<p class="jove_content"&gt; Wir danken DD Zhang für aufschlussreiche Diskussionen und großzügig bietet Reagenzien. MJ wird durch die NIH Herz-Kreislauf-Training Grant, die Arizona Technology Research Initiative Fund, und Achievement Rewards for Hochschule Wissenschaftler unterstützt. Diese Arbeit wird von New Innovator des NIH Director Award (1DP2OD007161-01), der National Science Foundation (0855890) und die James S. McDonnell Foundation unterstützt.</p

1. Herstellung von Formen zur Strukturierung eingesetzt <ol><li> Konzeption von Mustern. Patterns sind geschaffen, die dazu dienen, Zell-Netzwerke zu bilden, Steuer-Zell-Kontakt, zu isolieren Zellen, ahmen natürliche Strukturen, oder auf andere Weise führen die Zelladhäsion und Platzierung. </li><li> Computer-Aided Design oder CAD-basierte Erstellung von Muster und Erstellung von Photomasken. Das gewünschte Muster wird in CAD-Software wie AutoCAD konzipiert und wird dann an ein externes Unternehmen zur Herstellung einer Photomaske geschickt. </li><li> Photolithographie zu meistern Muster zu erzeugen. Glasträger sind entweder mit einem dünnen positive widerstehen oder einen dicken Negativ-Resist abhängig von der Größe der Struktur geschaffen gemustert. Glasträger sind für ihre Vorteile als kostengünstige, stärker als Silizium-Wafern und nicht produzieren so viel Staub, wenn sie gebrochen werden. Alternativ können auch andere praktische Strukturen wie Beugungsgitter als Urmodell verwendet werden. </li><li> Die strukturierte Folie ist mit einem Stapel von Dias, die nicht gewesen sein gemusterten befestigt. Alle Schritte werden in einem sauberen Werkbank durchgeführt, um die Staubentwicklung zu minimieren. </li><li> Erstellung von Master-Formen. Ein Behälter aus Alufolie etwas größer als die Stapel von Dias erstellt, um die 30 g Polydimethylsiloxan (PDMS), die dann über die photolithographisch strukturierte Oberfläche gegossen wird, um eine erste Form erstellen zu halten. Das PDMS wird entgast und dürfen für 1-2 Tage aushärten. </li><li> Nach dem Aushärten des PDMS ist aus der Master-Muster geschält und bildet eine Form für den nächsten Schritt. </li><li> 6 g der 2 Teil Epoxy (Devcon # 14310 (6 g) wird für 1 Minute gemischt und anschließend in die Master-Form, entgast und aushärten gelassen. Entgasung der Epoxid schnell getan werden muss (&lt;8 min) mit vielen Blasen brechen Zyklen und nur mit einer dünnen Schicht, bevor es die Epoxy-Sets und Blase Entfernung unmöglich wird, um die Luftblasen zu entfernen. Die 6 g verwendet erzeugt eine dünne Schicht, die schnelle Blase Entfernung erleichtert. </li><li> Nach einer Stunde wird die 2-teilige Epoxy teilweise geheilt werden und Epoxidharz können auf der Oberseite ohne Entgasung, um eine dickere Struktur, die Orientierung im späteren Schritten Griff zu produzieren hinzugefügt werden. Das Epoxidharz wird dann für 1-2 Tage aushärten. </li><li> Nach dem Aushärten wird das Epoxidharz aus der PDMS Master-Form entfernt und Band ist rund um die Epoxy-Form verpackt, um einen Container zu bilden. Eine Arbeitsgruppe Form wird dann durch Gießen PDMS auf die Epoxid-Schimmel, Entgasung des PDMS und Aushärtung für 1-2 Tage erstellt. </li><li> Nach dem Aushärten wird die Arbeitsform aus der Epoxid-geschält und gespeichert werden, um sauber zu halten. </li></ol> 2. Strukturierung von Oberflächen mit Formen für die Zell-Führung <ol><li> Kleine Teile der Arbeiterklasse Schimmel sind ausgeschnitten und auf einen Polystyrol-Petrischale. Die Standorte dieser Formabschnitte gekennzeichnet sind. </li><li> Ein Stativ ist aus dem kleinen Abschnitten und gewichtet, um konformen Kontakt zwischen der Arbeiterklasse Schimmel und der Petrischale Oberfläche zu gewährleisten gebildet. Gute Platzierung können, indem Sie am unteren Rand der Schale beobachtet werden. </li><li> Die Montage ist in die Plasmakammer gelegt. Plasma-Behandlung eingeleitet wird und bei 150 Pa weiterhin bei 29,6 W (max. Leistung) für 10 Minuten mit Luft-Plasma. </li><li> Nach der Plasmabehandlung sind die Form und das Gewicht Anklage entfernt. </li><li> Die Petrischale wird unter UV-Licht für 10 Minuten der Sterilisation in der Biosicherheit Schrank gestellt und dort bis und mit Zellen besiedelt gespeichert. </li></ol> 3. Seeding Oberflächen mit Zellen <ol><li> SH-SY5Y CRL-2266 humanen Neuroblastom oder andere Zellen kultiviert werden über Standard-Protokolle für den Zelltyp. </li><li> Der Zusammenfluss von SH-SY5Y CRL-2266 humanen Neuroblastom-Zellen ist optisch vor der Aussaat auf die gemusterte Oberfläche gemessen. </li><li> Standard-Zell-Splitting wird durchgeführt, um die Zellen von der Oberfläche der Petrischale zu entfernen. </li><li> Die Zellen, einmal frei schwebend, auf die Oberfläche der gemusterten Petrischale, nachdem sie verdünnt, um die gewünschte Zusammenfluss erreichen, wenn auf der strukturierten Oberfläche platziert ausgesät. </li><li> Die Zellen werden absitzen und heften sich an die Oberfläche. </li><li> Die strukturierte Petrischale wird für mehrere Stunden bis mehrere Tage inkubiert, während die Zellen auf das Muster durch das Plasma erzeugt montieren. </li><li> Wenn die Kultivierung der Neuroblastom-Zellen, Retinsäure (10 pM) wird täglich um die Zellen zu induzieren, um in einem Neuron-ähnliche Zustände zu unterscheiden aufgenommen. Die Zugabe der Retinsäure im Dunkeln durchgeführt. </li><li> Retinsäure ist täglich für mehrere Tage aufgenommen, nach der Differenzierung zu beobachten sein wird. </li><li> Medien ersetzt wird alle 3-4 Tage. </li></ol> 4. Beobachtung und Analyse <ol><li> Regelmäßige Aufnahmen der lebenden Zellen oder Videos getroffen werden, um die das Verhalten der Zelle im Laufe der Zeit zu beobachten. Für Live-Bilder werden die Zellen in einem Mikroskoptisch top Inkubator, die die Zellen hält bei 37 ° C, 100% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 platziert. Es können auch Zellen fixiert und für die Beobachtung unter Fluoreszenz angefärbt werden </li><li&gt; Die Bilder oder Videos von den Zellen, die gefangen genommen wurden sind, um ein Bild-Analyse-System importiert und Messungen werden auch Wachstum, Zellgröße, Migrations-Geschwindigkeit, Differenzierung, die Ausrichtung, Anordnung von spezifischen Proteinen und anderen durchgeführt. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Eine typische Folge der Durchführung der Plasma-Lithographie ist die Bildung eines Musters von Zellen, die eine willkürliche oder natürliche Struktur ähnelt. Dies ist in Abbildung 1a-b, wo Leitungen und Netze von Neuronen geschaffen gesehen haben. Andere Zelltypen können ebenso wie in Abbildung 1c-d, die menschliche Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) und C2C12 Skelettmuskelzellen bilden Netze Ausstellungen zu sehen. Materialien wie Poly-L-Lysin können auch gemustert werden, Bild 1e, um die Befestigung von bestimmten Zelltypen und für andere Zwecke zu erleichtern. Im Falle der Neuronen gezeigt, was geschaffen werden Netzwerke von Zellen, die Verbindungen zwischen ihnen. Dieser repliziert, was kommt in der Natur im Gehirn, wo Neuronen haben diskrete Verbindungen zwischen benachbarten Zellen, die die Arbeitsweise des Gehirns beeinflusst. Mit der Schaffung einer solchen Struktur im Labor kann die Anzahl, Position, Frequenz und andere Faktoren, die Verbindungen systematisch kontrolliert werden. Das Ergebnis dieser Anklagen visuell gemessen werden und zusätzliche Eingaben wie chemische oder elektrische Stimulation kann implementiert, um die Netzwerk-Verhalten Sonde werden. Ein negatives Ergebnis wäre ein überwuchert oder unvollständige Muster oder eine verunreinigte Probe. Eine unvollständige oder überwachsen Muster würde von der Aussaat des Substrats mit entweder zu wenige oder zu viele Zellen, die nicht liefern das Muster mit einem idealen Menge an Zellen zur Folge hätte. Außerdem, wenn das Muster nicht vorgesehen ist korrekt (z. B. Linien zu schmal) die Zellen nicht in der Lage zu befestigen und erfolgreich zu wachsen auf ihr. Im Fall einer verunreinigten Probe würde eine sorgfältige Reinlichkeit nicht während einer der Schritte beibehalten haben, obwohl dies selten ist, wenn nach einer ordnungsgemäßen Zellkultur-Protokoll aufgrund der Tatsache, dass die Plasma-Strukturierung auch sterilisiert das Substrat. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Strukturierung von Zellen und Protein.

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L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth.">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li><li>Murakami, T., Kuroda, S. -. i., Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma:+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment.">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li><li>Strobel, M., Lyons, C. 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Die Zelle Untersuchung hier vorgestellte Methode ermöglicht die Erstellung von komplexen Mustern von mehrzelligen Netzwerken, die biologischen Strukturen imitieren sowie eine Methode, um Reize, die subzelluläre in der Natur, die dann erleichtert Untersuchungen beider gruppiert das Verhalten der Zelle und Single-Zell-Reaktionen auf Umwelteinflüsse sind zu produzieren. Die Anwendung dieser Methode ist einfach, aber robust, wie es schnell mit geringen Kosten Geräte im selben Labor wie der Zellkultur durchgeführt werden. Es ist auch stark Zelle empfindlich, ermöglicht eine einfache Beobachtung der resultierenden Verhalten und ist von Natur aus stabil über lange Zeiträume, die Untersuchung der langfristigen Verhalten der Zelle ermöglicht. Es ermöglicht zudem ein breites Spektrum von Experimenten durchgeführt, wie es mit vielen Zelltypen und können beliebige Muster zu erstellen. Die langfristige Stabilität der Technik ergibt sich aus der Tatsache, dass die Funktionalisierung der Oberfläche durch das Plasma vermittelt ein Teil der Oberfläche ist und nicht eine Beschichtung oder andere Schicht, die entfernt oder abgebaut werden kann. Wenn unter flüssigem gehalten wird, kann diese Art der Modifikation behält seine Zelle führen Fähigkeit für Monate. Der wichtigste Teil des Experiments notwendig, um aussagekräftige Ergebnisse zu gewährleisten, ist die Erstellung der Master-Muster, die letztlich für die Zell-Führung genutzt werden. Wenn dieses Muster ist nicht richtig entwickelt, werden die Zellen nicht angemessen, um das Muster zu reagieren und können keine brauchbaren Verhalten. Parameter wie Linienbreite, Muster Abstand, und andere können einen großen Einfluss auf die Zelle Kompatibilität mit einem bestimmten Muster, und in der Regel eine Reihe solcher Parameter kann über die erste Photomaske Bildschirm für die am besten geeignete Design erstellt werden. Andere wichtige Parameter in Bezug auf out Strukturierung Durchführung gehören Formenbau, die Aufrechterhaltung einer staubfreien Umgebung, Zell-Aussaat und allgemeine Sterilität der Zellkultur. Mold Schöpfung kann durch die verschiedenen Schritte, die Übertragung verpflichtet, für die wiederholte PDMS Ablegen einer Epoxy Form erlauben, sind erfolgen. Die Epoxy-Form entsteht, weil es nicht auf die gleiche Weise abgebaut wird als widerstehen Form mit kleinen, Strukturen mit großem Seitenverhältnis unter wiederholter Gießen. Wenn der Transfer Moulding korrekt erfolgt ist, werden die Abmessungen und die Ausbeute nicht betroffen, aber wenn sie falsch wie durch schlecht Entgasung, unvollständige Härtung, oder übermäßige Erwärmung getan, Blasen, Unebenheiten und Verformungen eines Musters kann auftreten, wirkt sich das Endergebnis. In Bezug auf die Aufrechterhaltung einer staubfreien Umgebung, müssen die Formen so sauber wie möglich gehalten werden, wie Staub mit den richtigen Kontakt zwischen der Arbeiterklasse PDMS Form und die Oberfläche und damit richtigen Plasma-Abschirmung und chemische Strukturierung stören können. Die Aussaat Dichte der Zellen muss auch optimiert, um sicherzustellen, dass weder zu wenige oder zu viele Zellen das Muster Gebiet bewohnen und Sterilität muss beibehalten werden, um Bakterien und andere Verunreinigungen der Zellen verwendet zu vermeiden. Die Technik kann auch mit anderen Elementen wie Mikrofluidik, Mikroelektroden und mechanische Sonden eingebaut werden. Dies sorgt für zusätzliche Reize zu den Zellen, um besser zu replizieren verschiedenen physiologischen Bedingungen während der Experimente und die zukünftige Arbeit basiert auf der Untersuchung der Auswirkungen dieser Kombinationen konzentriert

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Plasma-Reiniger und Vakuumkammer </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> Inverted Fluoreszenz-und Phasenkontrast-Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskoptisch top Inkubator </td><td> AmScope </td><td> Modell TCS-100 </td><td> Modifiziert, um ein Gehäuse, das eine entsprechende Atmosphäre Lieferungen umfassen </td></tr><tr><td> Polystyrol-Petrischale </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polydimethylsiloxan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Epoxy </td><td> Devcon </td><td> 2 ton klar, Epoxy # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturmedien </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Medien folgt Standard-Formulierungen für Zelltyp </td></tr><tr><td> Retinsäure </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography surface patterning for creation of cell networks

Systematische Manipulation einer Zelle Mikroumgebung mit mikro-und nanoskaliger Auflösung wird häufig für die Entschlüsselung verschiedener zellulärer und molekularer Phänomene erforderlich. Um dieser Anforderung haben wir einen Plasma-Lithographie, die zellulären Mikroumgebung durch die Schaffung einer strukturierten Oberfläche mit Strukturgrößen im Bereich von 100 nm bis in den Millimeterbereich zu manipulieren entwickelt. Das Ziel dieser Technik ist in der Lage sein zu lernen, in einer kontrollierten Art und Weise, das Verhalten einzelner Zellen als auch für Gruppen von Zellen und ihrer Wechselwirkungen. Dieses Plasma-Lithographie-Verfahren basiert auf selektiven Modifizierung der Oberflächenchemie auf einem Substrat durch Abschirmung der Kontakt der Niedertemperatur-Plasma mit einer physischen Form basiert. Diese selektive Abschirmung hinterlässt eine chemische Muster, Zelladhäsion und Bewegung führen kann. Dieses Muster oder Oberflächen-Templates können dann verwendet, um Netzwerke von Zellen, deren Struktur, die in der Natur nachzuahmen und erzeugt einen kontrollierbaren Umfeld für experimentelle Untersuchungen zu erstellen. Die Technik ist gut für das Studium biologisches Phänomen geeignet, da sie stabile Oberfläche Muster produziert auf transparente polymere Substrate in eine biokompatible Weise. Die Oberfläche Muster letzten Wochen und Monate und kann somit Guide Interaktion mit Zellen über lange Zeiträume, die das Studium der langfristigen zelluläre Prozesse, wie die Differenzierung und Anpassung erleichtert. Die Modifizierung der Oberfläche ist in erster Linie chemischer Natur und somit nicht vorstellen topografischen oder physische Störungen für die Interpretation der Ergebnisse. Darüber hinaus beinhaltet keine aggressiven oder giftigen Substanzen zu Strukturierung zu erreichen und ist für die Zellkultur kompatibel. Darüber hinaus kann es angewandt, um verschiedene Arten von polymeren Substraten, die durch die Fähigkeit, ihre Eigenschaften stimmen ideal für sich und werden häufig in biologischen Anwendungen zu ändern. Die erzielbare Auflösung ist auch von Vorteil, als Isolierung spezifischer Prozesse wie Migration, Adhäsion oder Bindung kann für diskrete, klar Beobachtungen an den einzelnen zu mehrzelligen Ebene. Diese Methode wurde verwendet, um unterschiedliche Netzwerke verschiedener Zelltypen für Untersuchungen mit Migrations-, Signal-, Gewebe-Bildung und das Verhalten und die Interaktionen von Neuronen angeklagt in einem Netzwerk zu bilden.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Ein vielseitiges Plasma Lithographie wurde entwickelt, um stabile Oberfläche Muster zur Führung Anheftung der Zellen zu generieren. Diese Technik kann angewendet Cell Networks einschließlich derer, die natürlichen Geweben zu imitieren und hat für das Studium mehrere, unterschiedliche Zelltypen verwendet worden zu erstellen.

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K Aufrufe.  University of Arizona. Ein vielseitiges Plasma Lithographie wurde entwickelt, um stabile Oberfläche Muster zur Führung Anheftung der Zellen zu generieren. Diese Technik kann angewendet Cell Networks einschließlich derer, die natürlichen Geweben zu imitieren und hat für das Studium mehrere, unterschiedliche Zelltypen verwendet worden zu erstellen.

Serie: Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Forschung

Biotechnik

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&amp;#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Einem mikrofluidischen System mit Oberflächenstrukturierung zur Untersuchung Kavitationsblase (e) -Cell Interaktion und die Resultierende Bioeffects auf der Ebene einzelner Zellen

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data sets of patient or specimen anatomy in clinical or preclinical settings. However, the use of a virtual, on-screen display limits the ability of these tomographic images to fully convey the anatomical information embedded within. One solution is to interface a biomedical imaging data set with 3D printing technology to generate a physical replica. Here we detail a complementary method to visualize tomographic imaging data with a hand-held model: Sub Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. SSLE offers several unique benefits including: the facile ability to include anatomical labels, as well as a scale bar; streamlined multipart assembly of complex structures in one medium; high resolution in the X, Y, and Z planes; and semi-transparent shells for visualization of internal anatomical substructures. Here we demonstrate the process of SSLE with CT data sets derived from pre-clinical and clinical sources. This protocol will serve as a powerful and inexpensive new tool with which to visualize complex anatomical structures for scientists and students in a number of educational and research settings.

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving SSLE of Glass Crystals

A methodology is described herein for representing anatomical imaging data within crystals. We create scaled three-dimensional models of biomedical imaging data for use in Sub-Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. This tool offers a useful complement to computational display or three-dimensionally printed models used within clinical or educational settings.

Scaled Anatomisches Modell Creation of Biomedical Imaging tomographische Daten und assoziierten Labels für spätere Teilfläche Laser-Gravur (ssle) von Glaskristall

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...