Serum (oder andere Aktivierungslösung) Zellen anhaften speziell auf (und wachsen nach der Konformität) zugrunde liegenden Parylene-C, und dabei von SiO 2-Regionen zurückgeschlagen. 

Serie: Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Forschung

Biotechnik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Bewertung der Keratinozyten Verbreitung auf zwei- und dreidimensionale Typ I Kollagen Substrate

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...