この作品は、部分的に国立衛生研究所からの補助金によって賄われていた（HL105114、HL088391、NS066652、およびYECにHL068878）、米国心臓協会（JZナショナル·サイエンティスト開発0835237N）。 YECは、財政的にミシガン大学医療センター（UMMC）の循環器内科の恵まれフレデリックHuetwell教授としてサポートされています。この作品はUMMCのトランスレーショナル科学および治療のための高度なモデルのためのセンター（CAMTraST）でサポートされているコアサービスを利用した。

全ての動物の保守、管理および使用手順は、ミシガン大学の動物の使用およびケアに見直し、大学委員会によって承認された。 1。 ZFN設計·選定<ol><li>メーカーに目的の遺伝子（ 例えばウサギアポCIII）のゲノム配列情報を提供する。 ZFNスコアに基づいて実験のために、ZFNセット（複数可）を選択します。 </li></ol> 2。ウサギの胚コレクション<ol><li>過剰排卵は性的（6〜18ヶ月）成熟したニュージーランドホワイト（NZW）最初の2回の注射、次の2回の注射と6mgのための5 mgのための3ミリグラムの投与量とFSHの皮下（SC）注射回/日による雌ウサギ最後の2回の注射のための。 </li><li>排卵を誘発する最初のFSHの注射後72時間で200 IU hCGの単回静脈内（iv）注射を管理します。すぐにhCG注射後の雄のウサギの過排卵メスメイト。 </li><li> EuthaniZEペントバルビタールナトリウムで過剰排卵ドナーウサギ（1​​50 mg / kgを、IV）を16〜18時間後に受精（PSI）で。 </li><li>慎重に全体の卵管と卵巣の構造を収集することにより、卵管膨大部を回復。 </li><li> HEPES 10mlの操作培地で各卵管をフラッシュ子宮卵管の端部から媒体を注入することにより、10％ウシ胎児血清を補充したTCM 199緩衝。ペトリ皿に卵管卵巣端開口部にフラッシュされたメディアを収集します。 </li><li>観察して、フラッシュされた培地中で回収された胚を特定の操作媒体に胚を3回洗って、空気中に38.5℃で操作媒体に保管し、受精の発生を実体顕微鏡下でそれらを観察します。前核期胚に微量注入の準備を19〜21時間PSI </li></ol> 3。 ZFN mRNAの準備<ol><li> RNA分解酵素を含まない0.1×TE（1 mMのトリス-Cl、pHの再懸濁の前に得られたmRNAを精製pH8.0、0.1mMのEDTA）。濃度を測定し、使用するまで-80℃でmRNAを格納します。 </li><li> ZFNペアをコードするmRNAを準備します（4-10 NG / pH7.5で1のトリス-Clで、0.1 mMのEDTA中μL）、10μLバイアルにアリコート。使用直前まで-80ºCで保存します。マイクロインジェクションの前に、RNAのバイアル（複数可）を解凍し、氷上で保管してください。 </li></ol> 4。胚のマイクロインジェクション<ol><li>削除メディア室を持っている1ウェルチャンバースライド上で操作媒体の5μlのドロップを配置することによって、マイクロインジェクションプラットフォームを準備します。加熱された顕微鏡のステージ上のミネラルオイルと場所と中程度の廃棄をカバーしています。 </li><li>マイクロマニピュレータのホルダアームに保持ピペット（120μmの直径）を配置し、操作媒体の低下にそれを配置します。 </li><li>マイクロピペットプラー装置にホウケイ酸ガラス毛細管を加熱し、引っ張​​ることにより注射マイクロピペットを作製する。インジェクションピペットで注入されるmRNAをロードします。 </li><li>マイクロインジェクターに接続された圧縮空気供給をオンにします。 </li><li> 、インジェクションホルダーにインジェクションピペットを置くマイクロマニピュレータの上に置くと操作媒体の低下にそれを配置します。 </li><li>次の提案したパラメータで設定マイクロインジェクター、：holdP = 2 PSI、InjP = 20 PSI、1-5 PLの注入量になりますCLEARP = 60 PSI、Injtime = 1秒、。 </li><li>静かにホールディングピペットに対してそれをタップすることで、注入ピペットの先端を開きます。 </li><li>プラットフォーム上のマイクロマニピュレーション降下胚（30〜50）を転送。胚をキャプチャし、注射針、胚およびx軸に沿って保持ピペットを整列させるためにホールディングピペットを使用する。 </li><li> 400X倍率下では、胚を通じてインジェクションピペットを進める。核を避けるように注意してください。原形質膜が穿孔されると、プレスフットペダルを注入する。注射後、針を撤回、胚をリリース。残りのすべてのEMのためのプロセスを繰り返しbryos。 </li><li>非必須アミノ酸（NEAA）、必須アミノ酸（EAA）、1mMのL-グルタミン、0.4mMのピルビン酸ナトリウム、および10％を補充したアールの平衡塩類溶液（EBSS）からなる胚培養培地中に注入した胚を3回洗浄FBS。 </li><li>これらは外科的に（ステップ5.1を参照）同期化されたレシピエント雌NZWウサギの卵管に移される前に、1〜2時間、空気中のCO 2 5％で38.5℃で胚を培養する。代わりに、彼らはin vitroでの検証やアッセイのために使用される前に、彼らは胚盤胞期に到達するまでの文化胚を。 </li></ol> 5。胚移植<ol><li>約計量、良好な健康状態にある5月12日カ月の雌のNZWウサギを選択します。レシピエント動物として4.0〜5.0キロ。ゴナドトロピン（ステップ2.2参照）ドナー動物（複数可）にhCG注射のそれと同じ時点で受信者にホルモン（GnRH）注射は筋肉内（IM、50 MCG / mlの、0.3ミリリットル/動物）を放出管理。 </李&gt; <li>マイクロインジェクションが完了した後、胚移植（GnRH投与後、通常は16〜24時間）の受信者のウサギを準備します。 10〜40 mg / kgのケタミン（IM）をウサギに麻酔および/または吸入によってイソフルラン（2-4％）を気化。無菌眼軟膏を適用することにより、過度の乾燥からウサギの目を保護します。それはつまり 、完全に意識不明になるまで動物を観察します。フットパッドは、十分な麻酔の表示であるペダル反射の欠如を確認するために使用されている絞り、ペダル反射神経に応答しません。 </li><li>ウサギの腹部を剃り、消毒スクラブで洗浄、消毒液が続き、滅菌ガーゼスポンジで剃毛面積を拭く。 </li><li>無菌条件下で手術を行う手術を通じて受信者のウサギごとに約15分のバイタルサインを記録する。 </li><li>胚の利用可能な数に応じて、1レシピエント動物へ10月25日の胚を転送します。 </li><li>の終了時外科的手法は、コーティングされた吸収性縫合糸で筋肉層を閉じます。吸収性縫合糸を使用した表皮下縫合のいずれかで、またはnonabsorable縫合糸（ 例えば単繊維ナイロンまたは類似）を使用して簡単な中断皮膚縫合糸で皮膚を縫合。 </li><li>動物を暖かく保つとその胸骨横臥が達成されるまで、それを監視する。 </li><li>毎日動物を監視します。動物の世話をするために獣医師の指示に従ってください。痛みを和らげる、および/または獣医によって必要と判断した場合、発熱、毎日POST操作を減らすために、メロキシカム（SC 1.0 mg / kgの）を管理。 </li><li>約10〜14日後に動作時nonabsorable皮膚縫合糸を取り除く。 </li></ol> 6。 ZFN誘導される遺伝子破壊の検出<ol><li> in vitroでの検証のために、in vitroで培養した胚に遺伝子型判定を行う。 5μlのNP40溶液（1％NP40プラス1 UG / mlののTaqバッファー中のプロテイナーゼKで桑実胚/胚盤胞の段階に開発された溶解、個々の胚）55℃で0.5〜1時間、および95℃で10分間</li><li>子孫の遺伝子型判定のために、新生児のキットから耳の皮膚サンプルを収集したゲノムDNAを抽出し、PCR配列決定のためのテンプレートとしてそれらを使用しています。出血を止めると不快感を軽減するために収集した後にサンプリング領域にクイック·ストップを適用します。 </li><li> LA-TaqおよびZFN標的部位の上流に位置する（5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;）及び（5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC -3下流&#39;）されるPCRプライマー対を用いてPCRのための鋳型として工程6.2または6.3からの溶菌を使用。 </li><li> PCR産物を精製し、配列決定プライマー（5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;）でそれらを配列。 </li><li>標的部位周辺のシーケンス図中の二重線を探すことにより、変異体のサンプルを特定します。 「陽性」として、二重曲線を有するものにラベルを付けます。 </li><li> 、TAクローニングベクターに「正」のPCR産物をクローン10から20個のクローンをピックアップし、シーケンスの挿入、およびTを中心に変異を確認argetingサイト。 </li></ol>

<ol>
	<li>Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III:+understanding+an+emerging+cardiovascular+risk+factor.">Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor.</a> Clinical Science. 114, 611-624 (2008).</li><li>Pollin, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+null+mutation+in+human+APOC3+confers+a+favorable+plasma+lipid+profile+and+apparent+cardioprotection.">A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection.</a> Science. 322, 1702-1705 (2008).</li><li>Ginsberg, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+B+metabolism+in+subjects+with+deficiency+of+apolipoproteins+CIII+and+AI.+Evidence+that+apolipoprotein+CIII+inhibits+catabolism+of+triglyceride-rich+lipoproteins+by+lipoprotein+lipase+in+vivo.">Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo.</a> The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).</li><li>Cohn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+apoC-III+production+is+a+characteristic+feature+of+patients+with+hypertriglyceridemia.">Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia.</a> Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).</li><li>Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+production+of+plasma+and+very-low-density+lipoprotein+(VLDL)+apolipoprotein+C-III+is+strongly+related+to+the+concentration+and+level+of+production+of+VLDL+triglyceride+in+male+subjects+with+different+body+weights+and+levels+of+insulin+sensitivity.">Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).</li><li>Maeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+apolipoprotein+C-III+gene+in+mice+results+in+hypotriglyceridemia+and+protection+from+postprandial+hypertriglyceridemia.">Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).</li><li>Jong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+C-III+deficiency+accelerates+triglyceride+hydrolysis+by+lipoprotein+lipase+in+wild-type+and+apoE+knockout+mice.">Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice.</a> Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).</li><li>James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+in+transgenic+mice.">Cardiac physiology in transgenic mice.</a> Circ. Res. 82, 407-415 (1998).</li><li>Duranthon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+emerging+role+of+rabbit+as+human+disease+model+and+the+instrumental+role+of+novel+transgenic+tools.">On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools.</a> Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).</li><li>Fan, J., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rabbits+as+therapeutic+protein+bioreactors+and+human+disease+models.">Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models.</a> Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).</li><li>Shiomi, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Watanabe+heritable+hyperlipidemic+(WHHL)+rabbit,+its+characteristics+and+history+of+development:+a+tribute+to+the+late+Dr.+Yoshio+Watanabe.">The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe.</a> Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).</li><li>Morehouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CETP+activity+by+torcetrapib+reduces+susceptibility+to+diet-induced+atherosclerosis+in+New+Zealand+White+rabbits.">Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits.</a> Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).</li><li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li><li>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+editing+of+bacterial+genomes+using+CRISPR-Cas+systems.">RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.</a> Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).</li><li>Petersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+'molecular+scissors'+for+transgenic+farm+animal+production.">Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PPARgamma+mono-allelic+knockout+pigs+via+zinc-finger+nucleases+and+nuclear+transfer+cloning.">Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning.</a> Cell Research. 21, 979-982 (1038).</li><li>Flisikowska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+immunoglobulin+gene+disruption+and+targeted+replacement+in+rabbit+using+zinc+finger+nucleases.">Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases.</a> PLoS ONE. 6, e21045 (2011).</li><li>Foley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+zebrafish+using+customized+zinc-finger+nucleases.">Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.</a> Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).</li><li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knockout+rats+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+(X-SCID)+using+zinc-finger+nucleases.">Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases.</a> PLoS ONE. 5, e8870 (2010).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertriglyceridemia+and+delayed+clearance+of+fat+load+in+transgenic+rabbits+expressing+human+apolipoprotein+CIII.">Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII.</a> Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).</li><li>Hauschild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+a+biallelic+knockout+in+pigs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本研究では、5つのアポCIII KOウサギをZFN技術を用いて生成した。以前のGTTウサギの生産の唯一の報告書はまた、ZFN技術18を使用していました。本研究では、ZFNを効果的にウサギの遺伝子を標的にすることが有用であることを確認した。 本研究では、ウサギの前のZFNレポート（30.8％、52分の16）18に匹敵する、それらが報告された遺伝子組換え率（正キット/合計生まれ）is23.8％（5月21日）、ゼブラフィッシュ19、マウス20、21匹のラットおよびブタ17を含む他の動物種において、ZFNを用いた。この速度は、実際には、通常、5〜20％の範囲に多くの従来のトランスジェニックウサギの生産試験のレートよりも高い。例えば、従来のDNAのマイクロインジェクションを介した製品アポCIIIトランスジェニックウサギに努め、鼎ら （5.6％）22生まれの54匹のうち3つの肯定的な創業者を得た。 これまでの知見と一致して、ターゲットのサイトでの変異は、（5 KOのウサギで1から21までの範囲）の塩基数が異なるから欠失または挿入を含む、可変である。創始者動物の特定の配列情報に基づいて、少なくとも4つのことが予想される（ すなわち 。Δ1、+1、+1、またはΔ20変異を含有するもの）はアポCIIIの機能喪失を有するであろう。この変異が唯一の原因の7アミノ酸の喪失ではなく、読み枠シフトすることが予測されるなどの動物、R-16Δ21では、機能の損失が表示されない場合があります。最終的に、表現型アッセイは、これらの創始動物が本当にアポCIII機能の喪失を表示するかどうかを決定するために必要である。 本研究で生成された5 KOウサギはいずれも二対立遺伝子の修正が含まれていない。興味深いことに、これはまた、以前のZFNウサギのレポートの場合である。これとは対照的に、ZFNはα1、3 - ガラクトシルをターゲットとした場合は、豚に適用された細胞は、単一の対立遺伝子を標的化頻度は、突然変異の約3分の1は23ノックアウト対立遺伝子、シングルステップの作成 ​​を、7から46までパーセントの範囲であった。 TALENはブタ線維芽細胞に適用したときにこれと一致して、対立遺伝子改変は、合計14個の陽性クローンの約15〜40％に認められた。なお、本研究では二対立遺伝子のKOウサギを生成する失敗がターゲットとヌクレアーゼベースの遺伝子のような能力のための種差（ すなわちウサギ対豚）を指示する可能性がある。なお、このプロジェクトで生成KOウサギの数が比較的少ないため、これは単にであることがより可能性が高い。我々は、ZFNは、ZFNベースのGTTウサギ生産の別の潜在的な利点として考慮されるべきであるウサギにbialleic突然変異を発生させることができると信じています。さらなる実験は、ウサギにおけるZFNのような能力を確認するために必要とされる。 結論として、本研究では実証するZアプローチを対象とした、FNベースの遺伝子がノックアウトウサギを生産するのに効果的である。特に、我々は、23.8％の満足ジェニック率は5アポCIIIのKOウサギを生成しました。これらの動物は、対応するマウスモデルよりも、ヒトにおける脂質代謝に対するこのタンパク質の役割についてのより意味のある情報を提供すると考えられている。我々は、ZFNベースの遺伝子ターゲティング、ならびにTALENやRGENなど他のヌクレアーゼベースの技術を予​​測、nonmurine動物で​​有意に様々なヒトの病気を研究するための新しい動物モデルの開発を促進します。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> 図1。 ZFN技術を用いてノックアウトウサギの産生のチャートを流す 。 ZFN技術を使用してのKOウサギの生産は、目的の遺伝子の選択から始まります。配列情報が提供され、ZFNセットが設計されている首題社内での検証に基づく酵母ected。チェックポイント（CP）1（CP-1）では、社内検証（内部陽性対照の50％以上）を通過したもののみセットが選択のためにユーザに提供される。まだセットはCP-1に合格しない場合は、追加の配列は、効果的なZFNセットを設計するために必要とされ得る。 in vitroでの胚の検証は、選択したZFNセットが選択したサイト（CP-2）に突然変異を誘発することができることを確認するために続いている。それは（ インビトロ胚で&gt; = 10％の突然変異率）CP-2に合格した場合、ZFNセット（S）がのみ使用されます。 CP-2での失敗は、ZFNセットの再設計が必要になります。胚ドナーが準備され、前核期胚を検証ZFNセットをマイクロインジェクションされます。これらのマイクロインジェクションした胚は、同期化された胚の受信者に転送されます。 1ヶ月の妊娠期間の後、新生児は（CP-3）遺伝子型を決定します。新生児のいずれも陽性でなかった場合、追加のマイクロインジェクションが行われる。それは、nを仮定し、CP-2に、プロジェクトの開始から2〜3ヶ月かかりますプロセス中のO障害。それは、CP-3へのCP-2からさらに2〜3ヶ月かかります。従って、ZFN技術を使用して4-6ヶ月の時間枠内でノックアウトウサギを生成することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> 図2。 ZFNデザイン 。三ZFNは（セット1、2、および3）を設定するエキソン1またはウサギアポCIIIのエクソン2（A）上の異なる配列を標的とするように設計した。すべての3つのセットは、ZFN活性を決定するために、酵母MEL-1レポーターアッセイに供した。製造業者のプロトコールに従って、製造業者の内部陽性対照のそれの&gt; 50％の活性を示すのZFNは、 インビトロおよびインビボのゲノム編集のための実験において有用であるとみなされる。ZFN活動は、したがって、1本研究では、選択した設定、セット1のための224.2パーセント、セット2のための196.9パーセントとセット3（B）のための177.8パーセントだった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> ZFNの図3。胚の体外検証 。セット1のmRNA（5μgの個/ ml）を、35前核期ウサギ胚（A）の細胞質にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクション治療た（n = 31）なしでフラッシュした胚を対照群として使用した。 BLの展開率は、対照群で77.4％であった。顕微注入群では、BL率は51.4％だった。 PCR配列を受け16 BLのうち、8（50％）が陽性と確認された、セット1を示すことはタージェで突然変異を誘発するための効果的なZFNセットですティンサイト（B、apoc3wt.seq、ブラックボックス化）ウサギにおけるアポCIIIの。突然変異を含有するが、BLとBL＃のAPOC-3、4、5、7、11、13、15、および17である（B、赤下線）。残りのBLは（＃のAPOC-2、6、9、10、12、14および16）は、標的部位での変異を持っていません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> 図4。アポCIIIのKOウサギの生産 。 ZFNセット1のmRNAをマイクロインジェクションは百四〇から五胚は7偽妊娠レシピエントウサギ（A）に移した。 ZFNマイクロインジェクションすることなく新たにフラッシュした胚た（n = 75）（n = 6）は、対照群としてレシピエントに移した。実験群では、全期間キット/総胚として計算期間率は14である.5％（21/145）、速度は対照群では（22/75）29.3％であるのに対し、（A）。顕微注入群で生まれた21のキットのうち、5個（R1、R9、R11、R12およびR16）を、PCR配列決定（B）後に陽性KOキットとして同定された。標的サイトのインデルは2つの挿入（R9とR11の両方のための1）と（それぞれΔ1、Δ20、R1、R12とR16のためのΔ21）3欠失を含む。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

アポリポタンパク質（アポ）C-III（アポCIII）は、肝臓および腸内で主に合成される小型のO-グリコシル化分泌タンパク質である。これは、プラズマカイロミクロン（CM）、超低密度リポタンパク質（VLDL）、高密度リポタンパク質（HDL）の表面上に存在する。アポCIII 1は、心血管疾患の危険因子として認識されている。アポCIIIの遺伝性欠損症の患者は、低い血漿トリグリセリド（TG）濃度の減少不顕性冠動脈アテローム性動脈硬化症、2,3を持っている。上昇した血漿アポCIIIレベルが、他方で、多くの場合、インスリン抵抗性、肥満症、および高トリグリセリド血症（HTG）4,5と相関する。 遺伝子ノックアウト（KO）は、遺伝子の機能を研究するための強力な手段である。ヒト変異集団での観察と一致して、マウスでのアポCIII遺伝子のノックアウトは、血漿TGの減少と食後のHTG 6からの保護につながった。アポCIIIのような積極的な役割が登場アポリポタンパク質E（アポE）に依存しないように、アポEおよびアポCIIIの両方の欠損したマウスとしても食後高脂血症7から保護されています。これらのアポCIII KOマウスモ​​デルは、ヒトにおけるアポCIIIの可能な機能に関する貴重な情報を提供してきたが、これはマウスのリポタンパク質の代謝の多くの局面において、ヒトのものとは異なることに留意されたい。例えば、マウスは、血漿コレステリルエステル転送タンパク質（CETP）、VLDL、LDLの輸送に関与する主要な酵素、およびHDL 8を欠く。したがって、さらにin vivoでアポCIIIの生理学的役割を理解するために適切な動物モデルを開発する必要がある。 ウサギは、古典的なモデル動物種9月11日である。これは、短い妊娠期間（30〜31日）、大型産子数（4-12/litter）を有し、屋内の施設で、便利に収納することができる。マウスと比較して、ウサギは、ヒト10に系統発生的に近い。重要なのは、HU様男はしかし、マウスとは違って、ウサギは、LDLを多く含む哺乳類であり、CETP 10,12の実質的なレベルを持っている。さらに、彼らは人間のアテローム性動脈硬化症13に見られるものと類似の病変を有するコレステロールを多く含む食事誘発性アテローム性動脈硬化症の影響を受けやすい。これらの理由から、我々は、アポCIII KOウサギ、ヒトにおける脂質代謝およびアテローム性動脈硬化症にApoCIIIplayの役割を調査するために、それらのマウス対応物よりも良好なモデルとして役立つことができるという仮説を立てた。 遺伝子の標的遺伝子組換え（GTT）ウサギの生産が課題となっている。これは、胚性幹細胞（ESC）を送信する生殖細胞系の欠如、およびウサギにおける体細胞核移植（SCNT）の非常に低い効率の主な原因である。と体細胞が正常ブタ、ヒツジ、牛ではなく、ウサギなどの生殖細胞系列の送信のESCを欠く種でノックアウト動物を作製するために適用されているのに対し、ESCは、GTTマウスを生成するための主要なツールです。最近、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、トランscriptionアクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）14、およびRNAのガイド付きエンドヌクレアーゼ（RGEN）15は、ゲノム編集のための強力な手段を浮上した。その「分子ハサミ」と呼ばれるこれらのヌクレアーゼは、標的遺伝子の機能的なKOにつながるか、ゲノム中の特定の遺伝子座のDNA配列を統合するために使用することができ、ゲノム中の二本鎖切断（DSB）を生成する際に効率的である種16の数。 2011年には、ZFN技術を適応させる最初のうち、我々はこのアプローチを経由してペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）のKOブタの細胞を生成して成功して体細胞17のためにこれらの細胞を使用した後、PPARγのKO豚を生成した。同年、またZFNを使用して効率的な免疫グロブリン遺伝子破壊及びウサギにおける標的交換は18を報告しました。 PCR配列決定によって確認されるように、本 ​​研究では、5つのアポCIII KOウサギをZFNセット1を用いて、生成された（ 図1を参照</strong&gt;。フローチャートでの場合）。これらの動物は、脂質代謝にアポCIIIの役割を研究するための新たなリソースです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

アポリポタンパク質（アポ）C-III（アポCIII）は、血漿カイロミクロン（CM）、超低密度リポタンパク質（VLDL）、高密度リポタンパク質（HDL）の表面上に存在する。これは、心血管疾患（CVD）のためのプラズマアポCIIIのconstitutea危険因子の高いレベルが認められている。上昇した血漿アポCIIIレベルは、多くの場合、インスリン抵抗性、肥満症、および高トリグリセリド血症と相関する。 ApoCIIIin脂質代謝およびCVDの役割に関する貴重な知識は、アポCIIIノックアウト（KO）マウスを含むトランスジェニックマウスモデルから得られたが、これはマウスにおけるリポタンパク質の代謝の多くの局面において、ヒトのものとは異なることに留意されたい。これは、上昇した血漿アポCIIIが直接、アテローム発生であるかどうか、今まで知られていない。私たちは、ウサギは人間の脂質代謝およびアテローム性動脈硬化症を研究reasonablemodelforとしての役割を果たすことができるという仮説に基づいて、本研究でアポCIIIのKOウサギの開発に取り組みました。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）セットターゲットウサギアプoCIIIgene前胚のマイクロインジェクションするためのin vitroの検証を行った。 mRNAは、35ウサギ前核期胚の細胞質に注入し、胚盤胞状態に突然変異率を評価した。アッセイした16個の胚盤胞から、標的部位で十分な50％の突然変異率（8/16）in vivo実験のために1セットの使用を支持するものであった。次に、我々はセット1 mRNAと145胚をマイクロインジェクションして、7受信者のウサギにこれらの胚を移す。 30日の妊娠の後、21のキットはその5から、生まれたPCR配列アッセイ後のアポCIIIのKOウサギであることが確認された。 KO動物率は（＃KOキット/総生まれ）23.8％であった。全体的な生産効率（5 kits/145胚転写）3.4％である。本研究では、ZFNはKOウサギを製造するための非常に効率的な方法であることを実証した。これらのアポCIIIのKOウサギは脂質代謝にアポCIIIの役割を研究するための新たなリソースです。

ZFN対のインビトロで検証中 十六ZFN対は、最初に設計されています。セット1の標的破壊シーケンスはウサギアポCIII（ 図2A）のエクソン2に位置しています。三組（セット1、2、3、 図2A）を選択し、ZFN活性（ 図2B）を決定するために、酵母MEL-1レポーターアッセイに供した。 1セット2（196.9パーセント）とセット3（177.8パーセント）よりも高いと選択閾値（内部陽性対照すなわち 50％）よりもはるかに高い224.2パーセントのZFNスコアを持って設定します。したがってセット1は、 インビトロ検証実験のために選択した。 特定のセットは、内部検証の基準に基づいて、in vitroでの胚の検証に合格するために10パーセント以上の胚における陽性率になる必 ​​要があります。セット1のmRNA（5μg/ mlのは）35前核期のウサギの胚（ 図3Aの&lt;細胞質に微量注入した/強い&gt;）。マイクロインジェクション治療た（n = 31）なしでフラッシュした胚を対照群として使用した。マイクロインジェクト基の八胚が16を配列決定したそのうち、D5にBLステージに開発され、8つの（BL表示＃APOC-3、4、5、7、11、13、15、17、 図3B、赤色を下線）が表示突然変異さ標的サイトの配列（ブラックボックス化、 図2B、一番上の行、apoC3wt.seq）。顕微注入群（51.4％）のBL率がわずかに微量注入した胚の発育能力障害を示し、対照群（77.4％）よりも低い。微量注入された胚の正突然変異率は選択閾値（ すなわち 10％）よりもはるかに高い50.0％（8/16）である。これらの結果は、セット1は、ウサギアポCIIIの標的部位に突然変異を誘発するのに有効なZFNセットであることを明らかにした。そのためセット1は、アポCIIIのKOウサギのin vivo生産のために選択した。 アポCIIIのKOウサギの生産 mRNAはOF ZFNセット1をウサギ前核期胚の細胞質に顕微注入し、7偽妊娠レシピエントウサギ（ 図4A）に145マイクロインジェクションした胚を移した。 ZFNマイクロインジェクションすることなく新たにフラッシュした胚た（n = 75）（n = 6）は、対照群としてレシピエントに移した。妊娠30日後、21キットはマイクロインジェクションし、グループで生まれた。 PCR配列は、正のKOキット（ 図4B）と5（APOC3-R1、R9、R11、R12とR16）を同定した。率は対照群では（22/75）29.3％であるのに対し、総用語キット/胚の合計として計算用語率は、14.5％（21/145）である。総KOキット/総項として算出KO率は23.8％（5月21日）です。一つのKOキット（アポC-R 16）は5日、分娩後（20.0％、1月5日）に死亡した。標的サイトindelsat 2挿入および3欠失が含まれる、彼らは、ウサギ、それぞれ＃R1、R9、R11、R12、及びR16、（ 図4B）のために、、1、1、Δ20およびΔ21をareΔ1。 バイ以前に説明したように17 oinformatics分析は、1シーケンスを設定するには、7個以下のミスマッチを、オフターゲットの可能性ZFNを同定した。一方のみが染色体14上に位置することが可能とオフターゲット部位の予測は、7 bpsのミスマッチにより同定した。 PCRアッセイは、創始動物のいずれにもオフターゲットイベントを検出していません。

Watch this Scientific Journal Video about Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases at JoVE.com

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

ツールを標的遺伝子における最近の開発は、ノックアウトの製造（KO）ウサギができる。本研究では、我々は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を使用して、5アポリポタンパク質（アポ）C-III KOウサギを生成しました。この作品は、ZFNはKOウサギを製造するための非常に効率的な方法であることを実証した。

ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、アポリポタンパク質C-IIIのノックアウトウサギの生産

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K ビュー.  University of Michigan Medical Center. ツールを標的遺伝子における最近の開発は、ノックアウトの製造（KO）ウサギができる。本研究では、我々は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を使用して、5アポリポタンパク質（アポ）C-III KOウサギを生成しました。この作品は、ZFNはKOウサギを製造するための非常に効率的な方法であることを実証した。 