This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.

1. MFP Leiter und Plattform Reinigung und Vorbereitung Hinweis: Dieses Protokoll verwendet vertikal orientierten Silizium-Glas - Hybrid - MFP 15,16 leitet. Die Siliciumkomponente des Kopfes enthält die Mikrokanäle, die bis zu einer Tiefe von 100 um geätzt werden. Die geätzte Silizium auf Glas geklebt anodische Bonden verwendet wird. Die Kanalausführung umfasst ein Muster von sechs Kanälen aus, jeweils zwei für die Injektion und Aspiration und zwei zum Einspritzen der Eintauchflüssigkeit (Abbildung 1). Die Kanäle zum Injizieren Tauchflüssigkeit verwendet aufzufüllen die Medien die biologische Probe umgibt, wodurch Verluste durch Aspiration und Verdunstung zu vermeiden. Die inneren Kanäle und äußeren Kanäle in der aktuellen Arbeit verwendet werden, sind 100 × 100 &amp; mgr; m und 200 × 100 &amp; mgr; m auf. Nach der Herstellung und Verarbeitung, MFP Köpfe mit klaren Kanäle und poliert Scheiteln erhalten. <ol><li> Herstellung der Pumpstation und Fluid-Gerät <ol><li> Verwenden Sie Kapillaren mit einem 1/16 &#39;&#39; (1,59 mm) Außendurchmesser und 0,02 &#39;&#39; (0,51 mm) Innendurchmesser für alle Schläuche an den Spritzen verbunden. Vary Kapillarengröße auf Anwendung basiert und erhalten die entsprechenden Anschlüsse und Armaturen der MFP-Kopf mit den Spritzen zu verbinden. Verwenden Sie Reinstwasser wo Verdünnungen notwendig sind. </li><li> Saubere Spritzen (250-500 &amp; mgr; l Volumen) und Spritzenkolben durch Beschallung in 0,5% Bleichlösung in Reinstwasser vor to- und Post-Experimente mit lebenden Zellen. Spülen Sie sie gründlich mit Wasser. Füllen Sie sie mit Wasser mit ihren Spitzen vollständig in ein Wasserbad getaucht und Absaugen des Kolbens verwendet wird. Spülen Sie die Flüssigkeit, während sie innerhalb des Wasserbades mit dem Spritzenwelle die Dichtung am Ausgang der Spritze zu kontaktieren. Wiederholen Sie aspirieren und Spülung, bis keine Luftblasen in der Spritze Spalten gesehen. </li><li> Schließen Sie Spritzen an die Spritzenpumpen mit Luer-Lock-Anschlüsse. Verwenden Sie ein Schaltventil auf die montiertePumpen der Flüssigkeit aus der Spritze auf einen von zwei Kapillaren zu richten entweder an den MFP Kopf oder an den Flüssigkeitsbehälter (Abbildung 6) führt. (Wenn kein Schaltventil zur Verfügung siehe Abschnitt 1.4.4). Purge beide Kapillaren mit Wasser aus den Spritzen bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 10 bis 50 &amp; mgr; l / min, abhängig von der Größe der Spritze, bis etwa 10 &amp; mgr; l Wasser werden in den Spritzen links. </li><li> Pre-setzen Sie die gespülten Kapillaren in einen geeigneten mikrofluidischen Stecker / Adapter, der mit den Kanal Vias im Kopf - Schnittstellen (zB M1 - Anschluss - siehe Materialien). </li></ol></li><li> MFP Kopf Vorbereitung <ol><li> Reinigen Sie den MFP Kopf durch Beschallung mit Glaswaren Reinigungsmittel für Standard-Reinigungs oder 0,5% Bleichmittel für strenge Reinigung, für 5 min. Purge Kanäle mit Wasser durch den Scheitelpunkt in Wasser getaucht und Anlegen von Vakuum an die Vias. </li><li> Untersuchen Sie Kanäle unter einem Stereomikroskop für mögliche Hindernisse (Verstopfung) und reTorf den vorherigen Schritt, falls erforderlich. </li><li> Montieren Sie den sauberen Kopf auf dem Kopfhalter und schrauben Sie den Stecker mit dem vorher eingesetzten und gespült Schlauch auf den Kopf. Schrauben Sie den Kopfhalter auf die Z-Stufe, die für die Kontrolle der Spaltabstand zwischen dem Kopf und der Zellschicht verwendet wird. </li></ol></li><li> Kalibrieren der Scan - Stufen des MFP - Plattform <ol><li> Führen Endpunkt Kalibrierung der X-, Y- und Z-Phasen vor den Kopf zu verbinden mit der Plattform, nach dem Protokoll des Herstellers mit einem geeigneten Software-Schnittstelle. Kalibrierte Stufen Genauigkeit sorgen für die MFP-Kopf bei der Positionierung. </li><li> Erhalten eines rohen Null Spaltabstand (Nullstellen) durch den MFP-Kopf über eine Kammer gleiten, ohne Zellen zu bringen und langsam in 5 &amp; mgr; m Stufen hinabsteigen. Sonde nach Kontakt mit dem Substrat, sollte Newtonsche Ringe beobachtet werden. Dies ist eine grobe Schätzung. Eine genaue Position ist nach dem Einstellen der Koplanarität der Sonde Spitze zum substrat erhalten werdene. </li><li> Um Koplanarität der Sonde Spitze zu gewährleisten, stellen Sie die Neigung des Kopfes eines Goniometers (an der Schnittstelle des Kopfes und die Z-Stufe) verwendet wird. Wenn gebildet sicherzustellen , dass die Newtonsche Ringe symmetrisch sind (Abbildung 1). Bewegen Sie den MFP Kopf 20 &amp; mgr; m entfernt von dem Substrat und passen Neigung Goniometer verwendet wird. Wiederholen Sie absteigen, Nullstellen und Neigungsverstellung, bis die Newtonsche Ringe sind symmetrisch auf Kontakt. Mit eingestellt Neigung, stellen Sie die z-Position, die Ringe als Null symmetrische Newton erzeugt. HINWEIS: Die Z-Stufe steuert den Kopf-zu-Substrat - Abstand, während der XY - Tisch das Abtasten des Substrats (2) steuert. Eine detaillierte Erklärung finden Sie in unserer früheren Arbeit 14 zu finden. </li></ol></li><li> Chemische Präparate für die lokale Entfernung von Zellschichten Achtung: Gegebenenfalls Verwendung Sicherheitsausrüstung (zB Nitril - Handschuhe, Schutzbrille) für die Chemikalien vorbereitet. Verwenden Sie einen Rauch hood gegebenenfalls zur Herstellung von Lösungen. Bereiten Sie alle Chemikalien und Puffer mit Reinstwasser als Verdünnungsmittel. <ol><li> Vorbereitung 50 mM NaOH - Lösung als Behandlungsflüssigkeit für die inneren Einspritzkanal (i2 mit Strömungs Q I2 in Abbildung 1). </li><li> Bereiten Sie die Extraktionspufferlösung für die äußeren Einspritz (i1 mit Strömungs Q I1 in 1) erforderlich ist , bestehend aus 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5% Tween 20 und 10 uM Rhodamin B in 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan bei pH 8. Zur Spülung verwenden Wasser in den Streben Spritzen. </li><li> Filtern Sie alle Lösungen, die eine 0,2 &amp; mgr; m Spritzenfilter. Degas alle gefilterten Lösungen einen Exsikkator, bis die gelöste Luft Anschlag auf die Oberfläche mit sprudelnden. </li><li> Mit der Ablaufleitung an den Spritzenpumpen verbunden sind, spülen Sie das Restwasser und aspirieren die entgasten Lösungen in die Injektionsspritzen bei 40 &amp; mgr; l / min, bis die Spritzen voll sind (250 oder 500 &amp; mgr; l).Dadurch wird sichergestellt, blasenfreie Füllung der Spritzen, Anschlüsse und Kapillaren. Die Spritze-Umschaltventil-Zwei Kapillarsystem ermöglicht Füllung der Mitte experiment Spritzen. In Ermangelung eines solchen Schaltventil, trennen Sie die Kapillaren aus dem Kopf und füllen die Kapillaren und die Spritze durch die entgaste Lösungen abgesaugt, bevor sie den Kopf wieder anschließen. </li><li> die Verarbeitung Aspirieren und Flüssigkeiten durch die Kapillaren ermöglicht die Verwendung von kleinen Mengen während des Betriebs abgeschirmt werden. Wenn die Chemikalien in großen Mengen hergestellt werden, füllen Spritzen mit den erforderlichen Lösungen direkt. Zum Beispiel, dass die Bestrebung Spritzen Wasser enthalten, können mit diesem Ansatz gefüllt werden. </li><li> Spülen Sie die Kapillaren an den MFP Kopf mit den Flüssigkeiten für jeden Kanal zugewiesen, wie in 1.4.1 und 1.4.2 definiert. HINWEIS: Die Extraktionspufferlösung schirmt das NaOH in der inneren Einschluss und der Rhodamin-Komponente in dem Puffer ermöglicht die Visualisierung von the hHFC während des Betriebs. </li><li> Wenn die Zellen über konfluent sind, mit Zellaggregate auf der kultivierten Fläche erscheinen, ergänzen das Extraktionspuffer mit 10% Proteinase K. Diese ergänzt die Wirkung von NaOH auf diese Aggregate durch denaturierte Proteine ​​auflösen als das Lysat die Bestrebung Kanäle gelangt. Dies verhindert ein Verstopfen der Kanäle während des Betriebes. </li></ol></li><li> Herstellung von Zellmonoschichten auf chamber slides Achtung: Verwenden Sie eine Zellkultur Haube für die Kultivierung von Zellen und Griff Ausrüstung gemäß Vorschriften der Biosicherheitsbeauftragten des Labors festgelegt. Hinweis besonderen Anforderungen bestimmter Zelllinien und Anpassung Protokoll und Geräte entsprechend. <ol><li> Verwendung der Zellkultur - Inkubatoren (bei ​​5% CO 2 und bei 37 ºC) für die Kultur und Expansion von Zellen strukturiert werden. Führen Sie die Erweiterung mit Standard - Zellkulturprotokolle 17,18 in T - Kolben. Verwenden Kulturmedien nach Anforderungen der spezifischen cell Leitung (zB Serum und Antibiotikum ergänzt DMEM zur Kultivierung von MCF7 und MDAMB 231). </li><li> Bei Erreichen in den Kulturflaschen Zellkonfluenz, trypsinize und Zellen und seed 2 × 10 5 Zellen / cm 2 in jeder der 2-Kammer - Objektträger zur Strukturierung und die Kultur mehr als 48 Stunden zu sammeln. Verwenden Sie die Zellen in einer der Kammern als eine Kontrolle für das Zellwachstum und Lebensfähigkeit. </li><li> Zellkonfluenz an den Kammer gleitet, Inkubation der Zellen für 45 min mit 500 ul Zell-tracker Farbstofflösung (zB grün - CMFDA oder orange - CMRA) Bei Erreichen von 10 &amp; mgr; M Konzentration hergestellt in Serum-freiem Medium. Dies wird für die Zell Visualisierung während der Strukturierung erfolgen. Waschen Sie die markierten Zellen mit PBS, indem Sie vorsichtig jede Kammer mit einer Pipette gespült und anschließend Kultur die Zellen in serumhaltigem Medium für die Musterexperimente. </li><li> Besorgen Sie sich ein Referenzbild der Zelle-tracker-gefärbten Zelloberfläche zum Zwecke der Zellzählung. Dies geschieht, um sicherzustellen,Konfluenz der Zellschicht. Darüber hinaus dient es als Hilfe für die Quantifizierung Experimente wenn Probenrückgewinnung und die DNA-Analyse Ziele sind. HINWEIS: In dem Fall, dass die Lebensfähigkeit der Zellen während der Strukturierung beurteilt werden wird, können die Zellen mit einem Live / Dead Zytotoxizität Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt werden. </li></ol></li></ol> 2. Erstellen der Hierarchical hydrodynamischem Fluss Confinement (hHFC) <ol><li> Bewegen Sie den MFP über die Zellschicht zu einem Spaltabstand von 50 &amp; mgr; m aus dem Glasträger. Dieser Spaltabstand während sichergestellt Kontakt des hHFC erklärt auch einschichtige Oberfläche und Dickenvariation. </li><li> Injizieren NaOH bei 6 bzw. 8 &amp; mgr; l / min durch i2. Bewerten Sie anderen Flussraten (dh Q I1, Q A1 und Q A2) 3 , um die Flussregeln in Abbildung verwendet wird . </li><li> Modulieren der Größe des inneren HFC durch das Verhältnis von Q I2 / I1 Q Ändern der Injektionsspritzen verwendet wird .Beispielsweise verwenden , um eine Q I1 zwischen 1,3 &amp; mgr; l / min und 4 &amp; mgr; l / min, mit dem Q I2 bei 8 &amp; mgr; l Fest / min, die aus 150 in einer NaOH - Bilanz führt - 300 Zellen (100 bis 200 &amp; mgr; m 2 / Zelle) ( Figur 3D). </li><li> Injizieren Vollmedium von den äußersten Öffnungen auf dem MFP Kopf mit einer Strömungsrate von 20 &amp; mgr; l / min für die Verdampfung der Medien zu berücksichtigen, und Aspiration während des Betriebs des hHFC. </li></ol> 3. Patterning-Zellmonolayern hHFC Verwendung Hinweis: Die Scanmuster legt die Bereiche der Zellschicht, wo die Zellen extrahiert werden (subtraktiven Strukturierung), die restlichen Zellen verlassen spezifische biologische Fragen zu studieren. Dieses Muster kann gerade Linien oder eine Reihe von Punkten, beispielsweise. Komplexe Muster erfordern Entwurf eines geeigneten Abtasttrajektorie. Zum Beispiel stellt ein kariertes Abtastbahn ein Gitter von Zellflächen (beispielsweise in 4A gezeigt </strong&gt;), die die Wirkung verschiedener Stimuli an Zellen in verschiedenen Plätzen studieren würde es ermöglichen, während in enger Nachbarschaft zu sein. Diese Muster können die Kontrolle über die XY-Stufen der Plattform erstellt werden, in dem die Steuerungssoftware Scripting von Scan-Trajektorien für die MFP-Kopf über die Zellschicht ermöglicht. <ol><li> Die Bühne Software den Sondenkopf über der Zellschicht in benutzerdefinierten Muster (durch Setzen X, Y und Z-Koordinaten) bei einer Abtastgeschwindigkeit von 10 um / s zu einem Spaltabstand von 50 &amp; mgr; m abzutasten. </li><li> Mit der verschachtelten hHFC in Betrieb und in Kontakt mit der Monoschicht, scannen Sie den MFP mit einer Flugbahn des gewünschten Musters strukturiert Zellentfernung zu bewirken. </li><li> Für eine Co-Kultur nach dem ersten Typ Entfernung Zelle, eine andere Zelllinie Samen, die Lücken zu füllen, mit den Methoden in Kapitel 1.5. Bewegen zwischen verschachtelten und kniff Modi (durch Spaltabstand zu erhöhen, zum Beispiel) Zellentfernung zu steuern. HINWEIS: Die Scan-Geschwindigkeit müssen möglicherweise Untersu seingated für andere Zelllinien. Die Scan-Geschwindigkeit in dieser Demonstration Effekte komplette Zellentnahme über die gescannten Bereiche für die verwendeten Zelllinien verwendet. </li></ol> 4. Downstream Processing zur Probenahme und DNA-Amplifikation <ol><li> Bereiten Sie die Probenentnahmestation für Downstream-Analyse des Lysats. Für die Probenentnahmestation, verwenden Sie ein 3D-8-Streifen PCR Rohrhalter gedruckt. Alternativ wählen Sie einen geeigneten Rohrhalter als diesen Adapter zu dienen, die im Scanbereich montiert wird der Kopf außerhalb des Substrats fähig ist. Wischen den Rohrhalter mit 70% Ethanol oder einer anderen Oberfläche Dekontaminations basierend auf der Stringenz für die Anwendung erwünscht ist. Verwenden Sie einen magnetischen Clip auf dem Rohrhalter es auf den Substrathalter zu befestigen. </li><li> Nach der Probenentnahmestation vorbereiten, positionieren Sie den MFP Kopf 100 &amp; mgr; m von der einschichtigen. Beginnen Sie den hHFC mit 50 mM NaOH-Lösung als Behandlungsflüssigkeit für die innere Injektionskanal mit Durchflussraten von 1 Betrieb, 6, -7 Und -17,5 &amp; mgr; l / min für Q I1, Q I2, Q A1 und A2 Q beziehungsweise. <ol><li> Sobald die Strömungs Confinement (in ca. 10 sec) stabilisiert hat, steigen Sie den Sondenkopf mit einem Spaltabstand von 50 &amp; mgr; m durchzuführen NaOH basierten lokalen Lyse des ausgewählten Subpopulation von Zellen mit dem hHFC. Nach Lyse der Subpopulation abgeschlossen ist (ca. 30 sec pro Stellfläche), richten den Kopf in Richtung der Rohre in der Entnahmestation. Werfen Sie die gesammelten Lysat in die PCR - Röhrchen direkt (Abbildung 6). </li></ol></li><li> Zur Weiterverarbeitung des Lysats, neutralisieren zuerst den pH-Wert der Lösung durch das Lysat mit Tris-Puffer Mischen (1: 1). Nach der Neutralisierung Wärme für 30 Minuten das Lysat bis 95 ºC. Dann direkt das Lysat in ein Standard-qPCR-Workflow laden, wie durch Lieferanten des Gerätes eingestellt. </li></ol>

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	<li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).</li><li>Goubko, C. A., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+cell+types+in+co-cultures:+A+review.">Patterning multiple cell types in co-cultures: A review.</a> Mater. Sci. Eng. C. 29 (6), 1855-1868 (2009).</li><li>Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+systems+for+the+generation+of+patterned+co-cultures+for+controlling+cell-cell+interactions.">Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).</li><li>Cho, C. H., Park, J., Tilles, A. W., Berthiaume, F., Toner, M., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layered+patterning+of+hepatocytes+in+co-culture+systems+using+microfabricated+stencils.">Layered patterning of hepatocytes in co-culture systems using microfabricated stencils.</a> Biotechniques. 48 (1), 47-52 (2010).</li><li>Sch&#252;tze, K., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+expressed+genes+by+laser-mediated+manipulation+of+single+cells.">Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells.</a> Nat. Biotechnol. 16 (8), 737-742 (1998).</li><li>Salazar, G. T. A., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropallet+arrays+for+the+separation+of+single,+adherent+cells.">Micropallet arrays for the separation of single, adherent cells.</a> Anal. Chem. 79 (2), 682-687 (2007).</li><li>Guillaume-Gentil, O., Zambelli, T., Vorholt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+mammalian+cells+from+adherent+cultures+by+fluidic+force+microscopy.">Isolation of single mammalian cells from adherent cultures by fluidic force microscopy.</a> Lab Chip. 14 (2), 402-414 (2014).</li><li>Iwata, F., Adachi, M., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+scraper+based+on+an+atomic+force+microscope+for+detaching+a+living+cell+from+a+substrate.">A single-cell scraper based on an atomic force microscope for detaching a living cell from a substrate.</a> J. Appl. Phys. 118 (13), (2015).</li><li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration.">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J. Lab. Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li><li>Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipurpose+microfluidic+probe.">Multipurpose microfluidic probe.</a> Nat. Mater. 4 (8), 622-628 (2005).</li><li>Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+the+&amp;#34;open+space&amp;#34;+for+performing+localized+chemistry+on+biological+interfaces.">Microfluidics in the &amp;#34;open space&amp;#34; for performing localized chemistry on biological interfaces.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (45), 11224-11240 (2012).</li><li>Qasaimeh, M. A., Gervais, T., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+quadrupole+and+floating+concentration+gradient.">Microfluidic quadrupole and floating concentration gradient.</a> Nat. Commun. 2 (May), 464 (2011).</li><li>Christ, K. V., Turner, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+hydrodynamically+confined+microfluidics:+controlling+flow+envelope+and+pressure.">Design of hydrodynamically confined microfluidics: controlling flow envelope and pressure.</a> Lab Chip. 11 (8), 1491-1501 (2011).</li><li>Autebert, J., Kashyap, A., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+hydrodynamic+flow+confinement:+efficient+use+and+retrieval+of+chemicals+for+microscale+chemistry+on+surfaces.">Hierarchical hydrodynamic flow confinement: efficient use and retrieval of chemicals for microscale chemistry on surfaces.</a> Langmuir. 30 (12), 3640-3645 (2014).</li><li>Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Drechsler, U., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vertical+Microfluidic+Probe.">A Vertical Microfluidic Probe.</a> Langmuir. 27 (9), 5686-5693 (2011).</li><li>Cors, J. F., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+and+versatile+microfluidic+probe+for+local+processing+of+tissue+sections+and+biological+specimens.">A compact and versatile microfluidic probe for local processing of tissue sections and biological specimens.</a> Rev. Sci. Instrum. 85 (3), 034301 (2014).</li><li>Pollard, J. W., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Cell Culture Protocols. , (1997).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cell+culture+protocols.">Human cell culture protocols.</a> Methods Mol. Biol. Springer. 531 (1), (2012).</li><li>Sakai, K., Ushida, T., Nagase, T., Nakamigawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cell+detachment+by+shear+stress.">Quantitative analysis of cell detachment by shear stress.</a> Mater. Sci. Eng. C. 17 (1-2), 55-58 (2001).</li><li>Rodriguez, N. M., Desai, R. A., Trappmann, B., Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+multicolor+dynamically+adhesive+substrates+to+control+cell+adhesion+and+multicellular+organization.">Micropatterned multicolor dynamically adhesive substrates to control cell adhesion and multicellular organization.</a> Langmuir. 30 (5), 1327-1335 (2014).</li><li>Tasoglu, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+stem+cell+research.">Bioprinting for stem cell research.</a> Trends Biotechnol. 31 (1), 10-19 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir präsentieren ein vielseitiges Protokoll für die subtraktiven Strukturierung von Zellmonolayern, die schnelle Erzeugung von räumlich definierten Zellstrukturen ermöglicht. Selektive Lyse der Zellmonolayer wird mit NaOH als Verarbeitungsflüssigkeit in hHFC durchgeführt. Die NaOH denaturiert augenblicklich die Proteine ​​in der Zellmembran enthalten ist. Wir empfehlen die Verwendung von 50 mM NaOH-Konzentration der Weiterverarbeitung des Lysats zu gewährleisten. Diese Konzentration kann für eine schnellere Zellentfernung erhöht werden, Lysat Downstream Processing kein Ziel ist. Die hHFC stellt sicher, dass die nicht verarbeitete Umgebung der Zellschicht unbeeinflusst bleiben und sind entweder das Muster erweitert oder andere Eigenschaften der Zellen Sondieren. Die Rate der Zellentfernung ist eine Funktion sowohl der Chemie und Scherung durch die Strömung dargestellt. Wir wählen einen Arbeitsbereich von Flussraten Chemie dominante Zellentfernung zu haben. Scangeschwindigkeiten von 10 - 20 &amp; #181; m / sec eine NaOH Injektionsflussrate von 6 unter Verwendung von - 8 ul / min verwendet werden, &#39;schnelle&#39; subtraktiven Strukturierungs zu erleichtern. Die rasante Geschwindigkeit der Zellentfernung behandelt einige Herausforderungen durch Oberflächendruck basierend Musterung 20,21 nähert. Diese Verfahren erfordern einen Mechanismus Wachstum von Zellen zu begrenzen, in räumlich definierten Bereichen, beispielsweise durch selektive Abscheidung von Zelladhäsionsproteinen via Mikrokontaktdrucken und anschließender Aussaat von Zellen, um das Muster zu erhalten. Sie zeichnen sich durch geringen Durchsatz begrenzt und erfordern mehrere aufeinanderfolgende Schritte zur Mustererzeugung sowie ein neues für jedes Muster Schablone / Stempel. Das beschriebene Verfahren erfordert nicht selektives Wachstum von Zellen auf definierte Bereiche und mehrere Einschränkungen überwindet durch subtraktive Strukturierung im Gegensatz zum Drucken ausgeführt wird, während keine zusätzliche Behandlung des Zellkultursubstrat erfordern. Mit dem Protokoll in diesem Dokument beschriebenen, den Durchsatz von Musterzellmonolayernerhöht wird, während sofortiges visuelles Feedback des erzeugten Muster zu erhalten. Dies erleichtert die Echtzeit-Änderung der Muster. Eine solche Steuerung kann in Szenarien, in denen die Lebensfähigkeit der Zellen auf einer gegebenen Oberfläche nicht homogen ist von entscheidender Bedeutung sein. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass der gleiche Kopf und der Chemie verwendet werden können, mehrere Muster zu erzeugen, wodurch die Anzahl der Schritte zu reduzieren bei der Erzeugung einer strukturierten Zellschicht beteiligt. Die Abmessungen der Kanäle in dem Kopf und der Kopfgeometrie kann entsprechend den Anforderungen der Anwendung geändert werden, wodurch die Kontrolle über die Auflösung der Strukturierung ermöglichen. Alle Versuche in der aktuellen Arbeit wurden unter Verwendung eines MFP Kopf mit festen Öffnungsabmessungen durchgeführt, und zwar mit inneren Öffnungen bei 100 × 100 &amp; mgr; m und äußeren Öffnungen bei 200 × 100 &amp; mgr; m. Dieses Design mit größeren äußeren Öffnungen wurde ohne ein Verstopfen der Öffnungen kontinuierlichen Betrieb des hHFC sicherzustellen ausgewählt vonStreuzelltrümmer. Wir haben getestet Köpfe mit inneren Abmessungen der Öffnung 50 × 50 &amp; mgr; m und 50 &amp; mgr; m Abstand zwischen ihnen, mit erfolgreichen Ergebnissen in Zellentnahme. Die Verwendung von kleineren Öffnungen, bis zu 10 × 10 &amp; mgr; m mit 10 &amp; mgr; m Abstand, würde die Skalierung auf eine kleinere Stellfläche Größe (~ 30 × 30 &amp; mgr; m) ermöglichen, wodurch eine höhere Auflösung bei der Muster ermöglicht. Wir beobachteten operativen Fragen mit Öffnungsgrößen kleiner als 10 &amp; mgr; m aufgrund von Partikeln zu verstopfen. Wegen solcher Betriebsschwierigkeiten, 100 &amp; mgr; m ist die Strombegrenzung der Auflösung und somit eine Begrenzung der beschriebenen Technik. Allerdings können wir dies mit der flüssigen Formgebung Fähigkeit des hHFC adressieren. Wir haben gezeigt , dass die Auflösung der Zellentfernung kann durch Steuern Q I2 / Q I1 (Abbildung 4b) und die Spitze-zu-Substrat - Spalt 10,14 für einen gegebenen Satz von Öffnungsabmessungen abgestimmt werden. Die Stadien in der aktuellen Arbeit verwendet hat eine minimale Schrittweite von 100 nm.Eine Kombination dieser steuerbaren Parameter kann die räumliche Auflösung der Zellentnahme in Bezug auf die Stellfläche Größe und Tastweite verbessern. Wenn gemusterten Kokulturen erwünscht sind spezifische Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, sequenziellen seeding und Strukturieren kann unter Verwendung des beschriebenen Protokolls durchgeführt werden. Schließlich können amplifizierbare DNA von hoher Qualität aus dem Lysat erhalten werden, wie ersichtlich , durch die singuläre Peaks in der DNA Schmelze Kurve (siehe Abbildung 7). Wir untersuchten eine DNA-Menge von etwa 1,6 aus einem einzigen Fußabdruck ng (etwa 300 Zellen) unter Verwendung von qPCR, die theoretische Erwartung nahe ist (6-8 pg / Zelle). Dies deutet auf eine Menge der extrahierten DNA geeignet für verschiedene nachfolgende Prozesse, während die Verwendung von irgendwelchen DNA Isolationsmethoden vermieden. Dies eröffnet Möglichkeiten für die DNA-Analyse-basierten von kultivierten Zellen lokale Sondierung. Die Fähigkeit von hHFC Flüssigkeiten zu formen können auch lebende Zellen und Proteine ​​verwendet werden auf ac abzuscheidentiviert Oberflächen, die in Kombination mit dem subtraktive Strukturierung und sequenzielle Kokultivierung in diesem Protokoll vorgestellt ermöglicht die Erstellung von komplexen Zell- und Zell-Matrix-Muster auf Kultursubstraten. Die Vielseitigkeit und die Kontrolle zur Verfügung gestellt von hHFC-basierten subtraktiven Strukturierung von Zellmonolayern und die Möglichkeit, auf den extrahierten Zellen DNA-Analyse durchzuführen, stellt ein leistungsfähiges neues Werkzeug für Biologen setzen ortsaufgelöste Untersuchungen Wechselwirkungen zwischen Zelle durchzuführen.

In ihrer natürlichen Umgebung wahrnehmen Zellen in biologischen Geweben eine Reihe von biochemischen und physikalischen Signale lenken ihr Wachstum, Organisation und Entwicklung. Diese Hinweise zu verstehen, müssen selektive Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Dies erfordert die Entwicklung von Verfahren zur Strukturierung Zellmonolayern. Methoden zur geometrisch getrennten verschiedenen Zelltypen in Kultur (Strukturierung) ermöglichen breite Studien von physikalischen und chemischen Signale in der Zellbiologie. Die meisten der derzeitigen Ansätze zur Strukturierung Zellschichten von 1 bis 4 sind abhängig von Ablagern zell Adhäsionsproteine ​​auf Oberflächen oder mit mikrofabrizierten Schablonen für das selektive Wachstum auf Substraten. Im Gegensatz dazu zeigen wir hier ein Verfahren zur schnellen Musterzellmonolayern in situ, dh Zellen in Kultur, die von Zellen in ausgewählten Bereichen der Monoschicht entfernt werden . Methoden, die solche subtraktiven Strukturierungs 5 durchführen - 9 usually erfordern spezielle Substrate, Oberflächenbehandlung, komplexe Operation, physikalischen Kontakt oder Ablation mittels eines Lasers, unbeabsichtigt die lebenden Zellen zu beeinflussen. Wir verwenden hier eine mikrofluidische Sonde (MFP) 10,11, ein berührungsloses Scannen mikrofluidischen Technologie , die hydrodynamisch eine Flüssigkeit auf ein Substrat beschränkt. Ein wichtiger Bestandteil des MFP ist der mikrostrukturierten Kopf enthält Mikrokanäle (Abbildung 1). Die zugehörige Plattform besteht aus Spritzenpumpen für die Flüssigkeitssteuerung, Stufen zur Abtaststeuerung und ein invertiertes Mikroskop zur Visualisierung und Rückkopplung (Abbildung 2). In seiner Grundkonfiguration umfasst das MFP Kopf zwei Mikrokanäle mit Öffnungen an der Spitze, eine Verarbeitungsflüssigkeit und die andere zum Absaugen der injizierten Behandlungsflüssigkeit zusammen mit einigen Tauchflüssigkeit (3A) eine zur Injektion. Während MFP Betrieb ist der Scheitelpunkt in einem festen Abstand von dem Substrat. Wenn die Absaugströmungsleitung Rate (Qa) ist sufficiently höher als die Einspritzströmungsgeschwindigkeit (Q i), das heißt Q a: Q i ≥ 2,5, wird die Behandlungsflüssigkeit auf dem Substrat beschränkt. Dies führt zu einer hydrodynamischen Strömungs Confinement (HFC). Der Bereich, in dem die Behandlungsflüssigkeit in direktem Kontakt mit dem Substrat ist, wird die Aufstandsfläche bezeichnet. Bei typischen Betriebsbedingungen, die Strömung der Behandlungsflüssigkeit innerhalb der HFC durch eine niedrige Reynoldszahl gekennzeichnet ist (Re ≈ 10 -2) und eine hohe Peclet - Zahl (Pe ≈ 10 2). Dies bedeutet, Flüssigkeit fließt in laminaren Regime mit Konvektion die primäre Form der Massentransfer von chemischen Spezies zu sein. 14 - Die numerischen und analytischen Modelle zur Strömungshaft sind an anderer Stelle 12 beschrieben. In dieser Arbeit verwenden wir den Ansatz der gleichzeitig mehrere Verarbeitungsflüssigkeiten zu beschränken, die hierarchische HFC (hHFC) 14 bezeichnet wird. Zur Umsetzung hHFC mit dem MFP, zwei additional Öffnungen benötigt, um eine sekundäre Quelle der Einspritzung und Aspiration zu liefern. Dies ermöglicht es uns, eine Flüssigkeit, die in einer zweiten Flüssigkeit zu begrenzen. Die inneren (processing) Flüssigkeit Vorteile werden die von Streu Ablagerungen auf dem Substrat durch die äußere (Abschirmung) Flüssigkeit abgeschirmt. Darüber hinaus ermöglicht hHFC Betrieb in zwei Modi: (i) die verschachtelten Modus, in dem die Behandlungsflüssigkeit in den inneren HFC Kontakt mit der Oberfläche (3B), und (ii) der gedrängten Modus, in dem die innere Flüssigkeit verliert den Kontakt und nur die äußere Flüssigkeit in Kontakt mit dem Substrat (3C). Die Umschaltung zwischen den beiden Betriebsarten ermöglicht es Benutzern zu bewirken oder Bearbeiten des Substrats zu stoppen , und wird durch Steuern des Kopf-an-Oberfläche erzielt Spalt oder durch das Verhältnis zwischen den Einspritzströme ändert (Q i2 / Q i1). Für eine gegebene Kanalgeometrie kann die Aufstandsfläche der Behandlungsflüssigkeit auf dem Substrat durch Modulieren Strömungsbedingungen (3D) gesteuert werden. Sodium hydroxid (NaOH) wird als die innere Behandlungsflüssigkeit verwendet, um die Zellen zu lysieren und das Lysat kontinuierlich von der Oberfläche angesaugt wird. Da die chemischen Wirkungen der Verarbeitungsflüssigkeit auf die innere HFC Fußabdruck lokalisiert sind, bleiben die benachbarten Zellen ungestörte, die Raum-Zeit-Studien von Zell-Zell-Wechselwirkungen ermöglicht. Die Scan - Funktionalität des MFP ermöglicht die Erstellung von benutzerdefinierten Geometrien von Zellmuster (Abbildung 4). Ferner nimmt die Wahl der NaOH als Behandlungsflüssigkeit stromabwärts der DNA - Analyse (Abbildung 7).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="870">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Materials</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:291px;">Microfluidic Probe (MFP)</td>
			<td style="width:235px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Z&#252;rich</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:291px;">Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">154461</td>
			<td style="width:227px;">2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm^2 and capable of holding upto 3 ml of media volume</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Chemicals and cell lines used</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:291px;">Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B</td>
			<td style="width:235px;">SigmaAldrich chemicals, USA</td>
			<td style="width:119px;">S5881, 252859,&#160; E9884, R6626</td>
			<td style="width:227px;">Chemicals used for processing and shielding liquids</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:291px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:235px;">Qiagen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">19131</td>
			<td style="width:227px;">protease to digest denatuired proteins</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:291px;">Deconex 16 Plus</td>
			<td style="width:235px;">Bohrer Chemie, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">DNA away&#160;</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">7010</td>
			<td style="width:227px;">Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">10566-016</td>
			<td style="width:227px;">Culturing medium for epithelial cells.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:291px;">CellTracker Green CMFDA dye</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">C7025</td>
			<td rowspan="2" style="width:227px;">Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:291px;">CellTracker Orange CMRA dye</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">&#946;-actin genomic primers for qPCR</td>
			<td style="width:235px;">Integrated DNA technologies, USA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:291px;">MCF7 breast carcinoma cells</td>
			<td style="width:235px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:119px;">ATCC HTB-22</td>
			<td rowspan="2" style="width:227px;">Cell lines used to produce co-cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:291px;">MDA-MB-231 breast carcinoma cells</td>
			<td style="width:235px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:119px;">ATCC HTB-26</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Equipment and fluidic connections</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:291px;">Motorized high precision stages</td>
			<td style="width:235px;">Custom machined components.&#160; Linear axis motors from LANG GmBH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Customized linear axis stages from LT series</td>
			<td style="width:227px;">3 &#215; LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:291px;">Syringes</td>
			<td style="width:235px;">Hamilton, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">1700 TLLX series</td>
			<td style="width:227px;">Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 &#181;l range.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Nemesys low pressure syringe pumps</td>
			<td style="width:235px;">cetoni GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Component of pumping station.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Circular M1-connector</td>
			<td style="width:235px;">Dolomite microfluidics, United Kingdom&#160;</td>
			<td>3000051</td>
			<td style="width:227px;">Interface between vias in MFP head and tubing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Tilt/rotation stage Goniometer</td>
			<td style="width:235px;">OptoSigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">KKD-25C</td>
			<td style="width:227px;">Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">DS Fi2 HD color camera (CCD)&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Nikon, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Controlled using DS-U3 controller unit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Win - Commander</td>
			<td style="width:235px;">LANG GmBH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Stage control software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Qmix Elements</td>
			<td style="width:235px;">cetoni GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Pump control software.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">NIS Elements</td>
			<td style="width:235px;">Nikon, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Basic research module for image acquisition and analysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid subtractive patterning of live cell layers with a microfluidic probe

Die mikrofluidischen Sonde (MFP) erleichtert auf biologische Substrate lokale Chemie Durchführung von Nano- Flüssigkeitsmengen zu beschränken. Verwendung einer bestimmten Implementierung des MFP, die hierarchische hydrodynamischen Strömungs Confinement (hHFC) werden mehrere Flüssigkeiten in Kontakt mit einem Substrat gebracht gleichzeitig. Lokale chemische Wirkung und flüssige Formgebung der hHFC verwendet wird, wird ausgenutzt, indem lokal Lyse und Entfernen von Zellen Zellmuster zu erzeugen. Durch Verwendung des Scan-Fähigkeit des MFP, benutzerdefinierte Muster der Zellmonoschichten erzeugt werden. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, Echtzeit und räumlich kontrollierten Zell Strukturierung, die eine selektive Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionsstudien ermöglichen kann.

Das beschriebene Protokoll zur schnellen subtraktive Musterbildung von Zellmonoschichten demonstriert eine Mehrkomponenten MFP - Plattform (1 und 2). Das Protokoll verwendet die hierarchische hydrodynamischen Strömungs Confinement (hHFC; Abbildung 3) , um lokal zu behandeln und zu entfernen Zellen aus Zellmonolayern mit NaOH als Verarbeitungsflüssigkeit. Die hHFC Konfiguration umfasst eine innere und eine äußere HFC HFC. Die beschränkte NaOH in der inneren hHFC führt chemische Wirkung und Scherung auf den Zellen in Kontakt. Innerhalb dieser Ausleuchtzone werden die Zellen homogen auf die chemische Einwirkung von NaOH ausgesetzt, Konvektion angetriebene Massentransfer aufgrund innerhalb und mit vernachlässigbarer Diffusion zu dem Bereich außerhalb der Begrenzung. Die Scher auf die Zellen auf der anderen Seite, kann durch Variieren der Strömungsrate des NaOH verändert werden. Um die Betriebsparameter zu vereinfachen, haben wir uns für chemische Wirkung die dominante Mechanismus der Zellentnahme im Vergleich zur Scher zu machen. Nachschätzen die Scherkraft durch die hHFC auf die Oberfläche aufgebracht wird, ein Finite-Elemente-Modell wurde mit Comsol Multiphysics 5.0 gebaut. Simulationen wurden mit dem CFD-Modul für laminare Strömungen laufen. Zwei Einlassrandbedingungen zu den Einspritzöffnungen der Geometrie und zwei Austrittsrandbedingungen an die Bestrebung Öffnungen (Abbildung 5) wurden für den Bereich der Strömungsraten und Abmessungen der Öffnung in der aktuellen Demonstration verwendet angewendet. In dem Modell erhalten, diktierte die Flussregeln der Scherprofil, während die Strömungsgeschwindigkeiten die Größe der Scher auf der Oberfläche definiert. Praktisch bestimmt eine Kombination von beiden, wenn die hHFC Kontakte an der Oberfläche. Wenn man sich diese Faktoren im Auge, setzen wir für den Betrieb eine Reihe von Durchflussraten, um herauszufinden, um chemisch dominante Zellentfernung zu erhalten. Um eine hHFC zu erzeugen, verwenden wir den Fluss der Regel von insgesamt Streben nach Injektionsflussrate-Verhältnis von 3,5. Die anderen Flussregeln verwendet wurden definiert innerhalb der Aspiration Kanäle zu verstopfen, zu minimieren,was durch denaturierte Proteine ​​verursacht werden das Festhalten an den Kanaloberflächen. Verwendung des entwickelten Modells, fanden wir Strömungsgeschwindigkeiten von 5 bis 10 &amp; mgr; l / min übersetzen zu einer Scherspannung zwischen 1 und 3 N / m 2. Ohne die chemische Wirkung von NaOH, beispielsweise im Falle der Extraktionspuffer, würde die Scherspannung nicht hoch genug sein , um die Zellen 19 zu entfernen. Innerhalb des beobachteten Bereichs, bemerken wir , dass Betrieb bei höheren Flußraten ist praktischer zu Störungen im Strömungspfad aufgrund bei niedrigen Strömungsraten aspiration (dh Q I2 &lt;4 &amp; mgr; l / min) aufgrund von Zelltrümmern in den Kanälen. In Anbetracht der untersuchten Scherprofil und praktischen Erwägungen Strömungs NaOH Raten (Q I2) von 6 und 8 &amp; mgr; l / min für die Musterungsexperimente und Q I1, Q A1 und Q A2 entsprechend den Flussregeln in Abbildung 3 gezeigt ist, verwendet. Das Verhältnis Injektionsströme (Q I2 / Q I1) ermöglicht us , um die Größe des durch Autebert erarbeitet hHFC Fußabdruck (3D und 4B), mit dem zugrunde liegenden Prinzip modulieren et al. 14. Unter Verwendung der flüssigen Formfähigkeit des hHFC gekoppelt mit hochauflösenden Scan - Fähigkeit von MFP - Plattform zeigen wir , lebenden Zellen Gittergenerierung bei mehreren Skalen und zeigen weiterhin die Anwendung des bestimmten Protokolls in den Entwicklungs Co-Kulturen (4C). Die Plattform ermöglicht es uns auch, Probenlysat Retrieval für Downstream-Analyse durchzuführen. Um die Qualität des erhaltenen Lysats zeigen, probierten wir lokal lysierten Zellen aus einem und fünf Fußabdrücke in zwei unabhängigen Experimenten, die Veränderung der DNA - Mengen zeigt , aus dem Lysat gewonnen (Abbildung 7). Hier stellen wir amplifizierte im Lysat unter Verwendung von β-Actin-Primer DNA enthielt (vorwärts: GGATGCAGAAGGAGATCACT und Reverse: CGATCCACACGGAGTACTTG<html> ) Unter Verwendung von 4 ul des neutralisierten Lysats in jeder PCR-Reaktion. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig1.jpg" /> Abbildung 1. Module des MFP - Plattform und den Kopf. (A) Die operativen Module der Plattform umfassen Spritzen, Motortische und einen Controller motorisiert. Der MFP ist mit einem motorisierten Z-Stufe verbunden, um den Spaltabstand zwischen dem Kopf und dem Substrat zu steuern, und der Substrathalter zu dem X- und Y-Motorstufen, welche die Scansystem befestigt ist. (B) Der MFP Kopf fluidischen Vias hat die Pumpstation zu verbinden, Befestigungslöcher , den Kopf auf die Z-Bühne zu montieren, und die Kanäle, die die polierte Spitze austritt. Die Spitze wird coplanar zu der Zellkultursubstrat. Symmetric Newton&#39;schen Ringe kann beobachtet werden, wenn die Spitze und das Substrat koplanar sind und in Kontakt.<html> p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig2.jpg" /> Abbildung 2. MFP - Plattform. Die hochauflösende Scan - Plattform ist mit einem bearbeiteten Kopfhalter Schnittstelle mit dem hochpräzisen motorisierte Z-Bühne. Der Substrathalter wird auf der XY Bühne für Abtastzwecke verbunden. Zur Gewinnung des Lysats für nachgeschaltete Analyse, eine 3D gedruckt Meßstation eingeklipst magnetisch an der Seite des Substrathalters (in Einschub gezeigt). Spritzenpumpen, ein inverses Mikroskop, Steuerungen und Displays rund um die Plattform befinden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Hierarchical hydrodynamischen Strömungs Confinement (hHFC) für räumliche und zeitliche Kontrolle der Zellentfernung. (A) Schematische Darstellung eines einzelnen HFC. (B) Verschachtelte und (C) eingeklemmt Modus von hHFC Betrieb. (D) Bild des Fußabdrucks für zwei unterschiedliche Einspritz- / Absaugströmungsleitung Verhältnisse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig4.jpg" /> Abbildung 4. Muster der Zellmonolayern des MFP verwendet wird . (A) Cell-Grid - Generation durch programmierte Abtastung des MFP auf einem MDA-MB-231 Zellschicht. Die Zellen wurden mit grünen Zelle-tracker Farbstoff gefärbt. (B) Die Grundfläche für die verschiedenen Injektionsverhältnisse (n) Auf einer MCF7 Zellmonolayer. Die schematische Darstellung zeigt die erwartete Variation in der Form des inneren HFC mit einer Änderung in n. (C) Patterned Co-Kultur durch subtraktive Strukturierung von einschichtigen MCF7 gefolgt durch Impfen MDA-MB-231 - Zellen in den Regionen abgezogen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig5.jpg" /> Abbildung 5. Schubspannung auf der Oberfläche , wenn hHFC. Die Scherbeanspruchung auf die Oberfläche steigt linear mit der inneren Einspritzflussrate anwenden. Die höchste Scherpunkt zwischen den beiden inneren Öffnungen (unten rechts im Bild), wo die Verarbeitungsflüssigkeit begrenzt (rote Fließlinien, links oben kleines Bild) gefunden. Die Abmessungen der Öffnung in der Finite-Elemente-Modell verwendet werden, sind 200, 100, 100 und 200 &amp; mgr; m für i1, i2, a1und A2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig6.jpg" /> Abbildung 6. Betriebsarten der MFP - Plattform zur Durchführung Zellentnahme und Strukturierung. (A) Schematische Darstellung des Strömungswegs für die subtraktive Strukturierung durch Zell - Lyse. Der Einfachheit halber sind nur eine von jeder Injektion und Aspiration Strömungswege dargestellt. Die Spritzen werden mit dem Ablassventil in den Pumpen gefüllt. i1 und i2 sind zum Einspritzen von Extraktionspuffer und NaOH verwendet wurden. (B) Schematische Darstellung des Strömungswegs für Lysat Erholung. Dieser Strömungspfad nach der Sammlung von Zellysat für die Analyse unter Verwendung des Strömungswegs in (A) aktiviert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig6large.jpg" target="_blank">Bitte clic</a>k hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig7.jpg" /> Abbildung 7. Downstream - Analyse von DNA aus Zelllysat qPCR verwendet wird . (A) Amplification Plots von DNA in Lysat von 5 Fußabdrücke extrahiert (5 fp) und 1 - Bilanz (1 fp). Die Kontrollen wurden in beiden Fällen nach Lysat Sammlung extrahiert. (B) Schmelzkurven von DNA aus dem Lysat verstärkt , um die Qualität der extrahierten DNA zeigt. qPCR wurde durchgeführt (N = 2, n = 3) , um das β-Aktin - Gen zu verstärken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung S" src="/files/ftp_upload/54447/54447figS.jpg" /> Abbildung S1. Eine skalierte Bild von Kanaldesign für den 6-Kanal - MFP Kopfzur Strukturierung von Experimenten verwendet. Kanäle die hHFC Durchführung sind 200, 100, 100, 200 &amp; mgr; m breit und 100 &amp; mgr; m tief. Die beiden äußersten Kanäle, die Eintauchflüssigkeit aufzufüllen sind 500 &amp; mgr; m breit und 100 &amp; mgr; m tief. Eine GSD - Datei für das gleiche Design hat sich als Ergänzung zu diesem Artikel zur Verfügung gestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447figSlarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447figSlarge.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K Aufrufe.  IBM Research - Zurich. We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Serie: Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. For example, they play an important role in directing cell migration during wound healing. Here we describe the manufacture and use of ultrasensitive vibrating probes for measuring extracellular electric currents. The probe is an insulated, sharpened metal wire with a small platinum-black tip (30-35 &mu;m), which can detect ionic currents in the &mu;A/cm2 range in physiological saline. The probe is vibrated at about 200 Hz by a piezoelectric bender. In the presence of an ionic current, the probe detects a voltage difference between the extremes of its movement. A lock-in amplifier filters out extraneous noise by locking on to the probe's frequency of vibration. Data are recorded onto computer. The probe is calibrated at the start and end of experiments in appropriate saline, using a chamber which applies a current of exactly 1.5 &mu;A/cm2. We describe how to make the probes, set up the system and calibrate. We also demonstrate the technique of cornea measurement, and show some representative results from different specimens (cornea, skin, brain).

The manufacture, calibration and use of non-invasive vibrating probes to measure bioelectric current in various biological systems is described.

Die Messung der bioelektrischen Strom mit einem vibrierenden Sonde

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

Forschung

Biotechnik

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Einem mikrofluidischen System mit Oberflächenstrukturierung zur Untersuchung Kavitationsblase (e) -Cell Interaktion und die Resultierende Bioeffects auf der Ebene einzelner Zellen

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced antibiotic resistance, which poses potential health dangers, but can also be beneficial for environmental applications such as purification of drinking water. The further development of anti-bacterial therapeutics and biofilm-inspired applications will require the development of reproducible, engineerable methods for biofilm creation. Recently, a novel method of biofilm preparation using a modified three-dimensional (3D) printer with a bacterial ink has been developed. This article describes the steps necessary to build this efficient, low-cost 3D bioprinter that offers multiple applications in bacterially-induced materials processing. The protocol begins with an adapted commercial 3D printer in which the extruder has been replaced with a bio-ink dispenser connected to a syringe pump system enabling a controllable, continuous flow of bio-ink. To develop a bio-ink suitable for biofilm printing, engineered Escherichia coli bacteria were suspended in a solution of alginate, so that they solidify in contact with a surface containing calcium. The inclusion of an inducer chemical within the printing substrate drives expression of biofilm proteins within the printed bio-ink. This method enables 3D printing of various spatial patterns composed of discrete layers of printed biofilms. Such spatially-controlled biofilms can serve as model systems and can find applications in multiple fields that have a wide-ranging impact on society, including antibiotic resistance prevention or drinking water purification, among others.

This article describes a method of transforming a low-cost commercial 3D printer into a bacterial 3D printer that can facilitate printing of patterned biofilms. All necessary aspects of preparing the bioprinter and bio-ink are described, as well as verification methods to assess the formation of biofilms.

Dreidimensionales Pattern von Ingenieurbiofilmen mit einem Do-it-yourself-Bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...