Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652 und HL068878 zu JBZ), der American Heart Association (National Scientist Entwicklung 0835237N JZ). YEC wird finanziell ausgestattet Frederick Huetwell Professor für Herz-Kreislauf-Medizin an der University of Michigan Medical Center (UMMC) unterstützt. Diese Arbeit genutzt von Center unterstützt Core Services für Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) bei UMMC.

Alle Tier Wartung, Pflege und Verwendung Verfahren wurden auf der Nutzung und Pflege der Tiere der Universität von Michigan überprüft und von der Universität Committee genehmigt. 1. ZFN Konstruktion und Auswahl <ol><li> Versorgung der genomischen Sequenzinformation des Gens von Interesse (z. B. Kaninchen ApoCIII) an den Hersteller. Wählen ZFN (e) für die Experimente auf der Grundlage der ZFN-Scores. </li></ol> 2. Kaninchenembryonen <ol><li> Superovulation sexuell gereift (6-18 Monate) New Zealand White (NZW) weiblichen Kaninchen durch subkutane (sc) Injektion von FSH zweimal / Tag mit einer Dosierung von 3 mg in den ersten beiden Injektionen, 5 mg für die nächsten zwei Injektionen und 6 mg für die letzten zwei Injektionen. </li><li> Verwalten einer einzelnen intravenösen (iv) Injektion von 200 IE hCG bei 72 Stunden nach der ersten Injektion FSH, um den Eisprung auslösen. Kamerad superovulierten die Frauen mit einem männlichen Kaninchen sofort nach der hCG-Injektion. </li><li> Euthanize die superovulierten Spender Kaninchen mit Natrium-Pentobarbital (150 mg / kg, iv) bei 16-18 Stunden nach der Befruchtung (psi). </li><li> Wiederherstellen der Eileiter Ampullen durch eine sorgfältige Erhebung der gesamten Eileiter und Eierstöcke Struktur. </li><li> Spülen jedes Eileiters mit 10 ml Medium der Manipulation HEPES gepuffert TCM 199, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, durch Einspritzen des Mediums aus dem Uterus Ende des Eileiters. Sammeln des Mediums gespült am Eierstock-Endöffnung des Eileiters in eine Petrischale. </li><li> Beachten und identifizieren erholt Embryonen im Medium gespült, waschen Sie die Embryonen dreimal in der Manipulation Medium, halten sie in der Manipulation Medium bei 38,5 ° C in der Luft, und unter einem Stereomikroskop beobachten sie für das Auftreten der Befruchtung. Bereiten Sie für die Mikroinjektion auf Vorkernstadium Embryonen 19-21 h psi </li></ol> 3. Vorbereitung der ZFN-mRNA <ol><li> Reinige die resultierende mRNA vor der Resuspension in RNase-freiem 0,1 X TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, 0,1 mM EDTA). Messung der Konzentration und speichern die mRNA bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie die mRNAs ZFN Paar (4-10 ng / ul in 1 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA bei pH 7,5), aliquoten kodiert, in 10 ul Fläschchen. Bewahren Sie sie bei -80 º C bis zur Verwendung. Vor der Mikroinjektion, tauen die RNA Durchstechflasche (n), und halten Sie es auf Eis. </li></ol> 4. Embryo-Mikroinjektion <ol><li> Bereiten Sie die Mikroinjektion Plattform, indem Sie einen 5 ul Tropfen Manipulation Medium auf einer gut 1-Kammer Folie, die das Medienkammer entfernt hat. Decken Sie die mittlere Tropfen mit Mineralöl und auf den beheizten Mikroskoptisch. </li><li> Legen Sie mit der Pipette (120 Mikrometer Durchmesser) in die Halterung Arm der Mikromanipulator und positionieren Sie es in den Tropfen der Manipulation Medium. </li><li> Fabrizieren Injektion Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Borosilikatglas Kapillaren in einer Mikropipette Puller Gerät. Laden der mRNA in die Injektionspipette eingespritzt werden. </li><li>Schalten Sie die Druckluftversorgung, die mit einem Mikroinjektor verbunden ist. </li><li> Zeigen Injektionspipette in die Injektionshalter, legte es auf den Mikromanipulator und die Position in die Manipulation Tropfen Medium. </li><li> Einrichten der Mikroinjektor, mit den folgenden vorgeschlagenen Parameter: holdP = 2 psi, in JP = 20 psi, 60 psi = ClearP, Injtime = 1 sec, die in einem Injektionsvolumen von 1-5 pl führt. </li><li> Öffnen Sie die Spitze der Injektionspipette durch leichtes Klopfen gegen die Haltepipette. </li><li> Transfer-Embryonen (30-50) an die Mikromanipulation Abfall auf der Plattform. Verwenden Sie die Haltepipette, um einen Embryo zu erfassen und richten Sie die Injektionsnadel, Embryo und die Haltepipette entlang der x-Achse. </li><li> Unter 400-facher Vergrößerung, vorab die Injektionspipette durch den Embryo. Seien Sie vorsichtig, um den Kern zu vermeiden. Sobald die Plasmamembran durchstoßen, drücken Fußpedal zu injizieren. Nach der Injektion, ziehen Sie die Nadel, lassen Sie den Embryo. Wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden emEmbryonen. </li><li> Dreimal waschen injizierten Embryonen in Embryokulturmedium, das aus Earle-Balanced Salt Solution (EBSS) mit nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), essentiellen Aminosäuren (EAA), 1 mM L-Glutamin, 0,4 mM Natriumpyruvat und 10% ergänzt aus FBS. </li><li> Embryonen Inkubation bei 38,5 ° C in 5% CO 2 in Luft für 1-2 Stunden, bevor sie chirurgisch in die Eileiter eines weiblichen Empfänger synchronisiert NZW-Kaninchen (siehe Schritt 5.1) übertragen. Alternativ können die Embryonen Kultur, bis sie Blastozystenstadium erreichen, bevor sie für die in vitro Freischaltung oder Tests verwendet. </li></ol> 5. Embryo Transfer <ol><li> Wählen Sie einen weiblichen NZW Kaninchen 5-12 Monate alt, bei guter Gesundheit, mit einem Gewicht von ca.. 4,0 bis 5,0 kg als Empfängertier. Verwalten Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH)-Injektion intramuskulär (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / Tier) an den Empfänger in der gleichen Zeitpunkt mit der hCG-Injektion zu dem Spendertier (s) (siehe Schritt 2.2). </li&gt; <li> Nach Abschluss der Mikroinjektion, bereiten Sie die Empfänger-Kaninchen für Embryo-Transfer (in der Regel 16-24 Stunden nach der GnRH-Injektion). Anesthetize das Kaninchen mit 10-40 mg / kg Ketamin (im), und / oder verdampft Isofluran (2-4%) durch Einatmen. Augen des Kaninchens Schutz vor Austrocknung durch die Anwendung einer sterilen ophthalmischen Salbe. Beobachten Sie das Tier, bis es vollständig unbewusst, dh. nicht in die Pedale treten Reflexe zu reagieren; drückte der Fuß-Pad verwendet wird, um die fehlende Pedal Reflex, der ein Hinweis auf eine adäquate Anästhesie ist zu überprüfen. </li><li> Rasur Bauch des Kaninchens, waschen mit antiseptischen Peeling, gefolgt von einer antiseptischen Lösung, und wischen Sie den rasierten Bereich mit steriler Gaze Schwämme. </li><li> Führen Operation unter sterilen Bedingungen, notieren Lebenszeichen des Empfängers Kaninchen etwa alle 15 Minuten während der Operation. </li><li> Übertragen 10-25 Embryonen einem Empfängertier, abhängig von der verfügbaren Anzahl von Embryonen. </li><li> Am Ende derchirurgische Verfahren, schließen Sie die Muskelschicht mit beschichteten resorbierbares Nahtmaterial. Naht der Haut entweder mit einer subkutanen Naht mit resorbierbarem Nahtmaterial oder mit einfachen unterbrochen Hautnähte mit Naht nonabsorable (zB Nylon Monofilament oder ähnliches). </li><li> Halten Sie das Tier warm und zu überwachen, bis seine Brustlage erreicht ist. </li><li> Überwachen Sie die Tier täglich. Folgen Sie den Anweisungen des Tierarztes für die Tierpflege. Verwalten Meloxicam (sc 1,0 mg / kg), Schmerzen zu lindern und / oder durch den Tierarzt notwendig bestimmt Fieber senken täglich nach der Operation. </li><li> Entfernen nonabsorable Hautnähte bei etwa 10-14 Tage nach der Operation. </li></ol> 6. Nachweis von ZFN Induced Gene Störungen <ol><li> Für die in vitro-Validierung, führen Genotypisierung auf den in vitro kultivierten Embryonen. Lyse einzelnen Embryonen zu Morula / Blastozysten Stufen Proteinase K in Taq-Puffer entwickelt in 5 ul NP40-Lösung (1% NP40 und 1 ug / ml) Für 0,5-1 Std. bei 55 ° C und 10 min bei 95 ° C. </li><li> Für die Genotypisierung der Nachkommen, sammeln Ohr Hautproben von Neugeborenen-Kits, genomische DNA zu extrahieren, und verwenden Sie sie als Vorlagen für die PCR-Sequenzierung. Bewerben Kwik-Stopp, um den Stichprobenraum nach der Sammlung die Blutung zu stoppen und reduzieren Unbehagen. </li><li> Verwenden der Lyse von Schritt 6.2 oder 6.3 als Template für PCR unter Verwendung von LA-Taq-und PCR-Primerpaar, das stromaufwärts angeordnet sind (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) und stromabwärts (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) der Zielstelle ZFN . </li><li> PCR-Produkte zu reinigen und zu sequenzieren sie mit Sequenzierungsprimer (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;). </li><li> Identifizieren mutierten Proben durch die Suche nach Doppelkurve im Sequenzdiagramm um die Targeting-Website. Beschriften Sie die, die mit doppelten Kurven als &quot;positiv&quot;. </li><li> Klonen Sie die &quot;positive&quot; PCR-Produkte in die TA-Klonierungsvektor, nehmen Sie 10-20 Klone, Reihenfolge die Einsätze, und bestätigen Sie die Mutationen der ganzen targeting Ort. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In der vorliegenden Arbeit wurden fünf ApoCIII KO Kaninchen unter Verwendung des ZFN-Technologie erzeugt. Bisher der einzige Bericht der Produktion von GTT Kaninchen verwendet auch die ZFN-Technologie 18. Die vorliegende Arbeit bestätigt, dass ZFN ist nützlich, um Gene in Kaninchen effektiv Ziel. In der vorliegenden Studie, die transgene Rate (positive Sätze / Gesamt geboren) is23.8% (5/21), die vergleichbar mit der von der vorherigen Bericht ZFN in Kaninchen (30,8%, 16/52), 18, ​​und diejenigen, berichtet der Verwendung von ZFN in anderen Tierarten, darunter 19 Zebrafisch, Maus 20, 21 Ratten und Schweinen 17. Diese Rate ist in der Tat höher als die Preise von vielen herkömmlichen transgenen Kaninchen Produktionsstudien, die in der Regel im Bereich von 5-20% sinken. Zum Beispiel, in einer Bemühung, Produkt ApoCIII transgenen Kaninchen über konventionelle DNA-Mikroinjektion, Ding et al. Erhaltenen 3 positive Gründer von 54 Welpen geboren (5,6%) 22. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen, die Mutationen an den Targeting Websites variable, einschließlich Deletionen oder Insertionen, die aus unterschiedlichen Anzahl von Basen (im Bereich von 1 bis 21 in den fünf KO Kaninchen). Basierend auf der spezifischen Sequenz-Informationen der Gründertiere wird vorhergesagt, dass mindestens vier (dh. Diejenigen, die Δ1, +1, +1, oder Δ20 Mutationen) würde Funktionsverlust von ApoCIII haben. Tier R-16 mit Δ21 nicht funktionalen Verluste auf, da diese Mutation nur zum Verlust von sieben Aminosäuren vorhergesagt, aber nicht eine Leserahmenverschiebung. Letztlich sind Phänotyp Tests notwendig, um festzustellen, ob diese Gründertiere wirklich den Verlust von ApoCIII Funktionen anzuzeigen. Keine der fünf KO Kaninchen in der vorliegenden Studie erzeugten enthalten biallelische Modifikationen. Interessanterweise ist dies auch in der vorherigen ZFN Kaninchen Bericht der Fall ist. Im Gegensatz dazu, wenn ZFNs Targeting α1 ,3-Galaktosyltransferase wurden Schwein angewendetZellen, die Häufigkeit von Aktionen in einem bestimmten Allel 7-46% lag, mit rund einem Drittel der Mutationen, die Einzelschritt-biallelische 23 Knockouts. Im Einklang mit dieser, wenn TALEN wurde die Schweine Fibroblasten-Zellen aufgetragen, die biallelische Änderungen wurden in ca. 15-40% der gesamten positiven Klone 14 gefunden. Es ist möglich, dass die Nicht biallelische KO Kaninchen in der vorliegenden Studie zu erzeugen, kann eine Spezies Differenz (dh Kaninchen vs Schweine) für solche Kapazität von Nuklease-Gen-Targeting basierend anzuzeigen. Es ist jedoch wahrscheinlicher, dass dies einfach, da die Anzahl von KO Kaninchen in diesem Projekt erzeugt ist relativ klein. Wir glauben, dass ZFN ist in der Lage bialleic Mutationen in Kaninchen, die als ein weiterer Vorteil der ZFN basierend GTT Kaninchen Produktion berücksichtigt werden sollten. Weitere Experimente sind notwendig, um eine solche Kapazität von ZFN in Kaninchen zu bestätigen. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass ZFN Basis Gen-Targeting-Ansatz ist effektiv in der Herstellung von KO Kaninchen. Insbesondere haben wir einen fünf ApoCIII KO Kaninchen mit einem zufriedenstellenden transgenen Rate von 23,8%. Diese Tiere sind vermutlich mehr aussagekräftige Informationen über die Rolle dieses Proteins auf den Lipidstoffwechsel beim Menschen als die entsprechenden Maus-Modellen bieten. Wir sagen voraus, basierend ZFN-Gen-Targeting, sowie andere Nuklease basierte Technologien wie TALEN und RGEN, in nonmurine Tiere erheblich erleichtern die Entwicklung von neuen Tiermodellen für verschiedene menschliche Krankheiten zu studieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Flussdiagramm der Herstellung von Knockout-Kaninchen mit ZFN-Technologie. Herstellung von KO Kaninchen unter Verwendung ZFN Technik beginnt mit der Auswahl des Gens von Interesse. Die Sequenzinformation vorgesehen ist, ZFN-Sets entworfen und subjektiert Hefe-Basis in-house Validierung. Beim Check Point (CP) 1 (CP-1), werden nur die Sätze geführt, in-house Validierung (50% oder mehr der internen Positivkontrolle) für die Benutzer zur Auswahl angeboten werden. Wenn keine Sets passieren CP-1, können zusätzliche Sequenz für die Entwicklung wirksamer ZFN-Sets benötigt. Ein Embryo in vitro Validierung verfolgt, um sicherzustellen, dass die ausgewählten ZFN-Set kann Mutationen an ausgewählten Standorten (CP-2) zu induzieren. ZFN (e) wird nur verwendet, wenn es CP-2 geht (&gt; = 10% Mutationsraten in in-vitro-Embryonen). Ausfall bei CP-2 wird eine Neugestaltung der ZFN-Sets erfordern. Embryo Spender wird vorbereitet und Vorkernstadium Embryonen mit den validierten ZFN-Sets mikroinjizierten werden. Diese mikroinjizierten Embryonen synchronisiert Embryo Empfänger übertragen werden. Nach einem Monat Tragzeit, werden Neugeborene genotypisierende (CP-3). Falls keine der Neugeborenen positiv sind, werden zusätzliche Mikroinjektion durchgeführt werden. Es dauert 2-3 Monate nach Beginn des Projektes an CP-2, unter der Annahme no Ausfall während des Prozesses. Es dauert weitere 2-3 Monate von CP-CP-2 bis 3. Daher ist es möglich, einen KO-Kaninchen in einem Zeitrahmen von 4 bis 6 Monate mit der ZFN-Technologie zu generieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> 2. ZFN-Design. ZFN drei Sätze (Satz 1, 2 und 3) wurden auf unterschiedliche Sequenzen auf Exon 1 und Exon 2 von Kaninchen ApoCIII (A) ausgebildet ist. Alle drei Sätze wurden in der Hefe MEL-1-Reporter-Assay, die ZFN-Aktivitäten zu bestimmen. Nach den Protokollen des Herstellers sind ZFNs, die&gt; 50% der Aktivitäten der von den Hersteller interne positive Kontrolle zeigen, wie nützlich für die in-vitro-und in vivo-Experimente Genom Bearbeitung angesehen.Die ZFN Aktivitäten waren 224,2% für Set 1, 196,9% für Set 2 und 177,8% für Set 3 (B), also Set 1 wurde in der vorliegenden Studie ausgewählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> Abbildung 3. In-vitro-Embryo Validierung von ZFN. Die mRNA (5 ug / ml) von Set 1 wurde in das Cytoplasma von 35 Stufe Kaninchenembryonen pronukleären (A) mikroinjiziert. Flutsch und Embryonen ohne Mikroinjektionsbehandlung (n = 31) wurden als Kontrollgruppe verwendet. Die BL Entwicklungsrate war 77,4% in der Kontrollgruppe. In der Mikroinjektion Gruppe war die BL Rate 51,4%. 16 BLs PCR-Sequenzierung unterzogen wurden 8 (50%) als positiv identifiziert, was anzeigt, Set 1 ist eine effektive ZFN Satz von Mutationen im targe induzierenting Website (B, apoc3wt.seq, schwarz-boxed) von ApoCIII bei Kaninchen. Die BLS, die Mutationen sind BL-apoc # 3, 4, 5, 7, 11, 13, 15 und 17 (B, rot unterstrichen). Die restlichen BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 und 16) haben keine Mutationen am Targeting-Website. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> 4. Die Produktion von ApoCIII KO Kaninchen. Hundert und fünfundvierzig Embryonen mit ZFN Set 1 mRNAs mikroinjizierten wurden 7 pseudo-schwangere Kaninchen Empfänger (A) übertragen. Frisch gespült Embryos (n = 75) ohne ZFN Mikroinjektion wurden an Empfänger (n = 6) als die Kontrollgruppe. Der Begriff Rate berechnet als Gesamtlaufsätze / Gesamt Embryonen in Experiment Gruppe 140,5% (21/145), während die Rate 29,3% (22/75) in der Kontrollgruppe (A). Von 21 Bausätze in den mikroinjizierten Gruppe, fünf (R1, R9, R11, R12 und R16) geboren wurden als positiv KO-Kits nach der PCR-Sequenzierung (B) identifiziert. Die indels am Targeting-Website enthalten zwei Insertionen (+1 sowohl für R9 und R11) und drei Deletionen (Δ1, Δ 20, Δ 21 für R1, R12 und R16, beziehungsweise). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) ist ein kleiner O-glycosylierten sekretorisches Protein, das hauptsächlich in der Leber und im Darm synthetisiert wird. Es liegt auf der Oberfläche der Plasma Chylomikron (CM), sehr niedrige Dichte Lipoprotein (VLDL) und Lipoproteinen hoher Dichte (HDL). ApoCIII wurde als Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen ein anerkannt. Patienten mit erblichen Mangel an ApoCIII niedrige Plasma-Triglycerid (TG)-Spiegel und reduzierte subklinischen koronaren Atherosklerose 2,3. Erhöhte Plasma-ApoCIII Ebene andererseits korreliert oft mit Insulinresistenz, Fettleibigkeit, Hypertriglyceridämie und (HTG) 4,5. Gen-Knockout (KO) ist ein wirksames Instrument, um die Funktion eines Gens zu untersuchen. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen in der menschlichen Mutanten-Populationen, Knockout des ApoCIII Gens in Mäusen führte zu einer Reduktion der Plasma-TG und Schutz vor postprandialen HTG 6. Solche positive Rolle der ApoCIII erschienenunabhängig von Apolipoprotein E (ApoE) zu sein, da Mäuse beiderlei ApoE und ApoCIII-Mangel auch postprandiale Hyperlipidämie 7 geschützt. Obwohl diese ApoCIII KO Mausmodelle wertvolle Informationen über die möglichen Funktionen von ApoCIII bei Menschen vorgesehen ist, wird darauf hingewiesen, dass der Metabolismus von Lipoprotein von Mäusen unterscheidet sich von der des Menschen in vielen Aspekten. Zum Beispiel fehlt Mausplasma Cholesterylester-Transferprotein (CETP), ein Hauptenzym bei der Beförderung von VLDL, LDL beteiligt ist, und HDL-8. Daher ist es notwendig, ein geeignetes Tiermodell zu entwickeln, um die physiologische Rolle von ApoCIII in vivo weiter zu verstehen. Das Kaninchen ist ein klassisches Modell Tierarten 11.09. Es hat eine kurze Tragezeit (30-31 Tage), große Wurfgröße (4-12/litter) und kann bequem in einer Indoor-Anlage untergebracht werden. Im Vergleich zu Mäusen, Kaninchen sind phylogenetisch näher an den Menschen 10. Wichtig ist, wie huMann, aber im Gegensatz zu Mäusen, Kaninchen sind LDL-reichen Säugetiere und haben erhebliche Mengen an CETP 10,12. Darüber hinaus sind sie anfällig für cholesterinreichen Diät-induzierten Atherosklerose mit ähnlich denen in menschlichen Arteriosklerose 13 ersichtlich Läsionen. Aus diesen Gründen ist die Hypothese aufgestellt, dass wir ApoCIII KO Kaninchen kann als ein besseres Modell als ihre Kollegen der Maus, um die Rollen ApoCIIIplay im Lipidstoffwechsel und Atherosklerose beim Menschen untersuchen zu dienen. Die Produktion von Gen gezielt transgene (GTT) Kaninchen war eine Herausforderung. Dies ist hauptsächlich auf das Fehlen von Keimbahn-Übertragung von embryonalen Stammzellen (ESC) und die extrem geringe Effizienz der Zellkerntransfer (SCNT) bei Kaninchen. ESC ist das wichtigste Werkzeug, um GTT Mäuse zu erzeugen, während und SCNT wurde erfolgreich angewendet, um KO Tiere zu erzeugen in der Art fehlt Keimbahn-Übertragung WSR, darunter Schweine, Schafe und Rinder, aber nicht Kaninchen. Kürzlich Zinc Finger Nuclease (ZFN), TranBezugs Activator-Like-Effektor Nuclease (TALEN) 14 und RNA Guided Endonuklease (RGEN) 15 erwies sich als wirkungsvolles Mittel für die Genom Bearbeitung. Diese Nukleasen, sogenannte &quot;molekulare Scheren&quot;, sind effizient bei der Erzeugung von Doppelstrangbrüchen (DSB) in das Genom, die mit einer funktionellen KO des Zielgens führen oder verwendet, um eine DNA-Sequenz an einer bestimmten Stelle im Genom zu integrieren eine Reihe von Arten, 16. Im Jahr 2011 unter den ersten, die Anpassung der ZFN-technik erwirtschafteten wir Peroxisomproliferator-aktivierter Rezeptor-gamma (PPAR) KO Schweinezellen über diese Vorgehensweise und erfolgreich generiert PPAR KO Schweine nach der Verwendung dieser Zellen für die SCNT 17. Im gleichen Jahr wurde eine effiziente Immunglobulin-Gen-Störung und gezielte Ersatz bei Kaninchen auch mit ZFN 18 berichtet. In der vorliegenden Studie wurden fünf ApoCIII KO Kaninchen erzeugt, wie durch PCR-Sequenzierung bestätigt, mit ZFN Set 1 (siehe Abbildung 1 </sTrong&gt;. für Flussdiagramm Abbildung). Diese Tiere sind neue Ressourcen, um die Rollen der ApoCIII in Lipidstoffwechsel zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) befindet sich auf der Oberfläche der Plasma Chylomikron (CM), sehr niedrige Dichte Lipoprotein (VLDL) und Lipoproteinen hoher Dichte (HDL). Es wurde erkannt, dass eine hohe Plasma ApoCIII constitutea Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Erhöhte Plasma ApoCIII Ebene korreliert oft mit Insulinresistenz, Adipositas und Hypertriglyzeridämie. Unschätzbare Kenntnisse über die Rolle der ApoCIIIin Lipidstoffwechsel und CVD wurde aus transgenen Mausmodellen einschließlich ApoCIII-Knockout (KO)-Mäusen erhalten wurden, jedoch wird darauf hingewiesen, dass der Metabolismus von Lipoprotein in Mäusen unterscheidet sich von der des Menschen in vielen Aspekten. Es ist bis jetzt noch nicht, ob erhöhte Plasma-ApoCIII direkt atherogenen bekannt. Wir arbeiteten an ApoCIII KO Kaninchen in der vorliegenden Studie auf der Grundlage der Hypothese, dass Kaninchen als reasonablemodelfor Studium der menschlichen Fettstoffwechsel und Atherosklerose dienen zu entwickeln. Zinkfinger-Nuclease (ZFN) Sätze Targeting Kaninchen ApoCIIIgene wurden in vitro Validierung vor der Embryo Mikroinjektion unterzogen. Die mRNA wurde in das Zytoplasma von 35 Kaninchen Vorkernstadium Embryonen injiziert, und bewertet die Mutationsraten im Blastozysten-Staat. Von sechzehn Blastozysten, die untersucht wurden, wurde ein zufriedenstell 50% Mutationsrate (8/16) an der Ziel Website erreicht, die den Einsatz von Set 1 für in vivo-Experimenten. Nächstes mikroinjizierten wir 145 Embryonen mit Set 1 mRNA und übertragen diese Embryonen zu 7 Empfänger Kaninchen. Nach 30 Tagen der Trächtigkeit wurden 21 Kits geboren, von denen fünf als ApoCIII KO Kaninchen nach PCR-Sequenzierung Tests bestätigt. Die KO Tier Rate (# KO-Kits / Gesamt geboren) war 23,8%. Die Gesamtproduktionsleistung liegt bei 3,4% (5 kits/145 Embryonen übertragen werden). In der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass ZFN ist eine hocheffiziente Methode, um KO Kaninchen zu produzieren. Diese ApoCIII KO Kaninchen sind neue Ressourcen, um die Rollen der ApoCIII in Lipidstoffwechsel zu untersuchen.

In-vitro-Validierung von ZFN Paare Sechzehn ZFN Paare wurden ursprünglich entwickelt. Die gezielte Zerstörung Sequenz von Set 1 an Exon 2 von Kaninchen ApoCIII (2A) befindet. Drei Paare (Set 1, 2 und 3, Fig. 2A) wurden ausgewählt und in den Hefe-MEL-1-Reportertest unterworfen, um die ZFN-Aktivitäten (Fig. 2B) zu bestimmen. Set 1 hat einen Score von 224,2 ZFN%, höher als die der Set 2 (196,9%) und Set 3 (177,8%) und deutlich höher als die Auswahlschwelle (dh 50% der internen Positivkontrolle). Daher wurde ein Set für in vitro-Validierungsexperimente ausgewählt. Ein bestimmter Satz braucht, um in einem positiven Raten in den Embryonen von 10% oder mehr führen, um den Embryo in vitro Validierung auf der Basis der internen Validierungskriterien bestehen. Die mRNA (5 ug / ml) von Set 1 wurde in das Cytoplasma von 35 Vorkernstadium Kaninchenembryonen (3A &lt;mikroinjiziert/ Strong&gt;). Flutsch und Embryonen ohne Mikroinjektionsbehandlung (n = 31) wurden als Kontrollgruppe verwendet. Achtzehn Embryonen von mikroinjizierten Gruppe BL auf der Bühne entwickelt, D5, von denen sechzehn wurden sequenziert, und acht (BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 3B, unterstrich rot) angezeigt mutiert Sequenzen am Targeting-Website (schwarz-boxed, 2B, obere Reihe, apoC3wt.seq). Die BL Rate des mikroinjizierten-Gruppe (51,4%) niedriger als die der Kontrollgruppe (77,4%), was leicht beeinträchtigt Entwicklungskompetenz von mikroinjizierten Embryonen. Die positive Mutationsrate der Embryonen mikroinjiziert 50,0% (8/16), viel höher als der Auswahlschwellenwert (dh 10%). Diese Ergebnisse zeigten, dass Set 1 ist eine effektive ZFN-Set, um Mutationen im Targeting Website von Kaninchen ApoCIII induzieren. Daher Set 1 wurde für in vivo-Produktion von ApoCIII KO Kaninchen gewählt. Die Produktion von ApoCIII KO Kaninchen Die mRNA of ZFN Set 1 wurde in das Zytoplasma Kaninchens Vorkernstadium Embryos mikroinjiziert, und über 145 mikroinjizierten Embryonen bis 7 pseudoschwangere Empfängerkaninchen (Fig. 4A). Frisch gespült Embryos (n = 75) ohne ZFN Mikroinjektion wurden an Empfänger (n = 6) als die Kontrollgruppe. Nach 30 Tagen der Trächtigkeit wurden 21 Sets in der mikroinjizierten Gruppe geboren. PCR-Sequenzierung identifiziert fünf (APOC3-R1, R9, R11, R12 und R16) als positiv KO-Kits (4B). Der Begriff Rate berechnet als Gesamtlaufsätze / Gesamt Embryonen 14,5% (21/145), während die Rate 29,3% (22/75) in der Kontrollgruppe. Die KO-Rate berechnet als Gesamt KO Sätze / Gesamtlaufzeit liegt bei 23,8% (5/21). Ein KO-Kit (apoC-R16) starb fünf Tage nach der Geburt (20,0%, 1/5). Die indelsat Targeting-Website enthalten zwei Insertionen und drei Deletionen, sie areΔ1, +1, +1, Δ20 und Δ21 für Kaninchen # R1, R9, R11, R12 und R16, jeweils (Fig. 4B). Bioinformatics Analyse wurde verwendet, um potentielle ZFN mit 7 oder weniger Fehlanpassungen zu 1-Sequenz zu identifizieren Off-Set-Ziele, wie zuvor 17 beschrieben. Nur eine vorausgesagt möglich Off-Target-Website, auf Chromosom 14 befindet, wurde mit sieben übereinstimm bps identifiziert. PCR-Test nachgewiesen keine Off-Target-Ereignisse in einem der Gründertiere.

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Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Neueste Entwicklungen in der Gen-Targeting-Tools macht die Produktion von Knockout (KO) Kaninchen möglich. In der vorliegenden Arbeit haben wir einen fünf Apolipoprotein (Apo) C-III KO Kaninchen mit Zink-Finger-Nukleasen (ZFN). Diese Arbeit zeigte, dass ZFN ist eine hocheffiziente Methode, um KO Kaninchen zu produzieren.

Die Produktion von Apolipoprotein C-III-Knockout Kaninchen mit Zink-Finger-Nukleasen

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K Aufrufe.  University of Michigan Medical Center.  Neueste Entwicklungen in der Gen-Targeting-Tools macht die Produktion von Knockout (KO) Kaninchen möglich. In der vorliegenden Arbeit haben wir einen fünf Apolipoprotein (Apo) C-III KO Kaninchen mit Zink-Finger-Nukleasen (ZFN). Diese Arbeit zeigte, dass ZFN ist eine hocheffiziente Methode, um KO Kaninchen zu produzieren. 