Diese Arbeit wird von der Rowland Junior Fellow-Programm unterstützt. Die Autoren möchten Dankbarkeit für die Wissenschaftler und Mitarbeiter des Rowland Institute der Harvard auszudrücken: Chris Stokes für seine Hilfe bei der Entwicklung der kundenspezifischen, computergestützte Druckregelung Setup, Diane Schaak, Ph.D. für ihren Beitrag für die biologische Probenhandhabung, Winfield Hill für die Entwicklung der elektrischen Einrichtung, Alavaro Sanchez, Ph.D. für den Zugang zum Durchflusszytometer, Scott Bevis, Kenny Rogers und Don Spencer für die Bearbeitung von mechanischen Komponenten für die Sanitär-Druck-Setup erforderlich Gewährung. Mikrofluidik-Meister wurden am Zentrum für Nanoscale Systems (ZNS) an der Harvard University hergestellt.

1. Zellpräparation <ol><li> Platte 1 × 10 5 Zellen / ml von metastatischen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 in einem Volumen von 10 ml pro Gewebekultur T75-Kolben in Leibovitz L-15-Medium, ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin. </li><li> Inkubieren MDA-MB-231-Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C bei 0% CO 2-Umgebung. </li><li> Ernten der Zellen für Experimente 2 Tage nach der Saat, indem man die Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA für 2 min und Inaktivierung der enzymatischen Aktivität von Trypsin durch Zugabe von 8 ml Wachstumsmedium. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 200 × g und Resuspendieren in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS, 1x, ohne Ca 2 + und Mg 2 +) zu einer Endkonzentration von 5 × 10 5 Zellen / ml. </li></ol> 2. Geräte Konstruktion und Herstellung HINWEIS: Die Maske, Masterform Erfindungen und dieMikrokanal umschließenden Verfahren sind in einem Reinraum durchgeführt, während die Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikro Gießverfahren auf einem normalen Labortisch durchgeführt werden kann. <ol><li> Entwerfen Sie ein Mikrofluidik-Gerät wie in Abbildung 1 veranschaulicht mit AutoCAD. Die Vorrichtung sollte aus einem Einlass mit mehreren Einspritzöffnungen, Grobfilter und zwei parallelen geraden rechtwinkligen Trägheitsfokussierungskanäle bestehen (L = 7 mm, W = 40 um und H = 70 um). Einzelnen geraden Kanal besteht aus 5 Elektroporation Kammern, die platziert werden 800 um auseinander (W C = 400 um) mit zwei über Löcher für Aluminiumelektroden. Zwei in Querrichtung benachbarten Elektroporation Kammern teilen die Bohrung für die negative Elektrode. Zwei gerade Kanäle gehen in einem Auslaß an dem stromabwärts gelegenen Bereich der Elektroporation. </li><li> Konvertieren Sie die CAD-Datei mit Mikrogefüge zu einer GDSII-Datei mit LinkCAD. Schreiben Sie die Mikro-Muster auf einem 5 &quot;x 5&quot; Photomaskenrohlingmit einem Laser-Maskenschreiber. Entwickeln Sie die Maske durch folgende Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Die Maske Entwicklungsprozess umfasst Fotolackentwicklung, Chrom Ätzen und Lackentfernen. Alternativ Mikromuster auf einem hochauflösenden Transparenz gedruckt (&gt; 20.000 dpi) kann von einem Dritten Hersteller gekauft werden und als Photomaske verwendet. Endgültige Mikromerkmale auf einer Photomaske sollte transparent, um die Polarität eines negativen Photoresist-Spiel. </li><li> Herstellung der Gussform des Gerätedesign mit Standardsoftlithographie-Techniken 23 mit einem negativen Photoresist gesponnen Mantel auf einem 4-Zoll-Silizium-Wafer bei 2.000 Umdrehungen pro Minute, um die endgültige Dicke von 70 um haben. </li><li> Vorbacken des Wafers mit Negativlack für 20 Minuten bei 95 ° C aufweist. </li><li> Kontaktieren Sie die Maske mit dem Wafer und setzen auf eine UV-Quelle (17,4 mJ / cm 2) für 80 Sekunden mit einem Mask Aligner. </li><li> Entwicklung des belichteten Wafers für 4 min in einer SU-8-Entwickler. </li><li> Messen Sie dieentwickelten Photolackdicke mit einem Profilometer Oberfläche. </li><li> Rigoros mischen Sie einen 10: 1-Verhältnis von Elastomer-Härter (Silikon-Elastomer-Kit) und gießen Sie die Mischung auf der Gussform zu PDMS Repliken zu generieren. Entgast Gießelastomer für 30 min und Aushärten der Gussform mit entgastem Elastomer in einem Ofen bei 70 ° C für 2 Stunden. </li><li> Ablösen geheilt PDMS-Nachbildung mit Mikrokanalmuster aus der Form und Stanzlöcher für Buchten, Steckdose und Elektrodeninsertionen mit einem Schraubstock. HINWEIS: Die normale Schneidendurchmesser des Stiftes Schraubstock sollte 0,76 mm, geeignet für fest an Ort und Stelle hält PEEK-Schlauch (Außendurchmesser von 1/32 &quot;) und Aluminium-Elektroden (OD von 0,029&quot;) sein. </li><li> Erstellen geschlossenen mikrofluidischen Kanälen durch Kleben PDMS Replikate auf einem Glasobjektträger in einer Sauerstoff-Plasmareiniger für 7 Sekunden lang bei einer Hochfrequenzleistung und einem Sauerstoffpartialdruck von 75 W und 500 mTorr sind. </li></ol> 3. Durchflussversuche <ol><li> EinsatzAluminiumelektroden (0,029 &quot;OD) und einem Auslass PEEK-Schlauch (1/32&quot; OD) in bestimmten Orten über Löcher in den Mikrokanal (siehe Bild 3b). </li><li> Schließen Sie die elektrische Ausrüstung zur Erzeugung von Hochspannungs kurzen Rechteckimpulsen zu den Aluminiumelektroden 18 verantwortlich (siehe Abbildung 3C), die in Kontakt mit fließenden Lösungen in der PDMS-Form sind. HINWEIS: Die Ausrüstung sollte aus einem Impulsgenerator und einer In-Haus gebaut Hochspannungsverstärker bestehen 18. </li><li> Planen vier 50 ml Zentrifugenröhrchen einzeln DPBS enthaltenden Lösungen mit Zellen und Biomolekülen und befestigen jedes Rohr mit seinem jeweiligen Ampullenhalter zum pneumatischen Durchflusssteuerungssystem verbunden sind (siehe 3A). 18 </li><li> Verbinden Einlass PEEK-Kapillare auf den Flaschenhalter in die jeweiligen Einlaßöffnungen in der mikrofluidischen Vorrichtung. </li><li> Stellen Sie die Grße der Rechteckimpulse, V, 100 V, um die elektrische FIE habenld Stärke, E = V / L e, über die Elektroporationskammer äquivalent zu 0,7 kV / cm. HINWEIS: Hier ist L E der Abstand zwischen zwei Punkten, wo die positiven und negativen Elektroden in Kontakt mit der fließenden Lösung sind (siehe Abbildung 1). </li><li> Stellen Sie den Druckregler auf 40 psi. 18 Eine einzelne manuell einstellbar Stickstoffquelle wird verwendet, um gleichmäßig Druck alle Probenfläschchen und eine High-Speed-Verteiler genutzt, um rechtzeitig aktivieren individuelle Lösung Ports mit der kundenspezifischen Software LabVIEW: Hinweis. </li><li> Für die Ventilsteuerung, öffnen Sie die maßgeschneiderte Software LabVIEW markiert Ventil Runner, und klicken Sie auf Run im Dropdown-Menü mit dem Titel arbeiten. </li><li> Schalten Sie Ventile, indem Sie auf jedem entsprechenden Ventil-Symbol. HINWEIS: Das Ventil Symbol wird grün, wenn es aktiviert wird. Ein Klick auf die aktive Symbol deaktivieren und das Ventil schließen. Das geschlossene Ventil Symbol sollte grau. </li><li> Öffnen Sie das Ventil für die DPBS Behälter (dh., Waschlösung) an Minister der Strömungsgeschwindigkeit für stabile Zell-Trapping Wirbelbildung erforderlich für 1,5 min. </li><li> Umschalten der aktiven Lösung Port aus der Waschlösung zu der Zelllösung zu stoppen Zellen in der Elektroporation Kammer 30 s (dh die Zellfangschritt). </li><li> Fließen sowohl Wasch-und Zell Lösungen durch das Gerät gleichzeitig für 10 Sekunden vor der Zell-Trapping-Schritt, um ungestörten Strömung während der Lösung-Schaltschritt zu gewährleisten. HINWEIS: Diese kurze Zusammenfluss Schritt sollte bei jeder Lösung-Schaltschritt wiederholt werden. </li><li> Schalten Sie den Waschhafen und spülen Sie das Gerät für 20 Sekunden, um nicht gefangen kontaminierenden Zellen zu entfernen. </li><li> Injizieren Sie die Lösung, die das erste Molekül von Interesse (0,2 mg / ml 3000 Da neutrale und anionische Dextranmolekülen oder 1,5 mg / ml von 70.000 Da neutral Dextranmolekül) in das Gerät. </li><li> Gelten fünf kurze Impulse (t = 30 ms mit 2 Sekunden-Intervallen) unverzüglich nach der Injektion derMolekularlösung und Überwachung der Größe und Dauer des angelegten elektrischen Impulse in Echtzeit unter Verwendung eines Oszilloskops. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.10 so oft wie die Anzahl von zusätzlichen Molekülen geliefert werden. Für jede Lieferung Molekular, Inkubation Zellen für 100 s in der molekularen Lösung dann spülen Sie das Gerät mit der Waschlösung für 100 s, um überschüssige Moleküle zu entfernen. </li><li> Lassen Sie die Zellen in einer 96-Well-Platte für nachgeschaltete Analyse durch Senken der Betriebsdruck unter 5 bar. HINWEIS: Etwa 100 ul Lösung mit 100 Zellen von jedem Release gesammelt. </li><li> Führen Sie die experimentellen Schritte 3.9 bis 3.16 drei Mal, um genügend Zellen für die Durchflusszytometrie zu sammeln. </li><li> Zentrifugieren der 96-well-Platte, die verarbeiteten Zellen 5 min bei 228 × g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, die überschüssige fluoreszierende Moleküle enthält. </li><li> Die Zellen in DPBS für die Durchflusszytometrie-Analyse. </li><li> Lastzellen im Durchflusszytometer für die molekulare uptake Effizienzanalyse. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit der neuen Plattform parallelisiert Elektroporation, 10-fache Verstärkung in Durchsatz und Effizienz von Multi-Molekül Lieferung wurde zusätzlich zu all den Vorzügen, die die zuvor entwickelten Ein-Kammer-System bietet erreicht. Bisher 18 verfügbar Verdienste umfassen (i) Vorreinigung Zielzellen mit einheitlicher Größenverteilung für die Lebensfähigkeit Verbesserung, (ii) präzise und individuelle molekulare Dosierungssteuerung, und (iii) geringe Betriebs elektrischen Strom. Fluoreszierend markier...

In den letzten Jahren hat die Verwendung von elektrischen Impulsen an das cytosolische Abgabe von extrazellulären Molekülen erleichtern zu einem attraktiven Mittel zum Manipulieren Säugerzellen. 1 Dieses, auch als Elektroporation bekannt ist, reversibel permeabilisiert der Zellmembran, so dass für inhärent Membran undurchlässig Moleküle um Zugang zu erhalten intrazellulären Milieu der Zellen. Da praktisch jedes Molekül in das Cytosol über temporäre erzeugt Poren in der Membran von jeder Art von Zellen unter Verwendung von Elektroporation eingebracht werden, ist die Technik, wie berichtet, wobei reproduzierbarer, universell einsetzbar und effizienter als andere Verfahren, einschließlich Virus-vermittelten chemischen und optische Methoden. 2-3 Diese Technik wurde verwendet, um fluoreszierende Moleküle einzuführen, 4 Medikamente 5 und Nukleinsäuren 6-7, während Zellen lebensfähig und intakt. Angesichts dieser Vorteile hat die Elektroporation als eine gemeinsame Arbeits verabschiedetAtory Technik zur DNA-Transfektion in vivo Gentherapie und Zell 8 Vakzinierungsstudien. Es ist jedoch immer noch schwierig für herkömmliche Systeme Elektroporation, gleichzeitig eine praktische Effizienz und Rentabilität für Proben mit großen Heterogenität in der Größe, da die elektrische Feldstärke für eine erfolgreiche Elektroporation erforderlich eng mit Durchmesser der Zelle korreliert. Hinzu kommt, dass diese Systeme nicht erlauben präzise Steuerung der mehreren molekularen Mengen, die durch die Abhängigkeit von Groß stochastischen Molekularlieferprozess geliefert. 9 Um diese Probleme anzugehen, haben viele Gruppen mikrofluidischen Elektroporation Plattformen entwickelt und bietet den Vorteil der geringeren Körperschaftsteuer Spannungen, bessere Transfektionseffizienz, eine große Reduktion der Zellsterblichkeit, und die Fähigkeit, mehrere Moleküle liefern. 10-13 Diese Vorteile wurden möglich durch die kleinen Fußabdrücke von Mikrosystemen, deren Elektroporation ElektrodenabstandLängen sind Unter Millimeter, dramatisch sinkende Spannungen für erfolgreiche Zustellung erforderlich. Darüber hinaus können diese Mikrosysteme Elektroporation einheitliche elektrische Feldverteilung zu erreichen und schnell erzeugte Wärme abzuführen, was reduzierter Zellmortalität und gleichzeitig die Liefereffizienz. Die Nutzung von transparenten Materialien für diese Mikrochips ermöglicht ferner in situ Beobachtung der Elektroporation Prozesses für eine schnelle Parameteränderungen. 2,12 jedoch präzise Dosierung Steuerung und molekular und zellulären abhängigen Parametersteuerung, für die Schwellen Forschung und therapeutische Anwendungen, 6 erforderlich, 14-16 immer noch ungelöst. In dieser Arbeit wird eine mikrofluidische Wirbelgestützte Elektroporation System liefern kann mehrere Moleküle sequentiell in einer vorgewählten identische Population von Zielzellen. Zellen, die mit gleichmäßigen Größenverteilung vor der Elektroporation isoliert mit zuvor berichteten size-selektive Fangmechanismus. 17-18 Durch eine gleichmäßige Größenverteilung, weniger Schwankungen bei der Elektroporation Effizienz und verbesserte Rentabilität pro gegebenem elektrischen Feldstärke erreicht. 19. Darüber hinaus kontinuierlich gerührt gefangen Zellen unter Verwendung von Mikrowirbel für gleichmäßige Abgabe von Molekülen über die erlaubte gesamte Cytosol, in Übereinstimmung mit den zuvor berichteten Ergebnisse mit einem anderen wirbel unterstützt Elektroporation Plattform. 20. Um zu zeigen, dass dieses System wäre für eine breite Palette von Molekülen in biologischen Anwendungen häufig genutzt, Makromoleküle mit einer breiten Palette von Molekulargewichten wurden geliefert metastasierendem Brustkrebs-Zellen. Darüber hinaus mit Hilfe von Echtzeit-Prozessüberwachung, bietet diese Arbeit mehr Beweise, um ein Ende während electrporation auf die langjährige Debatte über den Mechanismus der molekularen Lieferung setzen, wobei überwiegend Elektrophorese-vermittelte gegenüber diffusions vermittelt. 14 </sup&gt; Im Gegensatz zu anderen Systemen Elektroporation, bietet diese Plattform eindeutig die kombinierten Vorteile der präzisen Multi-Molekül Lieferung, hohe Molekular Lieferung Effizienz, minimale Zellsterblichkeit, einer breiten Spanne von Größe und Kosten der gelieferten Moleküle, sowie Echtzeit-Visualisierung der Elektroporation Prozess. Angesichts dieser Möglichkeiten hat das System entwickelt Elektroporation praktische Potenzial als vielseitiges Werkzeug für die zelluläre Reprogrammierung Studien 6,14,21-22 Drug-Delivery-Anwendungen und Anwendungen, die 10,19 für ein tiefes Verständnis der molekularen Elektroporation Liefermechanismen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1056">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:475px;">MDA-MB-231 cancer cell line</td>
			<td style="width:297px;">American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td style="width:119px;">HTB-26</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Leibovitz&#8217;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">10-045-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:475px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">21-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Trypsin</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Flow Cytometer easyCyte HT</td>
			<td style="width:297px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">0500-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Oxygen Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:297px;">Technics Micro-RIE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dektak 6M surface profiler</td>
			<td style="width:297px;">Veeco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">KMPR 1050</td>
			<td style="width:297px;">Microchem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td style="width:297px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Compressed Nitrogen gas</td>
			<td style="width:297px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">NI 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">High Pressure Regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td>6162K22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Downstream regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">4000K563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">high-speed 3/2way-8 valve manifold</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Inline Check Valve</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">CV3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">5/32&#34; OD x 3/32&#34;ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td>PU-156F-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/4&#34; OD X 0.17&#34; ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td style="width:119px;">PU-250PB-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/16&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;">P1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/32&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">PEEK tubing unions</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Pulse Generator</td>
			<td style="width:297px;">HP</td>
			<td style="width:119px;">8110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Aluiminum Wire</td>
			<td style="width:297px;">Bob Martin Company</td>
			<td style="width:119px;">6061 ALUM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">oscilloscope</td>
			<td style="width:297px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">DSO3062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">T75 culture flask</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3329</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

Elektroporation wurde zunehmende Aufmerksamkeit in den letzten Jahren erhalten, weil es ein sehr leistungsfähiges Verfahren zum physikalischen Einführen nicht-durchdringenden exogenen molekulare Sonden in Zellen. Diese Arbeit berichtet über eine mikrofluidische Plattform Elektroporation der Lage ist, mehrere Molekül Lieferung an Säugetierzellen mit präzisen und molekularen abhängigen Parametersteuerung. Die Fähigkeit des Systems, um Zellen mit einheitlicher Größenverteilung zu isolieren lässt weniger Variation in Elektroporationseffizienz pro gegebenem elektrischen Feldstärke; damit verbesserte Probenfähigkeit. Darüber hinaus ermöglicht die Beobachtung des Fluoreszenzmolekularaufnahmeprozess in Echtzeit, die prompt Molekular Lieferung Parametereinstellungen zur Effizienzsteigerung ermöglicht in situ seine Prozessvisualisierungsfunktion. Um die riesigen Möglichkeiten der Plattform gemeldet zeigen, Makromoleküle mit verschiedenen Größen und elektrische Ladungen (zB Dextran mit MW von 3.000 und 70.000 Da) warengeliefert metastasierendem Brustkrebs-Zellen mit hoher Fördereffizienzen (&gt; 70%) für alle getesteten Moleküle. Die entwickelte Plattform wurde das Potenzial für den Einsatz in den Ausbau der Forschungsfelder, wo auf dem Chip Elektroporationstechniken von Vorteil sein kann bewiesen.

Der entwickelte parallele mikrofluidische Elektroporator geliefert Makromoleküle mit verschiedenen Größen und elektrische Ladungen in lebende metastasierendem Brustkrebs-Zellen. Erfolgreiche Molekularliefer wurde qualitativ durch Überwachung von Veränderungen in der Fluoreszenzintensität des elektroporierten umlaufenden Zellen in situ bestimmt und durch quantitative Messungen mittels Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt. 4A zeigt, dass 90% der behandelten Zellen Auffassung 70.000 Da ne...

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Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Eine mikrofluidische Vortex Assisted Elektroporation Plattform wurde für die sequentielle Übertragung mehrerer Moleküle in Zellpopulationen identisch mit präzisen und unabhängigen Steuer Dosierung entwickelt. Größe basiert Zielzelle Reinigungsschritt voran Elektroporation des Systems geholfen, um molekulare Lieferung Effizienz und verarbeitet die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.

Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K Aufrufe.  Harvard University.  Eine mikrofluidische Vortex Assisted Elektroporation Plattform wurde für die sequentielle Übertragung mehrerer Moleküle in Zellpopulationen identisch mit präzisen und unabhängigen Steuer Dosierung entwickelt. Größe basiert Zielzelle Reinigungsschritt voran Elektroporation des Systems geholfen, um molekulare Lieferung Effizienz und verarbeitet die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. 

Serie: Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Forschung

Biotechnik

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

Haut Tätowieren als einen neuartigen Ansatz für DNA Vaccine Lieferung

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen<em&gt; In-vitro-</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunktionalisierten Prussian Blue Nanopartikel für Molekulare Bildgebung Multimodale Anwendungen

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse von Misch Inhomogenität in einer mikrofluidischen Vorrichtung von Microscale Schlieren Technik

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

Mesenchymale Stromazellen Zellkultur und Lieferung in Autologe Bedingungen: Ein intelligenter Ansatz für orthopädische Anwendungen

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Vierdimensionale CT-Analyse mit sequenzieller 3D-3D-Registrierung

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...