Für JBW:; Diese Arbeit wurde von der Coulter Foundation, Beyster Stiftung, der Undergraduate Research Opportunity (UROP) Sommer-Programm für ATA und einem National Science Foundation Graduate Student Research Fellowship (. 2010101926 ID gewähren keine DGE 0.718.128) unterstützt.

Ein. Phase-System Charakterisierung: Ermittlung Schwellenwerte für Phase Separation <ol><li> Planen Lösungen enthaltend PEG und DEX in dem gewünschten Puffer oder Zellkulturmedium, wie in Figur 1 (lila Punkte) in 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen gezeigt. Im Folgenden wird PEG und DEX auf 35 kDa PEG und 500 kDa DEX beziehen, aber kritischen Konzentrationen ändert sich je nach den beiden Polymeren verwendet. Notieren Sie sich die Masse von PEG und DEX in jeder Lösung. High-Konzentration Polymerlösungen kann mehrere Stunden dauern, sich aufzulösen. Vortexen für Serum-freie Lösungen verwendet werden. Für Medien, die Proteine ​​oder Serum, legen Sie die Rohre auf einer rocken Stufe bis beide Polymere vollständig gelöst sind. Das Gewicht der verwendeten Medien, die Polymere auflösen und beachten Sie die anfänglichen Konzentrationen. </li><li> Sobald die Polymere vollständig gelöst sind, sollten die Lösungen erscheinen möglich. Dies ist der erste Hinweis darauf, dass eine Phasentrennung erfolgt ist. Um dies zu bestätigen, damit diePolymerlösungen in vertikaler Position bei Raumtemperatur für 20 Min. ruhen. Zentrifugation bei 1000 xg kann die Phasentrennung zu beschleunigen. Je dichter untere Phase wird DEX-reich sein und die obere Phase wird PEG-reichen sein. </li><li> Langsam fügen zusätzlichen Puffer oder Medien an den Rohren. Kleinen Schritten sollte, um nicht die Überschwingen Phasentrennungspunkt verwendet werden. </li><li> Wenn die Lösung klar wird, und nicht mehr phasensepariert nach Zentrifugation wird der Schwellenwert für die Phasentrennung erreicht wurde. Aufzeichnen das Endgewicht des Rohres. </li><li> Verwendung der vorherigen aufgezeichneten Gewichte für die Polymeren, zusammen mit dem Endgewicht nach Zugabe Medien bestimmen% Gew. / Gew. von jedem der beiden Polymere bei dem eine Phasentrennung nicht mehr auftritt. </li><li> Plotten diese Werte als% Gew / Gew PEG auf der y-Achse und% wt / wt DEX auf der x-Achse. Dieser Plot, wie die binodale Kurve bekannt ist, kann verwendet werden, um den Schwellenwert-Konzentration für eine Phasentrennung für unterschiedliche concentrati bestimmenons von PEG / DEX in einer bestimmten Zellkulturmedium. </li></ol> 2. Konfiguration 1: Ausschluss Strukturierung (96-well Platte Format) <ol><li> Planen getrennte Lösungen von 5,0% w / w PEG und 12,8% Gew. / Gew. DEX in Zellkulturmedium. Verwenden ATPS Lösungen von mindestens dem Doppelten der kritischen Punktes, um sicherzustellen, dass ein ATPS nachdem die Polymere mit Bezug zueinander äquilibrieren bleibt. Es gibt eine kleine Menge des Flusses von DEX in die PEG-reichen Phase und umgekehrt, also arbeiten zu nahe der kritischen Konzentration kann zu einem Verlust des Phasensystems als Konzentrationen Unterschreiten kritischer Punkt führen. In ähnlicher Weise kann die Übertragung der Zellkulturschale zu einer Feuchte-und Temperatur-kontrollierten Inkubator verändern die zweiphasige Eigenschaften und stellen die beiden Lösungen mischbar. Hinweis: Einige Zellen können besser mit anderen ATPS Formulierungen. Akzeptablen Formulierungen können basierend auf den binodale Kurven aus Teil 1 bestimmt, ausgewählt werden. </li><li> Ernten Sie die Zellen, die zur Ausgrenzung patte verwendet werdenrning. Ermitteln Sie die Gesamtzahl / Konzentration von Zellen zur Verfügung. Optional: Kennzeichnen der Zellen mit CellTracker oder andere nicht-zytotoxischen Etiketten für die Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Pelletieren der Zellen und Resuspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen von 5,0% PEG, um die gewünschte Anzahl von Zellen für den Ausschluss erreichen. Zum Beispiel erfordert eine Vertiefung einer 96-Well-Platte 37.500 Fibroblastenzellen in 200 ul der PEG resuspendiert werden bis zur Konfluenz produzieren des folgenden Tages. Skalieren diese Zahlen als geeignet für andere Zelltypen und Kultur Substrat Größen. </li><li> Mit einer Mikropipette, verzichten 0,5 ul Tröpfchen DEX auf ein trockenes Zellkultursubstrat. Größeres Volumen Tröpfchen größere Sperrzonen. Tröpfchen mit einer Größe von 0,1 bis 1 ul werden für den Ausschluss Mikrostrukturierung empfohlen. Optional: DEX Tröpfchen können 24 Stunden vor der Zeit abgelagert werden und bei Raumtemperatur zu entwässern. Dies kann zu saubereren Muster. </li><li> Geben Sie 200 ul PEG Zellsuspension in ter gut zur Deckung der DEX Tröpfchen. </li><li> In einem befeuchteten Inkubator für 12 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. Stellen Sie sicher, dass das Gericht nicht bei der Handhabung und dass es auf einem Niveau Inkubator Regal gestellt zu verhindern, dass die Muster gekippt. </li><li> Entfernen Sie die PEG-Lösung und dreimal mit 200 ul Kulturmedium. </li><li> Fügen Sie frisches Kulturmedium und Rückkehr in den Inkubator. </li><li> Überwachen Sie die Kulturen in regelmäßigen Abständen zu Zelle Bewegung in der Sperrzone zu beobachten. </li></ol> 3. Konfiguration 2: Island Strukturierung (96-well Platte Format) <ol><li> Planen Lösungen von 5,0% w / w PEG und 12,8% Gew. / Gew. DEX in Zellkulturmedium wie oben. </li><li> Ernten Sie die Zellen, die zur Insel Strukturierung verwendet werden. Ermitteln Sie die Gesamtzahl / Konzentration von Zellen zur Verfügung. </li><li> Pellet und Zellen in einem geeigneten Volumen von 12,8% DEX, um die gewünschte Konzentration der Zellen für die Insel Strukturierung zu erreichen. Konzentrationen von 5.000 cells / ul oder weniger sind für stark haftende Zelltypen empfohlen. Für Zellen, die Schwierigkeiten Anbringen oder Zellen, die lose anhaften haben, Konzentrationen von bis zu 10.000 Zellen / ul in Betracht. </li><li> Arbeitet schnell zu vermeiden Trocknen Pipette 0,5 ul Tröpfchen von DEX auf ein trockenes Zellkultursubstrat, wie oben beschrieben. Lassen Sie keine Tröpfchen zu trocknen. Optional: 200 ul PEG-Lösung kann der gut aufgenommen der Zeit voraus sein. DEX Tröpfchen können dann in der PEG-Lösung, wo sie auf den Boden sinken wird, und wenden die Kultur Oberfläche abgeschieden werden. Dies kann zu saubereren Inselmuster. </li><li> Bedecken Sie die DEX Tröpfchen mit 200 ul PEG. </li><li> In einem befeuchteten Inkubator für 12 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. Stellen Sie sicher, dass das Gericht nicht bei der Handhabung und dass es auf einem Niveau Inkubator Regal gestellt zu verhindern, dass die Muster gekippt. </li><li> Entfernen Sie die PEG-Lösung und dreimal mit 200 ul Kulturmedium. </li><li> Fügen Sie frisches Kulturmediummittel-und Rückkehr in den Inkubator. </li><li> Überwachen Sie die Kulturen regelmäßig Zellbewegung und Proliferation nach außen von den Inseln zu beobachten. </li></ol> 4. Konfiguration 3: Ausschluss Co-Kulturen (96-well Platte Format) <ol><li> Planen Lösungen von 5,0% w / w PEG und 12,8% Gew. / Gew. DEX in Zellkulturmedium wie oben. </li><li> Ernten Sie die Zellen, die zur Ausgrenzung und Insel Strukturierung verwendet werden. Ermitteln Sie die Gesamtzahl / Konzentration der Zellen für jeden Zelltyp. Optional: Einige Zellen Paarungen kann dramatisch anders Verbreitung Indizes anzuzeigen. Um die ausgeschlossenen Zellen aus übervölkern die Insel gemusterten Zellen (insbesondere für die langfristige Kulturen) verhindern, behandeln die Zellen für Ausschluß mit Mitomycin C für 2 Stunden oder gebraucht bestrahlen sie vor der Ernte. Dadurch wird verhindert, Proliferation. Fluorescent CellTracker Farbstoffe können verwendet werden, um die beiden Zellpopulationen unterscheiden, wenn es erforderlich ist. </li><li> Pellet die Zellen und das Pellet für exclusion Musterbildung in einem geeigneten Volumen von 5,0% PEG zur Erzielung der gewünschten Anzahl von Zellen, wie oben beschrieben. Das Pellet für Insel Musterbildung in einem geeigneten Volumen von 12,8% DEX, um die gewünschte Konzentration der Zellen zu erreichen, wie oben. </li><li> Mit einer Mikropipette, verzichten 0,5 ul Tröpfchen DEX Zellsuspension auf einem trockenen Zellkultursubstrat. Lassen Sie keine Tröpfchen zu trocknen. </li><li> Bedecken Sie die DEX Tröpfchen mit 200 ul PEG Zellsuspension. </li><li> In einem befeuchteten Inkubator für 12 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. Stellen Sie sicher, dass das Gericht nicht bei der Handhabung und dass es auf einem Niveau Inkubator Regal gestellt zu verhindern, dass die Muster gekippt. </li><li> Entfernen Sie die PEG-Lösung und dreimal in 200 ul Kulturmedium. </li><li> Fügen Sie frisches Kulturmedium und Rückkehr in den Inkubator. </li><li> Überwachen Sie die Co-Kulturen, die Interaktion zwischen Zellpopulationen zu beobachten. Optional: Controls kann durch Ausführen Ausschluss oder die Insel Strukturierung indiv. vorbereitet werdenidually, durch Co-Kultivierung von Zellen, die nicht interagieren oder durch Blockieren Wege des Interesses an einem oder beiden Zellpopulationen vor oder nach einem Mustern. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die ATPS Zelle Mikrostrukturierung Methode erfordert nur sehr wenig Know-how über Kenntnisse in Zellkultur-Techniken und kann schnell gemeistert werden. Die Vorteile dieser Vorgehensweise sind, dass sie preiswert, schnell und kompatibel mit einer Vielzahl von Zelltypen und Kultur Formaten ist. Aus diesen Gründen sollte unser Protokoll leicht Biowissenschaftler, insbesondere diejenigen, die Zellproliferation, Migration und Chemotaxis und den Einfluss der juxtacrine und parakrine Interaktionen zwischen Zellpopulationen ...

Wässriger Zweiphasensysteme (ATPSs) bilden, wenn Lösungen aus zwei inkompatiblen Polymeren miteinander bei ausreichend hohen Konzentrationen vermischt. Phasentrennung wird durch eine Vielzahl von Faktoren, die das Molekulargewicht und die Polarität der Polymeren, Temperatur der Lösung, pH-Wert und ionischen Gehalt der wässrigen Lösungsmittel 1, 2 umfassen beeinflusst. Der Punkt, an dem die beiden Polymerlösungen separaten von den physikochemischen Eigenschaften des ausgewählten Phasen-System bestimmt wird, sondern erfolgt in der Regel bei niedrigen Polymer Konzentrationen (weniger als 20% wt / wt) unter nicht-denaturierenden Bedingungen, wodurch ATPSs für Biotechnologie eingesetzt werden Anwendungen 3-9. Die mit Abstand am intensivsten untersuchten ATPS ist die Polyethylenglykol (PEG) / Dextran (DEX) System. Die ATPS durch diese kostengünstig und biokompatiblen Polymeren gebildet wurde ursprünglich zur Reinigung von Biomolekülen über molekulare Partitionierung 2, 10 beschrieben. Abtrennungtritt bei zusätzlichen Molekülen oder Partikeln, die nicht dem Phasensystem beitragen mit PEG und DEX werden gemischt. Basierend auf ihren relativen Affinitäten für entweder DEX oder PEG, werden die Moleküle oder Teilchen bevorzugt in einer der beiden Phasen oder an der Schnittstelle befinden. Eine weitere Eigenschaft des PEG / DEX ATPS ist die Existenz der Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymer-Phasen. ATPSs von PEG und DEX gebildet zeigen im Allgemeinen Grenzflächenspannungen, die viel niedriger als in anderen Flüssig-Flüssig-Zwei-Phasen-Systeme wie Öl und Wasser, aber die Grenzflächenspannung Kräfte üben noch immer Auswirkungen auf kleine Partikel wie Viren, Zellen und Proteinaggregate 2 , 11-13. Da schließlich höhermolekularen PEG und DEX separaten bei niedrigen Konzentrationen (weniger als 5% Gewicht / Gewicht für Polymere mit hohem Molekulargewicht Sorten) in Anwesenheit von physiologischen Konzentrationen von Salzen, gibt es wenige oder gar keine schädlichen Wirkungen auf Säugetierzellen innerhalb dieser eingearbeitet Systeme14-16. Kürzlich haben die Grenzflächeneigenschaften und Partitionierung Wirkungen ATPSs von unserem Labor für Zelle Strukturieren 14, 16-20 angewandt. Dies wurde durch Mikrostrukturierung eine dichtere Lösung auf DEX Zellkultursubstraten in Gegenwart von PEG durchgeführt. Wenn Zellen in die PEG-Phase eingearbeitet sind, werden sie aus der Eingabe der DEX Tröpfchen aufgrund PEG / DEX Grenzflächenspannung 20 ausgeschlossen. Wenn Zellen in der DEX Phase gemustert werden, werden sie an der Oberfläche des Substrats durch Zellkultur Grenzflächenspannung und Partitionierung 16, 17, 19 beibehalten. Im Gegensatz zu anderen Verfahren zur Musterbildung Zelle ist ATPS Zelle Strukturieren einfach zu erlernen und erfordert nur rudimentäre Wissen über die Polymere selbst, und die Fähigkeit zur Zellkultur durchzuführen und eine Mikropipette. Andere Methoden zur Zelle Strukturierung beinhalten oft spezielle Ausrüstung und Ausbildung, die nicht leicht zu th übersetzte Life Sciences. Zum Beispiel können einige Methoden (Mikrokontaktdrucken oder Tintenstrahldruck)-Muster Zellen indirekt durch Aufbringen von Mustern zelladhäsive Biomoleküle an einem Kultursubstrat, das anschließend als Stellen für die Zellanheftung 21, 22 dienen. Obwohl indirekten Ansätzen nützlich für einige Zelltypen sind, erfordern sie einen hohen Grad an Geschicklichkeit und Benutzers Spezialausrüstung die Musterbildung Werkzeug herzustellen, und können Spezifität fehlt Abhängigkeit von der speziellen Zelltyp / Biomolekül Muster. Alternativ können Zellen, die mit hoher Spezifität Muster durch direkte Strukturierung Ansätze, die laminare Strömung Strukturieren, stenciling und 23-26 gehören Tintenstrahldruck abgeschieden werden. Jedoch erfordern diese Techniken auch Benutzerexpertise und Spezialausrüstung und kann Zellen während des Druckprozesses zu beschädigen. Obwohl diese Ansätze in der Regel produzieren präzise Muster der Zellen, Zell-Strukturierung ein nützliches Werkzeug in den Lebenswissenschaften zu sein, muss es kostengünstig a seinnd einfach zu implementieren. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von strukturierten Zellkulturen mit den ATPSs in unserem zuvor veröffentlichten Anwendungen beschrieben. Mit nur Mikropipetten können Anwender Zellausschlussschicht Zonen oder Zelle Inseln Zellmigrationsassays. Dies wird mittels PEG / DEX Grenzflächenspannung, die entweder beibehält Zellen im DEX Phase oder schließt Zellen in der PEG-Phase vom abgeschiedenen DEX erreicht. Durch Kämmen diese beiden grundlegenden Strukturieren Techniken ist es möglich, schnell zu generieren Co-Kulturen von Zellen wie Leber-Fibroblastenzelle Co-Kulturen. Strukturierungsverfahren, ATPS Parametern und erwarteten Ergebnisse sind in Einzelheiten beschrieben.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Hersteller </td></tr><tr><td> Dextran 500.000 kDa </td><td> Pharmacosmos, Dänemark </td></tr><tr><td> Polyethylene Glycol 35.000 kDa </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Hela </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> NIH 3T3 </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> Handy Tracker </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

Zelle Strukturierung Technologien, die schnell, einfach zu bedienen und erschwinglich sind, werden für die zukünftige Entwicklung von Hochdurchsatz-Zell-Assays, Plattformen zur Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen und Gewebe technischer Systeme benötigt werden. Diese detaillierte Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Erzeugen von Co-Kulturen von Zellen unter Verwendung von biokompatiblen Lösungen von Dextran (Dex) und Polyethylenglykol (PEG), die Phasentrennung bei über dem Schwellenwert Konzentrationen kombiniert. Zellen können in einer Vielzahl von Konfigurationen unter Verwendung dieses Verfahrens strukturiert werden. Zellausschlussschicht Strukturierung kann durch Drucken von Tröpfchen DEX auf einem Substrat und Abdecken mit einer Lösung von PEG mit Zellen durchgeführt werden. Die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen gebildet bewirkt Zellen um die Außenseite des DEX Tröpfchens fallen und bilden eine kreisförmige Lichtung die für die Migration Assays verwendet werden kann. Zelle Inseln können durch den Verzicht auf eine Zelle reichen DEX Phase in eine PEG-Lösung oder durch Abdecken des DEX strukturiert werdenTröpfchen mit einer Lösung von PEG. Co-Kulturen können direkt durch die Kombination Zellausschlussschicht mit DEX Insel Strukturierung gebildet werden. Diese Verfahren sind mit einer Vielzahl von Liquid-Handling Ansätze, einschließlich manueller Mikropipettiervorrichtung und können mit nahezu jedem adhärenten Zelltyp eingesetzt werden.

Um eine geeignete Kombination von PEG und DEX für Zelle Strukturieren auszuwählen, ist es wichtig, um die binodale Kurve bestimmen. Diese Kurve skizziert die Punkte, an denen ein ATPS bilden können und für einen gegebenen Satz von Polymeren auf Temperatur, pH und Ionengehalt variieren. Zum Kultivieren von Zellen, die angepasst Mediums Formulierungen erfordern kann es erforderlich sein, um experimentell die binodale Kurve. Dies wird durch Erzeugen einer Reihe von ATPSs, die weit von der binodale und Variieren in ihre...

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Wässriger Zweiphasensysteme wurden gleichzeitig Muster mehrere Populationen von Zellen verwendet. Dieses schnelle und einfache Methode zur Musterbildung Zelle nutzt die Phasentrennung der wässrigen Lösungen von Dextran und Polyethylenglycol und die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen besteht.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K Aufrufe.  University of Michigan. Wässriger Zweiphasensysteme wurden gleichzeitig Muster mehrere Populationen von Zellen verwendet. Dieses schnelle und einfache Methode zur Musterbildung Zelle nutzt die Phasentrennung der wässrigen Lösungen von Dextran und Polyethylenglycol und die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen besteht.

Serie: Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Forschung

Biotechnik

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Ein Toolkit zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in wässrigen Umgebungen aktivieren

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Einfache, erschwingliche und modulare Musterung von Zellen mit DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Kontrolle der Zelladhäsion mit Hydrogel-Patterning-Techniken für Anwendungen in der Zugkraftmikroskopie

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...