Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Award 13SDG14500046 PD, eine nachhaltige Energie Education &amp; Research Center Award (Univ. of Tennessee) PD unterstützt und von den Ärzten &quot;Medical Education and Research Foundation (Univ. of Tennessee) Auszeichnung an JM Die Autoren danken Caroline Leplante (Yale Univ.) für das Protokoll für die Umwandlung von Spalthefe zu Spheroplasten; Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) für die Nutzung seiner Schüttelinkubatoren, Tischzentrifuge, und Western-Blot-Analysegeräte, und das Zentrum für Umweltbiotechnologie (Univ. Tennessee) für die Nutzung ihrer ultra-Zentrifuge; Günther Daum für Hefe-Antikörper (Graz Univ of Technology, Österreich.), das Personal der Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe (Univ. Tennessee Medical Center) für die technische Unterstützung .

1. Trenn Lipid Droplets aus (Fission) Hefezellen Isolation von Tröpfchen aus der beliebten Modellorganismus Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist fast identisch mit dem folgenden Protokoll 6. Unterschiede in den Vorbereitungen zur Kenntnis genommen. 1. Wachsende Hefezellen <ol><li> Bereiten Sie die Medien. Kombinieren Sie 36 g Pulver pro Liter YE5S dH 2 O in Glasflaschen oder Kulturflaschen. Etwa 2 l Medien benötigt werden. Autoklavieren der Medien bei 121 ° C für 20 min. Ermöglichen, dass die Medien auf Raumtemperatur abkühlen. Für S. cerevisiae ersetzen YE5S mit YPD. </li><li> Platzieren 10-20 ml der gekühlten YE5S Medium in einem 250 ml-Kulturkolben unter Verwendung von sterilen Techniken. Inokulieren, die Medien mit einer kleinen Menge der Hefezellen von einer Agarplatte mit einem sterilen Holzstäbchen oder gleichwertig. Ließ die Zellen wachsen, um die gewünschte optische Dichte bei 30 ° C. Messung der optischen Dichte bei einerWellenlänge von 595 nm mit einem Spektralphotometer. </li><li> Die restlichen Medien in den 2,8-l-Flaschen. Verwenden Sie nicht mehr als 1 L Medium pro 2,8-l-Flasche auf richtige Mischung während des Zellwachstums im Schüttelinkubator gewährleisten. Die endgültige Ausbeute an nassen Zellen sollten etwa 10 g in der Lage sein, genügend Lipidtröpfchen für Proteomik und der Lipid-Analyse zu erwerben. </li><li> Einführung der Zellen aus Schritt 1.2 in den 2,8-l-Kolben mit jeweils 1 l Medium, das in Schritt 1.1 hergestellt wurden. </li><li> Wachsen die Zellen auf die gewünschte Dichte bei 30 ° C </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Zellen Lipidtröpfchen. Reserve 1 ml der Zellen. Die optische Dichte (OD) der Probe. In 0,1 ml einer 100 mM Stamm von BODIPY 493/503 in Ethanol pro OD von Zellen auf die Probe. Platz 3 ul der Probe zwischen einem Objektträger und einem Deckglas. Visualisierung unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem GFP-Filter (Fig. 1A). </li><li> Pelletierung der Zellen aus Schritt 4 und 1,5 bei #176; C bei 3.800 × g für 10 min. Arbeiten chargenweise in Abhängigkeit von der Kapazität der Zentrifugenröhrchen. </li><li> Gießen Sie die YE5S Medien und waschen Sie die Zellen mit einem Puffer von EMM + 600 mM Sorbit. Sorbitol bietet osmotischen Unterstützung. </li><li> Übertragen der Zellen in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen pelletieren und die Zellen bei 4 ° C bei 2.000 × g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand. Wiegen Sie die Nasszellen. Resuspendieren der Zellen in 2 ml (EMM + 600 mM Sorbit) Puffer pro Gramm Zellen. </li></ol> 2. Konvertieren Spalthefe Zellen in Spheroplasten und anschließender Lyse <ol><li> Jeweils 1 5 mg) Hefe lytischen Enzym und 2) Hefe-Lyse Enzyme aus Trichoderma harzianum pro Gramm Nasszellen, die in Schritt 1.9 gewogen wurden. Für S. cerevisiae ergänzen diese Enzyme mit der gleichen Menge von Zymolyase. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 30 ° C unter leichtem bei 100 rpm für 60 min schütteln. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Spheroplasten haben Lipid droplets. Durch Wiederholen von Schritt 1.6 (Fig. 1B). </li></ol> 3. Dichtegradientenzentrifugation <ol><li> Pellet die Sphäroplasten durch Zentrifugation bei 4 ° C bei 2.000 × g für 5 min. </li><li> Den Überstand mit einem Kunststoff-Transferpipette vorsichtig entfernen. </li><li> Vorsichtig resuspendieren pelletiert Spheroplasten mit eiskaltem 10 mM Tris-HCl, 600 mM Sorbitol und 200 uM EDTA. Beachten Sie, dass die Spheroplasten sind sehr zerbrechlich. </li><li> Pellet die Spheroplasten wieder mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 3.1. Vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sphäroplasten mit einem Kunststofftransferpipette in 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &amp;mgr; M EDTA in einer Konzentration von 2 ml / g-Zellen. </li><li> Übertragen Sie die resuspendiert Spheroplasten zu einem Glas-Homogenisator homogenisieren und sanft auf dem Eis, 20-30 Schläge, mit der locker sitz Stößel der Glas-Homogenisator. </li><li> Übertragen Sie die lysiert Spheroplasten in Zentrifugenröhrchen überlagern und mit dem gleichen volumen von 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &amp;mgr; M EDTA-Puffer. Wählen der Anzahl der Reaktionsgefäße auf, so daß jedes Rohr etwa zwei Drittel voll zu nutzen. </li><li> Zentrifuge bei 4 º C bei 100.000 × g für 1,5 Stunden in einem SW28 Rotor oder gleichwertig. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0). </li><li> Sie vorsichtig die oben schwimmenden weißen Schicht (2A), die die Tröpfchen enthält, Transfer in ein neues Zentrifugenröhrchen (n) entweder mit einem Pipette oder einer gebogenen Pasteur-Pipette. Add genug Volumen von 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &amp;mgr; M EDTA-Puffer zu der Probe, so dass sie etwa ein Drittel des Zentrifugenrohrs ausfüllt. </li><li> Hinzufügen des äquivalenten Volumen von 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &amp;mgr; M EDTA-Puffer, um der Oberseite der Probe (n) in der neuen Zentrifuge Röhre (n). Nach Zugabe dieses Puffers sollte die Rohre etwa zwei Drittel voll. </li><li> Zentrifuge bei 4 º C bei 100.000 g für 1 h in einem SW28-Rotor oder gleichwertig. Lassen Rotor bis zum Stillstand (rotor Verzögerung = 0). </li><li> Sanft übertragen Sie die oben schwimmenden weißen Schicht (2B), die die Tröpfchen enthalten wird, um ein neues Zentrifugenröhrchen (n) entweder mit einem Pipette oder einer gebogenen Pasteur-Pipette. Add 600 mM Sorbit, 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &amp;mgr; M EDTA-Puffer zu der Probe, so dass sie etwa ein Drittel des Zentrifugenrohrs ausfüllt. </li><li> Hinzufügen des äquivalenten Volumens von 250 mM Sorbit, 10 mM Tris-HCl und 200 &amp;mgr; M EDTA-Puffer, um der Oberseite der Probe (n) in der neuen Zentrifuge Röhre (n). Nach Zugabe dieses Puffers sollte die Rohre etwa zwei Drittel voll. </li><li> Zentrifuge bei 4 º C bei 100.000 g für 1 h in einem SW28-Rotor oder gleichwertig. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0). </li><li> Übertragen oberen weißen Schicht (2C), die nur die Lipidtröpfchen und gebundene Proteine ​​enthalten sollte, in einen Dialyseschlauch und dialysiert O / N in 10 mM Tris-HCl und 200 &amp;mgr; M EDTA-Puffer, um das Ficoll beseitigen. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Trenn Lipid Droplets von Menschenplazenta Villöse Cells Plazenten wurden von gesunden Frauen mit Einlingsschwangerschaften elektiven Kaiserschnitt Lieferung vor dem Einsetzen der spontanen Arbeits am Termin gesammelt. Themen gab schriftliche informierte Zustimmung zur Sammlung ihrer Plazenta. Die Sammlung und die anschließende Verwendung der Plazenta wurde mit Genehmigung von der University of Tennessee und der University of Tennessee Graduate School of Medicine in Knoxville Institutional Review Board (# 8757B und # 3338, respectively) durchgeführt. 1. Isolierung menschlicher Plazenta villous Zellen Teil 1 des Protokolls ist eine Modifikation eines früher veröffentlichten Protokoll von Petroff et al. 26 Bereiten Sie folgende Lösungen: <ul><li> NaCl (1 L): 9 g NaCl auflösen (M 58,4 g / mol) in dH 2 O, um eine 1 L Lösung ergeben. Filter zu sterilisieren (0,2, Um Membran). </li><li> 10x Hanks ausgewogener Salzlösung (10x HBSS) (1 l): 4 g KCl (M 74,5 g / mol), 0,6 g KH 2 PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g D-Glucose (M 180,16 g / mol). Lösen Sie jedes der Bestandteile in dH 2 O, um eine 1 L Lösung ergeben. Filter zu sterilisieren (0,2 um Membran). </li><li> Enzym-Verdauungspuffer (0,6 ml): 70 ml kombinieren 10x HBSS mit 3,3 ml 7,5% Na Biscarbonats, 17,5 ml 1 M HEPES und 266,1 ml dH 2 O; Filter zu sterilisieren (0,2 um Membran). Lagern bei 4 ° C </li><li> DNase I: kurz vor Gebrauch 5 ml steriler 0,9% NaCl in ein Fläschchen von DNase. Halten bis zur Verwendung auf Eis oder bei -20 ° C </li></ul><ol><li> Vorbereiten Plazenta für die Präparation <ol><li> Besorgen Sie sich eine menschliche Plazenta und Verfahren möglichst nahe an dem Zeitpunkt der Lieferung wie möglich. Verwenden einen abgedichteten Behälter, wie einen Kühler, die Plazenta transportiert. Seien Sie immer vorsichtig, wenn die Handling menschlichen biologischen Materialien. </li><li> In der biologischen Schutzhaube, übertragen Sie die Plazenta in einen sterilen Behälter autoklavierbar und vorsichtig waschen Blut aus der Plazenta und Membranen mit steriler 0,9% NaCl (Kochsalzlösung) Lösung. Entsorgen blutigen Kochsalzlösung in der 1-Liter-Becher als flüssige biologische Abfälle. </li><li> Legen Sie die Plazenta auf einem sterilen Bereich, mit der glatten Seite mit der Nabelschnur nach oben ein. Mit scharfen, fein-Punkt-Schere und Pinzette entfernen Eihäute und Nabelschnur. </li><li> Klappen Sie den Plazenta um, so dass der mütterliche Oberfläche (raue Oberfläche) nach oben zeigt. Entfernen Sie den darüber liegenden Grundplatte Gewebe, ca. 3 mm von der Oberfläche. </li></ol></li><li> Lagen zur Plazenta <ol><li> Präparieren Sie ein Keimblatt in einer Zeit, die Vermeidung der Chorionplatte. Sammeln Zottengewebe in ein 250 ml Becherglas mit Kochsalzlösung. </li><li> Gewebe mehrmals gründlich in einem getrennten Becherglas mit 0,9% NaCl durch Verwirbelung mit der Pinzette, mit Hilfe der 1 L-Becherglas für flüssige Abfälle. </li><li> Ein Keimblatt übertragen zu einem Zeitpunkt auf eine 150 mm Petrischale. Halten Sie mit einer Pinzette und kratzen Gewebe mit Rasierklinge von Schiffen auf Petrischale. Zeigen abgekratzt Gewebe in separaten Becherglas mit 0,9% NaCl. Wiederholen Sie für alle Gewebestücke. </li><li> Übertragen kleinen Teil des Gewebes in die Zelle Dissoziation Sieb und spülen mit 0,9% NaCl ausgiebig, bis das Eluat deutlich. Wiederholen aller Gewebe. </li><li> Nach dem Spülen der abgekratzt Gewebe in der Zelle Dissoziation Sieb abtropfen lassen überschüssige Flüssigkeit und Gewicht. An diesem Punkt kann das Gewebe bei 4 º C in DMEM gespeichert O / N in einem sterilen Erlenmeyerkolben werden. </li></ol></li><li> Enzymatische Verdauung der Plazentagewebe <ol><li> Bereiten Sie das Gewebe Verdauung Mischung: 100 ml vorgewärmten Enzymverdünnungspuffer, 1 ml DNase I und 20 ml 2,5% 10x Trypsin. </li><li> Teilen Sie die Gewebe, die Übertragung von insgesamt 60 g gesammelten Gewebe (in der Regel etwa 250 bis 300 g) in einen 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben. </li><li&gt; In der Gewebeverdauungsmischung auf den Erlenmeyerkolben in das Gewebe enthält, und bei 37 ° C in einem Schüttler für 45 Minuten bei 150 Upm. </li></ol></li><li> Das Sammeln der dissoziierten Zellen <ol><li> Nach der ersten 45 min Dissoziation, stellen Sie den Aufschlusskolben in einem Neigungs bis Gewebe absetzt. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit, dabei nicht zu undissoziierten Gewebe zu sammeln. In die gleiche Menge HBSS auf den Überstand gesammelt und übertragen in sterile 15 ml Zentrifugenröhrchen. Weitere Teile der undissoziierten Gewebe, wiederholen Vorgang ab Schritt 3.2 mit dem undissoziierten Gewebe. </li><li> Zentrifugieren des Homogenats bei 4 ° C bei 1.000 × g für 15 min. </li><li> Für jede Partie nach der Zentrifugation, saugen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Die Plazenta villous Zellen sind überwiegend im weißen Teil des Pellets, die über den roten Blutkörperchen. </li><li> Übertragen Sie die Zotten-Zellen (weiße Teil des Pellets) zu einem sterile 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen und auf Eis zu halten. </li><li> Nach dem Sammeln der Zellen, die aus allen drei Phasen der Verdauung, filtern die Suspension mit einer 100 &amp;mgr; m Nylon-Zellfilter in der Spitze einer sterilen 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen eingeführt. Wenn die Filtration der Zellsuspension verlangsamt Heben nach oben auf den Filter, um ein Vakuum in der Röhre zu ziehen. </li><li> Zentrifuge bei 4 ° C bei 1.000 × g für 10 min. Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Pellet zu stören. </li></ol></li></ol> 2. Homogenisieren Plazentazellen villous <ol><li> Bevor mit der Isolationsprozess vorzubereiten 50 ml hypotonische Lyse Medium (HLM), enthaltend 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 1 mM EDTA. In Protease-Inhibitoren zu HLM kurz vor der Verwendung und halten das Medium auf Eis. </li><li> In der biologischen Schutzhaube, fügen Sie den 4-fachen Zellpellet Volumen eiskaltem HLM zu den Zellen. Sanft und gründlich resuspendieren Zellen durch Pipettieren der Zellen-up eind-down unter Verwendung einer 10 ml Pipette. </li><li> Inkubieren Sie die suspendierten Zellen auf Eis für 10 min. </li><li> Übertragen der Zellen an die Dounce-Homogenisator, der auf Eis sein sollte. Langsam homogenisieren die Zellen durch die Anwendung 20-25 sanfte Schläge mit der locker sitzenden Stößel des Homogenisators. </li><li> Zentrifuge das Zelllysat bei 4 ° C bei 3.000 × g für 10 min, um aufgebrochene Zellen, Zelltrümmer und Zellkerne zu entfernen. </li><li> Sammeln Sie den Überstand und Transfer in ein SW28 Rohr (oder Alternative, die bei 25.000 g zentrifugiert werden kann). Zentrifuge bei 4 ° C bei 25.000 × g für 20 min, um die Mitochondrien zu entfernen. </li></ol> 3. Trennlipidtröpfchen durch Ultrazentrifugation <ol><li> Vorbereitung 50 ml 100 mM Natriumcarbonat (M 106 g / mol)-Puffer (pH 11,5) und 50 ml 60% Sucrose (w / w) Lösung. In Protease-Inhibitoren auf die Natriumcarbonat-Puffer kurz vor Gebrauch und auf Eis zu halten. </li><li> Sammeln des Überstands aus Schritt 2.6 in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, justierenbis 20% Saccharose und Übertragung in den Boden ein Ultrazentrifugenröhrchen für einen SW28-Rotor, oder gleichwertig. Overlay Dichte angepasst Stand mit ~ 10 ml eiskaltem 100 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH-Wert 11,5) und 0,5 bis 1 ml eiskaltem HLM, um die Röhre zu füllen. </li><li> Zentrifuge bei 4 º C bei 130.000 · g für 45 min unter Verwendung SW28 Ausschwingrotor. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0). </li><li> Sammeln der schwimmenden Schicht beträgt, auf 10% Saccharose und Übertragung in den Boden einer 13,2 ml Ultrazentrifugenröhrchen für ein SW41Ti-Rotor, oder gleichwertig. Overlay Dichte angepasst Stand mit etwa 5 ml eiskaltem 100 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH-Wert 11,5) und 0,5 ml eiskaltem HLM. </li><li> Zentrifuge bei 4 º C bei 274.000 · g für 60 min unter Verwendung SW41Ti Ausschwingrotor. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0) zu einer Störung der Lipidtropfenschicht zu minimieren. </li><li> Die obere Schwimmschicht (2D), die sorgfältig sammelnLipidtröpfchen mit einer 1 ml Pipette und wiederholen Sie Schritt 3.4. </li><li> Zentrifuge bei 4 º C bei 274.000 · g für 30 min unter Verwendung SW41Ti Ausschwingrotor. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0). </li><li> Sorgfältig sammeln die obere weiß gefärbte Schicht, die schwimmende Lipidtröpfchen mit einem gebogenen Pasteur-Pipette in drei 1,5-ml-Röhrchen mit 100 ul HLM. </li></ol> Charakterisierung von Lipidtröpfchen Fraktion (Protokolle 1 und 2) Die Rückgewinnung und Reinheit der Lipidtröpfchen Fraktion kann durch Western-Blot in Kombination mit Licht-oder Elektronenmikroskopie bestätigt werden. Darüber hinaus können nach verschiedenen Aliquots Zentrifugationsschritte gesammelt und zur Bestimmung Reinigungsleistung beibehalten werden. In Western Blot, ist es zweckmäßiger, ein Volumen der Lipidtröpfchen Fraktion, die ein Äquivalent des Ganzzelllysat stellt als Vergleich die Lipidtröpfchen zu anderen Membranfraktionen auf T vergleichener aufgrund der Gesamtproteingehalt 24.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells.">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).</li><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+droplets+from+cells+by+density+gradient+centrifugation.">Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic. 13, 705-714 (2012).</li><li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells.">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li><li>Cho, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+Prp19p+as+a+lipid+droplet-associated+protein+and+its+possible+involvement+in+the+biogenesis+of+lipid+droplets.">Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets.</a> J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).</li><li>Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+lipid+droplet-associated+proteins+in+primary+adipocytes+of+normal+and+obese+mouse.">Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse.</a> Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).</li><li>Jagerstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+interact+with+mitochondria+using+SNAP23.">Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23.</a> Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).</li><li>Xu, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FATP1-DGAT2+complex+facilitates+lipid+droplet+expansion+at+the+ER-lipid+droplet+interface.">The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface.</a> J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).</li><li>Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab18+localizes+to+lipid+droplets+and+induces+their+close+apposition+to+the+endoplasmic+reticulum-derived+membrane.">Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane.</a> J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).</li><li>Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+size+of+lipid+droplets:+lipid+and+protein+factors.">Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).</li><li>Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li><li>Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactomic+study+on+interaction+between+lipid+droplets+and+mitochondria.">Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria.</a> Protein Cell. 2, 487-496 (2011).</li><li>Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+distribution+of+mitochondria+and+lipid+droplets+in+human+muscle+fibres.">Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres.</a> Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).</li><li>Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gregarious+lipid+droplet.">The gregarious lipid droplet.</a> J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).</li><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+fat:+an+evolving+model+of+lipid+droplet+assembly+and+expansion.">Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion.</a> J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

<html> Kritische Schritte innerhalb dieses Protokolls Sicherzustellen, dass während des Wachstums von kultivierten Zellen, die mit Medium und die Zelldichten werden. Cellular Lipidtröpfchen sind einzigartig, ihre assoziierten Proteine ​​sind stark abhängig von der Umgebung, in der die Zellen kultiviert werden, 17. Daher sollten die Medien, in denen die Zellen gezüchtet und die Dichte der Zellen vor der Lyse eng überwacht werden. <p cla...

Cellular Lipidtröpfchen sind dynamische Organellen, die mehrere Funktionen in Zellen dienen. Sie sind lager Hubs für neutrale Lipide, die in Energie umgewandelt oder Phospholipid-Synthese verwendet werden können. Die Tropfen spielen eine zentrale Rolle in physiologischen und pathologischen Bedingungen, einschließlich Atherosklerose, Fettleibigkeit und die damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen, Infektionskrankheiten und auch 1,2. Darüber hinaus sind sie faszinierende Quellen für die Biodiesel-Kraftstoffen. Viele Informationen über die Rolle der zellulären Lipidtröpfchen wurde von Proteom-und der Lipid-Analyse von Tröpfchen aus weitreichenden Organismen gereinigt 3 erhalten. Diese Organismen sind Bakterien, 4,5, Hefe 6-11 enthalten, pflanzen 12,13, Nematoden 14, 15,16 und fliegt. Angesichts des Interesses in der Rolle von Fetttröpfchen in der menschlichen Stoffwechselerkrankungen, haben auch Tröpfchen von kultivierten tierischen Zellen und eine isoliertenimal Gewebe. Kultivierte Zelllinien 3T3-L1 Adipozyten 17, chinesische Hamster-Eierstock (CHO)-K2-Zellen 18, die menschliche hepatocyes 19,20 und epithelialen Zelllinien 21 enthalten. Tierische Gewebe, aus dem Tröpfchen isoliert wurden, Maus Skelettmuskel 22, Leber 23 und 23 Milchdrüsen enthalten. Wie oben erwähnt, ist das Ziel der meisten Tröpfchen Isolationsstudien zur Proteom-Analyse der Faktoren gebunden und der Lipid-Analyse auf die neutrale Phospholipide und auszuführen. Seit neutralen Lipiden - die zahlreichen Komponenten von Lipidtröpfchen - sind weniger dicht als die meisten anderen zellulären Materialien, Isolierung von Tröpfchen hat traditionell durchgeführt unter Verwendung von Dichtegradientenzentrifugation. Diese Technik ist das Herzstück der beiden Preps hier vorgestellt. Zurück Techniken 6,24 kombiniert und in eine visuelle Darstellung der Isolierung von Tröpfchen aus kultivierten Zellen Spalthefe geändertnoncultured und menschliche Zellen aus Plazentagewebe erhalten. Ziel ist es, die breite Anwendbarkeit dieser Technik, indem Sie zwei sehr unterschiedliche Zelltypen als Ausgangspunkte für die Tröpfchen Isolation zu zeigen. Diese Technik sollte nützlich für diejenigen, die Tröpfchen von den meisten Organismen zu isolieren. Protokoll 1 beschreibt die Isolierung von Lipidtröpfchen von der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, die als Modell für die Beobachtung der Tropfenbildung während der eukaryotischen Zellteilung 25 verwendet wurde. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurde ausgiebig als Modellorganismus für das Studium der Biologie Fetttröpfchen verwendet. Protokoll 1 ist auf beiden Organismen und Unterschiede in den Zubereitungen sind hervorgehoben. Protokoll 2 beschreibt die Isolierung von Lipidtröpfchen aus Plazentazellen Villi, die wiederum aus menschlichen Plazenten Ausdruck erhalten werden. DieSammlung von Zeit Plazenten bietet eine einzigartige Gelegenheit, um sicher und ethisch zu erhalten 200-250 g leicht verfügbar menschlichen Gewebe 26, die eine erhebliche Anzahl von Lipidtröpfchen enthält. Dies steht im Gegensatz zu den meisten Lipidtröpfchen Isolierung Arbeit in höheren Eukaryonten, wo die Tropfen stammen aus kultivierten Zellen. In diesen Studien werden Fettsäuren häufig zu der Kultur zugegeben, um die Synthese von Neutrallipiden und somit das Wachstum der Tröpfchen zu fördern. Dies steht im Gegensatz zu der Arbeit hier wo Lipidtröpfchen unter nativen Bedingungen in Plazentagewebe gebildet. Die Reinheiten der Lipidtröpfchen Fraktionen durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Organellen Marker-Antikörper bestimmt. Diese beiden Protokolle werden Lipidtröpfchen Fraktionen, die sich für nachfolgende Proteom-und der Lipid-Analyse sind zu erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PROTOCOL #1:&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Edinburgh Minimal Media (EMM)</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td style="width:119px;">2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;">Yeast extract with 5 supplements (YE5S)</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td style="width:119px;">2011</td>
			<td style="width:167px;">YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YPD powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td style="width:119px;">1875</td>
			<td>For S. cerevisiae&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Lytic Enzyme</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">215352610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L1412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolayse-20T</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td style="width:119px;">N0766391</td>
			<td>For S. cerevisiae&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">137115AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 liter glass bottle</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml flask</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.8 liter flasks</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2. Yeast lipid droplet isolation</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll 400</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane</td>
			<td>SpectrumLabs</td>
			<td style="width:119px;">132680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Homogenizer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane</td>
			<td>SpectrumLabs</td>
			<td style="width:119px;">132680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Temperature-controlled shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C25KC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swinging Bucket Centrifuge Rotor</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge LB-M</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW28 Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">342204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PROTOCOL #2&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1. Placental villous cells isolation</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23666062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Autoclavable pan (container), 3L</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1336110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine scissors, sharp-sharp, straight</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td style="width:119px;">1406011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">London Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td style="width:119px;">1108002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7b Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td style="width:119px;">1127020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S65921</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screen cup for CD-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S1145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40 mesh screen&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0770</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand cell stainers 100&#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22363549</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 mm Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9054771</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S642</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P386</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S374</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D16</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.5% trypsin 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15090046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">10104159001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium bicarbonate solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">500 ml Erlenmeyer flasks</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">250 ml beakers</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">10 ml serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">DMEM</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Lipid droplets isolation from villous placental cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Carbonate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce homogenizer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable borosilicate glass pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1367820C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Biological safety hood&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waterbath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Temperature-controlled shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C25KC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swinging Bucket Centrifuge Rotor</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge LB-M</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW28 Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">342204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Western blot</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:163px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td>dilution 1:15000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">IRDye&#160; 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td style="width:163px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;">926-32210</td>
			<td>dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 12% Bis-Tris gels</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">NP0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">primary antibodies for PROTOCOL #1</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:353px;">Erg6p</td>
			<td style="width:163px;">gift from Dr. G. Daum</td>
			<td style="width:119px;">Graz University of Technology, Austria</td>
			<td>dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Dpm1p</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab113686</td>
			<td>4 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:353px;">Por1p</td>
			<td style="width:163px;">gift from Dr. G. Daum</td>
			<td style="width:119px;">Graz University of Technology, Austria</td>
			<td>dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:353px;">Pma1p</td>
			<td style="width:163px;">gift from Dr. G. Daum</td>
			<td style="width:119px;">Graz University of Technology, Austria</td>
			<td>dilution 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Vma1p (anti-ATP6V1A)</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab113745</td>
			<td>0.5 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">primary antibodies for PROTOCOL #2</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">perilipin 2 (anti-ADFP)</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab52355</td>
			<td>2 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:353px;">calnexin</td>
			<td style="width:163px;">Cell Signaling technology</td>
			<td style="width:119px;">2679</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GM130</td>
			<td style="width:163px;">Biorbyt</td>
			<td style="width:119px;">orb40533</td>
			<td>dilution 1:25</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:353px;">COX IV</td>
			<td style="width:163px;">Cell Signaling technology</td>
			<td style="width:119px;">4850</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">MEK1</td>
			<td style="width:163px;">Biorbyt</td>
			<td style="width:119px;">orb38775</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas

Lipidtröpfchen dynamischen Organellen, die in den meisten eukaryotischen und prokaryotischen Zellen bestimmte gefunden werden können. Strukturell die Tröpfchen bestehen aus einem Kern aus neutralen Lipiden durch eine Phospholipid-Monolayer umgeben. Eine der nützlichsten Techniken zur Bestimmung der zellulären Funktionen von Tröpfchen wurde Proteom Identifizierung von gebundenen Proteinen, die zusammen mit den Tröpfchen, die isoliert werden können. Hier werden zwei Methoden beschrieben, um Lipidtröpfchen und ihre gebundenen Proteine ​​aus zwei weit reich Eukaryoten zu isolieren: Die Kernspaltung Hefe und menschlichen Plazenta villous Zellen. Obwohl beide Techniken haben Unterschiede, die wichtigste Methode - Dichtegradientenzentrifugation - wird von beiden Präparaten geteilt. Dies zeigt die breite Anwendbarkeit der vorgestellten Tröpfchenisolationstechniken. Im ersten Protokoll werden in Hefezellen-Sphäroplasten durch enzymatischen Verdau der Zellwände umgewandelt. Die daraus resultierenden Spheroplasten werden dann gently lysiert in einem locker sitz Homogenisator. Ficoll ist mit dem Lysat zugegeben, um einen Dichtegradienten zu schaffen, und das Gemisch wird dreimal zentrifugiert. Nach dem ersten Durchlauf werden die Lipidtröpfchen auf die weiß gefärbte Schwimmschicht der Zentrifugenröhrchen zusammen mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER), der Plasmamembran und Vakuolen lokalisiert. Zwei aufeinanderfolgende Drehungen verwendet werden, um diese drei Organellen zu entfernen. Das Ergebnis ist eine Schicht, die nur Tröpfchen und die gebundenen Proteine ​​hat. Im zweiten Protokoll werden plazentaren Zotten-Zellen aus menschlichen Plazenten Zeit durch enzymatischen Verdau mit Trypsin und DNase I. Die Zellen werden in einem locker sitzenden Homogenisator isoliert. Low-Speed-und mittelschnell Zentrifugationsschritte werden verwendet, um aufgebrochene Zellen, Zelltrümmer, Zellkerne, Mitochondrien und zu entfernen. Sucrose wird zu dem Homogenat zugegeben, um einen Dichtegradienten liefern und die Mischung wird zentrifugiert, um die Lipidtröpfchen von der anderen zu trennen cellular Fraktionen. Die Reinheit der Lipidtröpfchen in beiden Protokollen wird durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Die Tröpfchen Fraktionen aus beiden Preps sind geeignet für die anschließende Proteom-und der Lipid-Analyse.

Wenn die Dichte-Zentrifugation wie erwartet funktioniert, sollte das Schwimmschicht Lipidtröpfchen und anderer Organellen während der Verlauf der Hochgeschwindigkeits-Spins aufgebraucht werden. Bei Protokoll 1 wurden Western Blots mit Marker-Antikörper gegen Lipidtröpfchen (Erg6p) und Organellen, die gefunden wurden, um mit Lipidtröpfchen in Hefe, ER (Dpm1p), Mitochondrien (Por1p) interagieren durchgeführt, Plasma-Membran (Pma1p) und Vakuolen (Vma1p). Gleic...

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Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Zwei Techniken zur Isolierung zellulärer Lipidtröpfchen von 1) Hefe-Zellen und 2) menschlichen Plazenten werden vorgestellt. Das Herzstück der beiden Verfahren ist die Dichte-Zentrifugation, wobei die resultierende Schwimmschicht, die die Tröpfchen leicht mit dem Auge sichtbar gemacht werden, extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse für Reinheit quantifiziert.

Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

isolation-cellular-lipid-droplets-two-purification-techniques

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.5K Aufrufe.  University of Tennessee.  Zwei Techniken zur Isolierung zellulärer Lipidtröpfchen von 1) Hefe-Zellen und 2) menschlichen Plazenten werden vorgestellt. Das Herzstück der beiden Verfahren ist die Dichte-Zentrifugation, wobei die resultierende Schwimmschicht, die die Tröpfchen leicht mit dem Auge sichtbar gemacht werden, extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse für Reinheit quantifiziert. 

Serie: Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Forschung

Biotechnik

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to rapidly consume hexose and pentose mixed sugars in enzyme saccharified undetoxified hydrolyzates and to accumulate over 40 g/L ethanol.

Techniken für die Entwicklung von robusten Pentose-gärenden Hefe für Biokonversion von Lignocellulose zu Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...