Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652 und HL068878 zu JBZ), der American Heart Association (National Scientist Entwicklung 0835237N JZ). YEC wird finanziell ausgestattet Frederick Huetwell Professor für Herz-Kreislauf-Medizin an der University of Michigan Medical Center (UMMC) unterstützt. Diese Arbeit genutzt von Center unterstützt Core Services für Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) bei UMMC.

Alle Tier Wartung, Pflege und Verwendung Verfahren wurden auf der Nutzung und Pflege der Tiere der Universität von Michigan überprüft und von der Universität Committee genehmigt. 1. ZFN Konstruktion und Auswahl <ol><li> Versorgung der genomischen Sequenzinformation des Gens von Interesse (z. B. Kaninchen ApoCIII) an den Hersteller. Wählen ZFN (e) für die Experimente auf der Grundlage der ZFN-Scores. </li></ol> 2. Kaninchenembryonen <ol><li> Superovulation sexuell gereift (6-18 Monate) New Zealand White (NZW) weiblichen Kaninchen durch subkutane (sc) Injektion von FSH zweimal / Tag mit einer Dosierung von 3 mg in den ersten beiden Injektionen, 5 mg für die nächsten zwei Injektionen und 6 mg für die letzten zwei Injektionen. </li><li> Verwalten einer einzelnen intravenösen (iv) Injektion von 200 IE hCG bei 72 Stunden nach der ersten Injektion FSH, um den Eisprung auslösen. Kamerad superovulierten die Frauen mit einem männlichen Kaninchen sofort nach der hCG-Injektion. </li><li> Euthanize die superovulierten Spender Kaninchen mit Natrium-Pentobarbital (150 mg / kg, iv) bei 16-18 Stunden nach der Befruchtung (psi). </li><li> Wiederherstellen der Eileiter Ampullen durch eine sorgfältige Erhebung der gesamten Eileiter und Eierstöcke Struktur. </li><li> Spülen jedes Eileiters mit 10 ml Medium der Manipulation HEPES gepuffert TCM 199, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, durch Einspritzen des Mediums aus dem Uterus Ende des Eileiters. Sammeln des Mediums gespült am Eierstock-Endöffnung des Eileiters in eine Petrischale. </li><li> Beachten und identifizieren erholt Embryonen im Medium gespült, waschen Sie die Embryonen dreimal in der Manipulation Medium, halten sie in der Manipulation Medium bei 38,5 ° C in der Luft, und unter einem Stereomikroskop beobachten sie für das Auftreten der Befruchtung. Bereiten Sie für die Mikroinjektion auf Vorkernstadium Embryonen 19-21 h psi </li></ol> 3. Vorbereitung der ZFN-mRNA <ol><li> Reinige die resultierende mRNA vor der Resuspension in RNase-freiem 0,1 X TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, 0,1 mM EDTA). Messung der Konzentration und speichern die mRNA bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie die mRNAs ZFN Paar (4-10 ng / ul in 1 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA bei pH 7,5), aliquoten kodiert, in 10 ul Fläschchen. Bewahren Sie sie bei -80 º C bis zur Verwendung. Vor der Mikroinjektion, tauen die RNA Durchstechflasche (n), und halten Sie es auf Eis. </li></ol> 4. Embryo-Mikroinjektion <ol><li> Bereiten Sie die Mikroinjektion Plattform, indem Sie einen 5 ul Tropfen Manipulation Medium auf einer gut 1-Kammer Folie, die das Medienkammer entfernt hat. Decken Sie die mittlere Tropfen mit Mineralöl und auf den beheizten Mikroskoptisch. </li><li> Legen Sie mit der Pipette (120 Mikrometer Durchmesser) in die Halterung Arm der Mikromanipulator und positionieren Sie es in den Tropfen der Manipulation Medium. </li><li> Fabrizieren Injektion Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Borosilikatglas Kapillaren in einer Mikropipette Puller Gerät. Laden der mRNA in die Injektionspipette eingespritzt werden. </li><li>Schalten Sie die Druckluftversorgung, die mit einem Mikroinjektor verbunden ist. </li><li> Zeigen Injektionspipette in die Injektionshalter, legte es auf den Mikromanipulator und die Position in die Manipulation Tropfen Medium. </li><li> Einrichten der Mikroinjektor, mit den folgenden vorgeschlagenen Parameter: holdP = 2 psi, in JP = 20 psi, 60 psi = ClearP, Injtime = 1 sec, die in einem Injektionsvolumen von 1-5 pl führt. </li><li> Öffnen Sie die Spitze der Injektionspipette durch leichtes Klopfen gegen die Haltepipette. </li><li> Transfer-Embryonen (30-50) an die Mikromanipulation Abfall auf der Plattform. Verwenden Sie die Haltepipette, um einen Embryo zu erfassen und richten Sie die Injektionsnadel, Embryo und die Haltepipette entlang der x-Achse. </li><li> Unter 400-facher Vergrößerung, vorab die Injektionspipette durch den Embryo. Seien Sie vorsichtig, um den Kern zu vermeiden. Sobald die Plasmamembran durchstoßen, drücken Fußpedal zu injizieren. Nach der Injektion, ziehen Sie die Nadel, lassen Sie den Embryo. Wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden emEmbryonen. </li><li> Dreimal waschen injizierten Embryonen in Embryokulturmedium, das aus Earle-Balanced Salt Solution (EBSS) mit nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), essentiellen Aminosäuren (EAA), 1 mM L-Glutamin, 0,4 mM Natriumpyruvat und 10% ergänzt aus FBS. </li><li> Embryonen Inkubation bei 38,5 ° C in 5% CO 2 in Luft für 1-2 Stunden, bevor sie chirurgisch in die Eileiter eines weiblichen Empfänger synchronisiert NZW-Kaninchen (siehe Schritt 5.1) übertragen. Alternativ können die Embryonen Kultur, bis sie Blastozystenstadium erreichen, bevor sie für die in vitro Freischaltung oder Tests verwendet. </li></ol> 5. Embryo Transfer <ol><li> Wählen Sie einen weiblichen NZW Kaninchen 5-12 Monate alt, bei guter Gesundheit, mit einem Gewicht von ca.. 4,0 bis 5,0 kg als Empfängertier. Verwalten Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH)-Injektion intramuskulär (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / Tier) an den Empfänger in der gleichen Zeitpunkt mit der hCG-Injektion zu dem Spendertier (s) (siehe Schritt 2.2). </li&gt; <li> Nach Abschluss der Mikroinjektion, bereiten Sie die Empfänger-Kaninchen für Embryo-Transfer (in der Regel 16-24 Stunden nach der GnRH-Injektion). Anesthetize das Kaninchen mit 10-40 mg / kg Ketamin (im), und / oder verdampft Isofluran (2-4%) durch Einatmen. Augen des Kaninchens Schutz vor Austrocknung durch die Anwendung einer sterilen ophthalmischen Salbe. Beobachten Sie das Tier, bis es vollständig unbewusst, dh. nicht in die Pedale treten Reflexe zu reagieren; drückte der Fuß-Pad verwendet wird, um die fehlende Pedal Reflex, der ein Hinweis auf eine adäquate Anästhesie ist zu überprüfen. </li><li> Rasur Bauch des Kaninchens, waschen mit antiseptischen Peeling, gefolgt von einer antiseptischen Lösung, und wischen Sie den rasierten Bereich mit steriler Gaze Schwämme. </li><li> Führen Operation unter sterilen Bedingungen, notieren Lebenszeichen des Empfängers Kaninchen etwa alle 15 Minuten während der Operation. </li><li> Übertragen 10-25 Embryonen einem Empfängertier, abhängig von der verfügbaren Anzahl von Embryonen. </li><li> Am Ende derchirurgische Verfahren, schließen Sie die Muskelschicht mit beschichteten resorbierbares Nahtmaterial. Naht der Haut entweder mit einer subkutanen Naht mit resorbierbarem Nahtmaterial oder mit einfachen unterbrochen Hautnähte mit Naht nonabsorable (zB Nylon Monofilament oder ähnliches). </li><li> Halten Sie das Tier warm und zu überwachen, bis seine Brustlage erreicht ist. </li><li> Überwachen Sie die Tier täglich. Folgen Sie den Anweisungen des Tierarztes für die Tierpflege. Verwalten Meloxicam (sc 1,0 mg / kg), Schmerzen zu lindern und / oder durch den Tierarzt notwendig bestimmt Fieber senken täglich nach der Operation. </li><li> Entfernen nonabsorable Hautnähte bei etwa 10-14 Tage nach der Operation. </li></ol> 6. Nachweis von ZFN Induced Gene Störungen <ol><li> Für die in vitro-Validierung, führen Genotypisierung auf den in vitro kultivierten Embryonen. Lyse einzelnen Embryonen zu Morula / Blastozysten Stufen Proteinase K in Taq-Puffer entwickelt in 5 ul NP40-Lösung (1% NP40 und 1 ug / ml) Für 0,5-1 Std. bei 55 ° C und 10 min bei 95 ° C. </li><li> Für die Genotypisierung der Nachkommen, sammeln Ohr Hautproben von Neugeborenen-Kits, genomische DNA zu extrahieren, und verwenden Sie sie als Vorlagen für die PCR-Sequenzierung. Bewerben Kwik-Stopp, um den Stichprobenraum nach der Sammlung die Blutung zu stoppen und reduzieren Unbehagen. </li><li> Verwenden der Lyse von Schritt 6.2 oder 6.3 als Template für PCR unter Verwendung von LA-Taq-und PCR-Primerpaar, das stromaufwärts angeordnet sind (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) und stromabwärts (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) der Zielstelle ZFN . </li><li> PCR-Produkte zu reinigen und zu sequenzieren sie mit Sequenzierungsprimer (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;). </li><li> Identifizieren mutierten Proben durch die Suche nach Doppelkurve im Sequenzdiagramm um die Targeting-Website. Beschriften Sie die, die mit doppelten Kurven als &quot;positiv&quot;. </li><li> Klonen Sie die &quot;positive&quot; PCR-Produkte in die TA-Klonierungsvektor, nehmen Sie 10-20 Klone, Reihenfolge die Einsätze, und bestätigen Sie die Mutationen der ganzen targeting Ort. </li></ol>

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	<li>Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III:+understanding+an+emerging+cardiovascular+risk+factor.">Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor.</a> Clinical Science. 114, 611-624 (2008).</li><li>Pollin, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+null+mutation+in+human+APOC3+confers+a+favorable+plasma+lipid+profile+and+apparent+cardioprotection.">A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection.</a> Science. 322, 1702-1705 (2008).</li><li>Ginsberg, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+B+metabolism+in+subjects+with+deficiency+of+apolipoproteins+CIII+and+AI.+Evidence+that+apolipoprotein+CIII+inhibits+catabolism+of+triglyceride-rich+lipoproteins+by+lipoprotein+lipase+in+vivo.">Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo.</a> The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).</li><li>Cohn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+apoC-III+production+is+a+characteristic+feature+of+patients+with+hypertriglyceridemia.">Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia.</a> Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).</li><li>Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+production+of+plasma+and+very-low-density+lipoprotein+(VLDL)+apolipoprotein+C-III+is+strongly+related+to+the+concentration+and+level+of+production+of+VLDL+triglyceride+in+male+subjects+with+different+body+weights+and+levels+of+insulin+sensitivity.">Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).</li><li>Maeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+apolipoprotein+C-III+gene+in+mice+results+in+hypotriglyceridemia+and+protection+from+postprandial+hypertriglyceridemia.">Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).</li><li>Jong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III+deficiency+accelerates+triglyceride+hydrolysis+by+lipoprotein+lipase+in+wild-type+and+apoE+knockout+mice.">Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice.</a> Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).</li><li>James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+in+transgenic+mice.">Cardiac physiology in transgenic mice.</a> Circ. Res. 82, 407-415 (1998).</li><li>Duranthon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+emerging+role+of+rabbit+as+human+disease+model+and+the+instrumental+role+of+novel+transgenic+tools.">On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools.</a> Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).</li><li>Fan, J., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rabbits+as+therapeutic+protein+bioreactors+and+human+disease+models.">Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models.</a> Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).</li><li>Shiomi, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Watanabe+heritable+hyperlipidemic+(WHHL)+rabbit,+its+characteristics+and+history+of+development:+a+tribute+to+the+late+Dr.+Yoshio+Watanabe.">The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe.</a> Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).</li><li>Morehouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CETP+activity+by+torcetrapib+reduces+susceptibility+to+diet-induced+atherosclerosis+in+New+Zealand+White+rabbits.">Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits.</a> Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).</li><li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li><li>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+editing+of+bacterial+genomes+using+CRISPR-Cas+systems.">RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.</a> Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).</li><li>Petersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+'molecular+scissors'+for+transgenic+farm+animal+production.">Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PPARgamma+mono-allelic+knockout+pigs+via+zinc-finger+nucleases+and+nuclear+transfer+cloning.">Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning.</a> Cell Research. 21, 979-982 (1038).</li><li>Flisikowska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+immunoglobulin+gene+disruption+and+targeted+replacement+in+rabbit+using+zinc+finger+nucleases.">Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases.</a> PLoS ONE. 6, e21045 (2011).</li><li>Foley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+zebrafish+using+customized+zinc-finger+nucleases.">Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.</a> Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).</li><li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knockout+rats+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+(X-SCID)+using+zinc-finger+nucleases.">Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases.</a> PLoS ONE. 5, e8870 (2010).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertriglyceridemia+and+delayed+clearance+of+fat+load+in+transgenic+rabbits+expressing+human+apolipoprotein+CIII.">Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII.</a> Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).</li><li>Hauschild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+a+biallelic+knockout+in+pigs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In der vorliegenden Arbeit wurden fünf ApoCIII KO Kaninchen unter Verwendung des ZFN-Technologie erzeugt. Bisher der einzige Bericht der Produktion von GTT Kaninchen verwendet auch die ZFN-Technologie 18. Die vorliegende Arbeit bestätigt, dass ZFN ist nützlich, um Gene in Kaninchen effektiv Ziel. In der vorliegenden Studie, die transgene Rate (positive Sätze / Gesamt geboren) is23.8% (5/21), die vergleichbar mit der von der vorherigen Bericht ZFN in Kaninchen (30,8%, 16/52), 18, ​​und diejenigen, berichtet der Verwendung von ZFN in anderen Tierarten, darunter 19 Zebrafisch, Maus 20, 21 Ratten und Schweinen 17. Diese Rate ist in der Tat höher als die Preise von vielen herkömmlichen transgenen Kaninchen Produktionsstudien, die in der Regel im Bereich von 5-20% sinken. Zum Beispiel, in einer Bemühung, Produkt ApoCIII transgenen Kaninchen über konventionelle DNA-Mikroinjektion, Ding et al. Erhaltenen 3 positive Gründer von 54 Welpen geboren (5,6%) 22. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen, die Mutationen an den Targeting Websites variable, einschließlich Deletionen oder Insertionen, die aus unterschiedlichen Anzahl von Basen (im Bereich von 1 bis 21 in den fünf KO Kaninchen). Basierend auf der spezifischen Sequenz-Informationen der Gründertiere wird vorhergesagt, dass mindestens vier (dh. Diejenigen, die Δ1, +1, +1, oder Δ20 Mutationen) würde Funktionsverlust von ApoCIII haben. Tier R-16 mit Δ21 nicht funktionalen Verluste auf, da diese Mutation nur zum Verlust von sieben Aminosäuren vorhergesagt, aber nicht eine Leserahmenverschiebung. Letztlich sind Phänotyp Tests notwendig, um festzustellen, ob diese Gründertiere wirklich den Verlust von ApoCIII Funktionen anzuzeigen. Keine der fünf KO Kaninchen in der vorliegenden Studie erzeugten enthalten biallelische Modifikationen. Interessanterweise ist dies auch in der vorherigen ZFN Kaninchen Bericht der Fall ist. Im Gegensatz dazu, wenn ZFNs Targeting α1 ,3-Galaktosyltransferase wurden Schwein angewendetZellen, die Häufigkeit von Aktionen in einem bestimmten Allel 7-46% lag, mit rund einem Drittel der Mutationen, die Einzelschritt-biallelische 23 Knockouts. Im Einklang mit dieser, wenn TALEN wurde die Schweine Fibroblasten-Zellen aufgetragen, die biallelische Änderungen wurden in ca. 15-40% der gesamten positiven Klone 14 gefunden. Es ist möglich, dass die Nicht biallelische KO Kaninchen in der vorliegenden Studie zu erzeugen, kann eine Spezies Differenz (dh Kaninchen vs Schweine) für solche Kapazität von Nuklease-Gen-Targeting basierend anzuzeigen. Es ist jedoch wahrscheinlicher, dass dies einfach, da die Anzahl von KO Kaninchen in diesem Projekt erzeugt ist relativ klein. Wir glauben, dass ZFN ist in der Lage bialleic Mutationen in Kaninchen, die als ein weiterer Vorteil der ZFN basierend GTT Kaninchen Produktion berücksichtigt werden sollten. Weitere Experimente sind notwendig, um eine solche Kapazität von ZFN in Kaninchen zu bestätigen. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass ZFN Basis Gen-Targeting-Ansatz ist effektiv in der Herstellung von KO Kaninchen. Insbesondere haben wir einen fünf ApoCIII KO Kaninchen mit einem zufriedenstellenden transgenen Rate von 23,8%. Diese Tiere sind vermutlich mehr aussagekräftige Informationen über die Rolle dieses Proteins auf den Lipidstoffwechsel beim Menschen als die entsprechenden Maus-Modellen bieten. Wir sagen voraus, basierend ZFN-Gen-Targeting, sowie andere Nuklease basierte Technologien wie TALEN und RGEN, in nonmurine Tiere erheblich erleichtern die Entwicklung von neuen Tiermodellen für verschiedene menschliche Krankheiten zu studieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Flussdiagramm der Herstellung von Knockout-Kaninchen mit ZFN-Technologie. Herstellung von KO Kaninchen unter Verwendung ZFN Technik beginnt mit der Auswahl des Gens von Interesse. Die Sequenzinformation vorgesehen ist, ZFN-Sets entworfen und subjektiert Hefe-Basis in-house Validierung. Beim Check Point (CP) 1 (CP-1), werden nur die Sätze geführt, in-house Validierung (50% oder mehr der internen Positivkontrolle) für die Benutzer zur Auswahl angeboten werden. Wenn keine Sets passieren CP-1, können zusätzliche Sequenz für die Entwicklung wirksamer ZFN-Sets benötigt. Ein Embryo in vitro Validierung verfolgt, um sicherzustellen, dass die ausgewählten ZFN-Set kann Mutationen an ausgewählten Standorten (CP-2) zu induzieren. ZFN (e) wird nur verwendet, wenn es CP-2 geht (&gt; = 10% Mutationsraten in in-vitro-Embryonen). Ausfall bei CP-2 wird eine Neugestaltung der ZFN-Sets erfordern. Embryo Spender wird vorbereitet und Vorkernstadium Embryonen mit den validierten ZFN-Sets mikroinjizierten werden. Diese mikroinjizierten Embryonen synchronisiert Embryo Empfänger übertragen werden. Nach einem Monat Tragzeit, werden Neugeborene genotypisierende (CP-3). Falls keine der Neugeborenen positiv sind, werden zusätzliche Mikroinjektion durchgeführt werden. Es dauert 2-3 Monate nach Beginn des Projektes an CP-2, unter der Annahme no Ausfall während des Prozesses. Es dauert weitere 2-3 Monate von CP-CP-2 bis 3. Daher ist es möglich, einen KO-Kaninchen in einem Zeitrahmen von 4 bis 6 Monate mit der ZFN-Technologie zu generieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> 2. ZFN-Design. ZFN drei Sätze (Satz 1, 2 und 3) wurden auf unterschiedliche Sequenzen auf Exon 1 und Exon 2 von Kaninchen ApoCIII (A) ausgebildet ist. Alle drei Sätze wurden in der Hefe MEL-1-Reporter-Assay, die ZFN-Aktivitäten zu bestimmen. Nach den Protokollen des Herstellers sind ZFNs, die&gt; 50% der Aktivitäten der von den Hersteller interne positive Kontrolle zeigen, wie nützlich für die in-vitro-und in vivo-Experimente Genom Bearbeitung angesehen.Die ZFN Aktivitäten waren 224,2% für Set 1, 196,9% für Set 2 und 177,8% für Set 3 (B), also Set 1 wurde in der vorliegenden Studie ausgewählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> Abbildung 3. In-vitro-Embryo Validierung von ZFN. Die mRNA (5 ug / ml) von Set 1 wurde in das Cytoplasma von 35 Stufe Kaninchenembryonen pronukleären (A) mikroinjiziert. Flutsch und Embryonen ohne Mikroinjektionsbehandlung (n = 31) wurden als Kontrollgruppe verwendet. Die BL Entwicklungsrate war 77,4% in der Kontrollgruppe. In der Mikroinjektion Gruppe war die BL Rate 51,4%. 16 BLs PCR-Sequenzierung unterzogen wurden 8 (50%) als positiv identifiziert, was anzeigt, Set 1 ist eine effektive ZFN Satz von Mutationen im targe induzierenting Website (B, apoc3wt.seq, schwarz-boxed) von ApoCIII bei Kaninchen. Die BLS, die Mutationen sind BL-apoc # 3, 4, 5, 7, 11, 13, 15 und 17 (B, rot unterstrichen). Die restlichen BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 und 16) haben keine Mutationen am Targeting-Website. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> 4. Die Produktion von ApoCIII KO Kaninchen. Hundert und fünfundvierzig Embryonen mit ZFN Set 1 mRNAs mikroinjizierten wurden 7 pseudo-schwangere Kaninchen Empfänger (A) übertragen. Frisch gespült Embryos (n = 75) ohne ZFN Mikroinjektion wurden an Empfänger (n = 6) als die Kontrollgruppe. Der Begriff Rate berechnet als Gesamtlaufsätze / Gesamt Embryonen in Experiment Gruppe 140,5% (21/145), während die Rate 29,3% (22/75) in der Kontrollgruppe (A). Von 21 Bausätze in den mikroinjizierten Gruppe, fünf (R1, R9, R11, R12 und R16) geboren wurden als positiv KO-Kits nach der PCR-Sequenzierung (B) identifiziert. Die indels am Targeting-Website enthalten zwei Insertionen (+1 sowohl für R9 und R11) und drei Deletionen (Δ1, Δ 20, Δ 21 für R1, R12 und R16, beziehungsweise). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) ist ein kleiner O-glycosylierten sekretorisches Protein, das hauptsächlich in der Leber und im Darm synthetisiert wird. Es liegt auf der Oberfläche der Plasma Chylomikron (CM), sehr niedrige Dichte Lipoprotein (VLDL) und Lipoproteinen hoher Dichte (HDL). ApoCIII wurde als Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen ein anerkannt. Patienten mit erblichen Mangel an ApoCIII niedrige Plasma-Triglycerid (TG)-Spiegel und reduzierte subklinischen koronaren Atherosklerose 2,3. Erhöhte Plasma-ApoCIII Ebene andererseits korreliert oft mit Insulinresistenz, Fettleibigkeit, Hypertriglyceridämie und (HTG) 4,5. Gen-Knockout (KO) ist ein wirksames Instrument, um die Funktion eines Gens zu untersuchen. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen in der menschlichen Mutanten-Populationen, Knockout des ApoCIII Gens in Mäusen führte zu einer Reduktion der Plasma-TG und Schutz vor postprandialen HTG 6. Solche positive Rolle der ApoCIII erschienenunabhängig von Apolipoprotein E (ApoE) zu sein, da Mäuse beiderlei ApoE und ApoCIII-Mangel auch postprandiale Hyperlipidämie 7 geschützt. Obwohl diese ApoCIII KO Mausmodelle wertvolle Informationen über die möglichen Funktionen von ApoCIII bei Menschen vorgesehen ist, wird darauf hingewiesen, dass der Metabolismus von Lipoprotein von Mäusen unterscheidet sich von der des Menschen in vielen Aspekten. Zum Beispiel fehlt Mausplasma Cholesterylester-Transferprotein (CETP), ein Hauptenzym bei der Beförderung von VLDL, LDL beteiligt ist, und HDL-8. Daher ist es notwendig, ein geeignetes Tiermodell zu entwickeln, um die physiologische Rolle von ApoCIII in vivo weiter zu verstehen. Das Kaninchen ist ein klassisches Modell Tierarten 11.09. Es hat eine kurze Tragezeit (30-31 Tage), große Wurfgröße (4-12/litter) und kann bequem in einer Indoor-Anlage untergebracht werden. Im Vergleich zu Mäusen, Kaninchen sind phylogenetisch näher an den Menschen 10. Wichtig ist, wie huMann, aber im Gegensatz zu Mäusen, Kaninchen sind LDL-reichen Säugetiere und haben erhebliche Mengen an CETP 10,12. Darüber hinaus sind sie anfällig für cholesterinreichen Diät-induzierten Atherosklerose mit ähnlich denen in menschlichen Arteriosklerose 13 ersichtlich Läsionen. Aus diesen Gründen ist die Hypothese aufgestellt, dass wir ApoCIII KO Kaninchen kann als ein besseres Modell als ihre Kollegen der Maus, um die Rollen ApoCIIIplay im Lipidstoffwechsel und Atherosklerose beim Menschen untersuchen zu dienen. Die Produktion von Gen gezielt transgene (GTT) Kaninchen war eine Herausforderung. Dies ist hauptsächlich auf das Fehlen von Keimbahn-Übertragung von embryonalen Stammzellen (ESC) und die extrem geringe Effizienz der Zellkerntransfer (SCNT) bei Kaninchen. ESC ist das wichtigste Werkzeug, um GTT Mäuse zu erzeugen, während und SCNT wurde erfolgreich angewendet, um KO Tiere zu erzeugen in der Art fehlt Keimbahn-Übertragung WSR, darunter Schweine, Schafe und Rinder, aber nicht Kaninchen. Kürzlich Zinc Finger Nuclease (ZFN), TranBezugs Activator-Like-Effektor Nuclease (TALEN) 14 und RNA Guided Endonuklease (RGEN) 15 erwies sich als wirkungsvolles Mittel für die Genom Bearbeitung. Diese Nukleasen, sogenannte &quot;molekulare Scheren&quot;, sind effizient bei der Erzeugung von Doppelstrangbrüchen (DSB) in das Genom, die mit einer funktionellen KO des Zielgens führen oder verwendet, um eine DNA-Sequenz an einer bestimmten Stelle im Genom zu integrieren eine Reihe von Arten, 16. Im Jahr 2011 unter den ersten, die Anpassung der ZFN-technik erwirtschafteten wir Peroxisomproliferator-aktivierter Rezeptor-gamma (PPAR) KO Schweinezellen über diese Vorgehensweise und erfolgreich generiert PPAR KO Schweine nach der Verwendung dieser Zellen für die SCNT 17. Im gleichen Jahr wurde eine effiziente Immunglobulin-Gen-Störung und gezielte Ersatz bei Kaninchen auch mit ZFN 18 berichtet. In der vorliegenden Studie wurden fünf ApoCIII KO Kaninchen erzeugt, wie durch PCR-Sequenzierung bestätigt, mit ZFN Set 1 (siehe Abbildung 1 </sTrong&gt;. für Flussdiagramm Abbildung). Diese Tiere sind neue Ressourcen, um die Rollen der ApoCIII in Lipidstoffwechsel zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) befindet sich auf der Oberfläche der Plasma Chylomikron (CM), sehr niedrige Dichte Lipoprotein (VLDL) und Lipoproteinen hoher Dichte (HDL). Es wurde erkannt, dass eine hohe Plasma ApoCIII constitutea Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Erhöhte Plasma ApoCIII Ebene korreliert oft mit Insulinresistenz, Adipositas und Hypertriglyzeridämie. Unschätzbare Kenntnisse über die Rolle der ApoCIIIin Lipidstoffwechsel und CVD wurde aus transgenen Mausmodellen einschließlich ApoCIII-Knockout (KO)-Mäusen erhalten wurden, jedoch wird darauf hingewiesen, dass der Metabolismus von Lipoprotein in Mäusen unterscheidet sich von der des Menschen in vielen Aspekten. Es ist bis jetzt noch nicht, ob erhöhte Plasma-ApoCIII direkt atherogenen bekannt. Wir arbeiteten an ApoCIII KO Kaninchen in der vorliegenden Studie auf der Grundlage der Hypothese, dass Kaninchen als reasonablemodelfor Studium der menschlichen Fettstoffwechsel und Atherosklerose dienen zu entwickeln. Zinkfinger-Nuclease (ZFN) Sätze Targeting Kaninchen ApoCIIIgene wurden in vitro Validierung vor der Embryo Mikroinjektion unterzogen. Die mRNA wurde in das Zytoplasma von 35 Kaninchen Vorkernstadium Embryonen injiziert, und bewertet die Mutationsraten im Blastozysten-Staat. Von sechzehn Blastozysten, die untersucht wurden, wurde ein zufriedenstell 50% Mutationsrate (8/16) an der Ziel Website erreicht, die den Einsatz von Set 1 für in vivo-Experimenten. Nächstes mikroinjizierten wir 145 Embryonen mit Set 1 mRNA und übertragen diese Embryonen zu 7 Empfänger Kaninchen. Nach 30 Tagen der Trächtigkeit wurden 21 Kits geboren, von denen fünf als ApoCIII KO Kaninchen nach PCR-Sequenzierung Tests bestätigt. Die KO Tier Rate (# KO-Kits / Gesamt geboren) war 23,8%. Die Gesamtproduktionsleistung liegt bei 3,4% (5 kits/145 Embryonen übertragen werden). In der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass ZFN ist eine hocheffiziente Methode, um KO Kaninchen zu produzieren. Diese ApoCIII KO Kaninchen sind neue Ressourcen, um die Rollen der ApoCIII in Lipidstoffwechsel zu untersuchen.

In-vitro-Validierung von ZFN Paare Sechzehn ZFN Paare wurden ursprünglich entwickelt. Die gezielte Zerstörung Sequenz von Set 1 an Exon 2 von Kaninchen ApoCIII (2A) befindet. Drei Paare (Set 1, 2 und 3, Fig. 2A) wurden ausgewählt und in den Hefe-MEL-1-Reportertest unterworfen, um die ZFN-Aktivitäten (Fig. 2B) zu bestimmen. Set 1 hat einen Score von 224,2 ZFN%, höher als die der Set 2 (196,9%) und Set 3 (177,8%) und deutlich höher als die Auswahlschwelle (dh 50% der internen Positivkontrolle). Daher wurde ein Set für in vitro-Validierungsexperimente ausgewählt. Ein bestimmter Satz braucht, um in einem positiven Raten in den Embryonen von 10% oder mehr führen, um den Embryo in vitro Validierung auf der Basis der internen Validierungskriterien bestehen. Die mRNA (5 ug / ml) von Set 1 wurde in das Cytoplasma von 35 Vorkernstadium Kaninchenembryonen (3A &lt;mikroinjiziert/ Strong&gt;). Flutsch und Embryonen ohne Mikroinjektionsbehandlung (n = 31) wurden als Kontrollgruppe verwendet. Achtzehn Embryonen von mikroinjizierten Gruppe BL auf der Bühne entwickelt, D5, von denen sechzehn wurden sequenziert, und acht (BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 3B, unterstrich rot) angezeigt mutiert Sequenzen am Targeting-Website (schwarz-boxed, 2B, obere Reihe, apoC3wt.seq). Die BL Rate des mikroinjizierten-Gruppe (51,4%) niedriger als die der Kontrollgruppe (77,4%), was leicht beeinträchtigt Entwicklungskompetenz von mikroinjizierten Embryonen. Die positive Mutationsrate der Embryonen mikroinjiziert 50,0% (8/16), viel höher als der Auswahlschwellenwert (dh 10%). Diese Ergebnisse zeigten, dass Set 1 ist eine effektive ZFN-Set, um Mutationen im Targeting Website von Kaninchen ApoCIII induzieren. Daher Set 1 wurde für in vivo-Produktion von ApoCIII KO Kaninchen gewählt. Die Produktion von ApoCIII KO Kaninchen Die mRNA of ZFN Set 1 wurde in das Zytoplasma Kaninchens Vorkernstadium Embryos mikroinjiziert, und über 145 mikroinjizierten Embryonen bis 7 pseudoschwangere Empfängerkaninchen (Fig. 4A). Frisch gespült Embryos (n = 75) ohne ZFN Mikroinjektion wurden an Empfänger (n = 6) als die Kontrollgruppe. Nach 30 Tagen der Trächtigkeit wurden 21 Sets in der mikroinjizierten Gruppe geboren. PCR-Sequenzierung identifiziert fünf (APOC3-R1, R9, R11, R12 und R16) als positiv KO-Kits (4B). Der Begriff Rate berechnet als Gesamtlaufsätze / Gesamt Embryonen 14,5% (21/145), während die Rate 29,3% (22/75) in der Kontrollgruppe. Die KO-Rate berechnet als Gesamt KO Sätze / Gesamtlaufzeit liegt bei 23,8% (5/21). Ein KO-Kit (apoC-R16) starb fünf Tage nach der Geburt (20,0%, 1/5). Die indelsat Targeting-Website enthalten zwei Insertionen und drei Deletionen, sie areΔ1, +1, +1, Δ20 und Δ21 für Kaninchen # R1, R9, R11, R12 und R16, jeweils (Fig. 4B). Bioinformatics Analyse wurde verwendet, um potentielle ZFN mit 7 oder weniger Fehlanpassungen zu 1-Sequenz zu identifizieren Off-Set-Ziele, wie zuvor 17 beschrieben. Nur eine vorausgesagt möglich Off-Target-Website, auf Chromosom 14 befindet, wurde mit sieben übereinstimm bps identifiziert. PCR-Test nachgewiesen keine Off-Target-Ereignisse in einem der Gründertiere.

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Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Neueste Entwicklungen in der Gen-Targeting-Tools macht die Produktion von Knockout (KO) Kaninchen möglich. In der vorliegenden Arbeit haben wir einen fünf Apolipoprotein (Apo) C-III KO Kaninchen mit Zink-Finger-Nukleasen (ZFN). Diese Arbeit zeigte, dass ZFN ist eine hocheffiziente Methode, um KO Kaninchen zu produzieren.

Die Produktion von Apolipoprotein C-III-Knockout Kaninchen mit Zink-Finger-Nukleasen

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K Aufrufe.  University of Michigan Medical Center.  Neueste Entwicklungen in der Gen-Targeting-Tools macht die Produktion von Knockout (KO) Kaninchen möglich. In der vorliegenden Arbeit haben wir einen fünf Apolipoprotein (Apo) C-III KO Kaninchen mit Zink-Finger-Nukleasen (ZFN). Diese Arbeit zeigte, dass ZFN ist eine hocheffiziente Methode, um KO Kaninchen zu produzieren. 

Serie: Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Isolierung und Verwendung von Rinder Abschnitte A. und V. mesenterica als Bioassay für Vasoaktivität im Dünndarm Testen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Forschung

Medizin

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, dyslipidemia, and diabetes. To date, there is evidence to support a role for circulating aldosterone as a risk factor for the development of cardiovascular disease. Transgenic mouse models have been generated to study cellular and molecular processes leading to atherosclerosis. In this manuscript, we describe a protocol that takes advantage of continuous infusion of aldosterone in ApoE-/- mice and generates atherosclerotic plaques in the aortic root after 4 weeks of treatment. We, therefore, illustrate a method for quantification and characterization of atherosclerotic lesions at the aortic root level. The added value of aldosterone infusion is represented by the generation of atherosclerotic lesions rich in lipid and inflammatory cells after 4 weeks of treatment. We describe in detail the staining procedures to quantify lipid and macrophage content within the plaque. Notably, in this protocol, we perform heart tissue-embedding in OCT in order to preserve the antigenicity of cardiac tissue and facilitate detectability of antigens of interest. Analysis of the plaque phenotype represents a valid approach to study the pathophysiology of atherosclerosis development and to identify novel pharmacological targets for the development of anti-atherogenic drugs.

We describe a protocol to induce atherosclerosis in the aortic root of ApoE-/- mice fed with an atherogenic diet, through a continuous release of aldosterone. Methods to characterize plaque composition are also described.

Induktion von atherosklerotischen Plaques durch Aktivierung von Mineralocorticoid-Rezeptoren im Apolipoprotein E-defizienten Mäusen

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

Präklinische Modell von Hind Limb Ischemia in diabetischen Kaninchen

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Etablierung eines schweren Trockenauges modell mit vollständiger Dakryoadenektomie bei Kaninchen

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Blind Endotracheal Intubation in Neonatal Rabbits

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical characteristics, which is further complicated in the case of the newborn. Of the different methods of advanced airway management, endotracheal intubation is less aggressive than tracheostomy, and is more feasible than supraglottic management given the lack of supraglottic devices of such a small size. As direct glottis visualization is very difficult in animals this size, this blind intubation model is presented as an effective alternative, especially for experiments requiring prolonged anesthesia. Using this method, we performed blind intubations with a 90% success rate.

We describe a technique of endotracheal intubation in newborn rabbits after esophageal catheterization with a gastric tube.

Blinde Endotrachealintubation bei neonatalen Kaninchen

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease and arrhythmias in people with epilepsy (i.e., epileptic heart.) Additionally, cardiac and autonomic disturbances have been reported surrounding seizures. 1:1,000 epilepsy patients/year die of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). The mechanisms for SUDEP remain incompletely understood. Electroencephalograms (EEG) and electrocardiograms (ECG) are two techniques routinely used in the clinical setting to detect and study the substrates/triggers for seizures and arrhythmias. While many studies and descriptions of this methodology are in rodents, their cardiac electrical activity differs significantly from humans. This article provides a description of a non-invasive method for recording simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography in conscious rabbits. As cardiac electrical function is similar in rabbits and humans, rabbits provide an excellent model of translational diagnostic and therapeutic studies. In addition to outlining the methodology for data acquisition, we discuss the analytical approaches for examining neuro-cardiac electrical function and pathology in rabbits. This includes arrhythmia detection, spectral analysis of EEG and a seizure scale developed for restrained rabbits.

Using simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography, we developed a methodology to evaluate the susceptibility of rabbit models to develop provoked arrhythmias and seizures. This novel recording system establishes a platform to test the efficacy and safety of therapeutics and can capture the complex cascade of multi-system events that culminate in sudden death.

Multisystem-Monitoring zur Identifizierung von Anfällen, Arrhythmien und Apnoe bei bewusst zurückhaltenden Kaninchen

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...

Three-Dimensional Finger Motion Tracking during Needling: A Solution for the Kinematic Analysis of Acupuncture Manipulation

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D motion tracking technology to measure the kinematic parameters of the joints of fingers during acupuncture manipulation (AM) and establish three technical indicators "amplitude, velocity and time". This method can reflect the operation characteristics of AM and provide quantitative parameters along three axes of multiple finger joints. The current evidence shows that the method has great potential for future applications such as the study of the dose-effect relationship of acupuncture, teaching, and learning of AM, and the measurement and preservation of famous acupuncturists' AM.

This experimental method describes a solution for the kinematic analysis of acupuncture manipulation with three-dimensional finger motion tracking technology.

Dreidimensionales Finger Motion Tracking beim Needling: Eine Lösung für die kinematische Analyse der Akupunkturmanipulation

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D ...

A Modified Technique for Arteriovenous Fistula Construction in Rabbits

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury to the veins and arteries during the operation and hemodynamic changes can lead to intimal hyperplasia, leading to juxta-anastomotic stenosis. To reduce injury to the veins and arteries during the operation, this study proposes a new modified no-touch technique (MNTT) for AVF construction that can decrease the rate of juxta-anastomotic stenosis and improve the AVF patency. To unravel the hemodynamic changes and mechanisms of the MNTT, this study presented an AVF procedure using this technique. Although this procedure is technically challenging, 94.4% procedural success was achieved after adequate training. Ultimately, 13 out of 34 rabbits had a functional AVF 4 weeks after the surgery, leading to a 38.2% AVF patency rate. However, at 4 weeks, the survival rate was 86.1%. Ultrasonography showed active blood flow through AVF anastomosis. Furthermore, the spiral laminar flow was observed in the vein and artery near the anastomosis, suggesting that this technique may improve the hemodynamics of the AVF. On histological observation, significant venous intimal hyperplasia was observed at the AVF anastomosis, whereas no significant intimal hyperplasia was observed at the proximal external jugular vein (EJV) of the anastomosis. This technique will improve the understanding of the mechanisms underlying the use of MNTT for AVF construction and provide technical support for the further optimization of the surgical approach in AVF construction.

The present protocol proposes the creation of an arteriovenous fistula in rabbits using a modified no-touch technique. The technique involves the side-to-side anastomosis of the common carotid artery and external jugular vein without the dissection of the perivenous tissues or cutting off the artery.

Eine modifizierte Technik zur arteriovenösen Fistelkonstruktion bei Kaninchen

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury ...