Ein Dreifachkulturzellsystem, das die menschliche Blut-Hirn-Schranke modelliert

Die Medikamentenabgabe an das Gehirn blieb eine Herausforderung. Die Entwicklung großer Panels neuer Nanomaterialien zur Verbesserung der Abgabe an das Gehirn unterstreicht die Notwendigkeit eines echten In-vitro-Mikrosystems, um die Hirnpenetration im Rahmen präklinischer Assays vorherzusagen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die freien Schmerzzellen der Blut-Hirn-Schranke innerhalb desselben Systems zu vereisten, was die Zellkommunikation ermöglicht, die für die Induktion des Blut-Hirn-Schranken-Phänotyps erforderlich ist.

Darüber hinaus kann jeder Zelltyp separat für weitere molekulare Analysen isoliert werden. Das Modell kann für eine Vielzahl von Experimenten unter gesunden und pathologischen Bedingungen verwendet werden und stellt ein wertvolles Werkzeug für präklinische Bewertungen von Molekül- und Partikeltransporten sowie des inter- und intrazellulären Transports dar. Dr. Clemence Deligne und Dr. Eleonora Rizzi demonstrieren das Verfahren.

Beginnen Sie mit der Kodierung der Vertiefungen mit 500 Mikrolitern von zwei Mikrogramm pro Quadratzentimeter Poly-L-Lysin-Lösung. Über Nacht oder für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren und die Poly-L-Lysin-Lösung vorsichtig mit einer Glaspipette entfernen, die an ein Ansaugsystem angeschlossen ist. Anschließend zweimal mit sterilem Wasser abspülen.

Um die Astrozyten zu sammeln, waschen Sie die Astrozyten zuerst einmal mit 10 Milliliter warmem 1X PBS CMF. Inkubieren Sie sie für drei Minuten mit 10 Milliliter warmer 20% Trypsin EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff. Die Zellen werden mechanisch aus dem Kolben gelöst und die Suspension in ein konisches Röhrchen überführt, das fünf Milliliter warmes, unverdünntes FCS enthält.

Zentrifugieren Sie die Suspension bei 190 mal G fünf Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut in fünf Milliliter warmem Astrozytenmedium und verdünnen Sie dann 20 Mikroliter der Zellsuspension mit 80 Mikrolitern 1X PBS CMF. Zählen Sie die Zellen mit einer manuellen Zählkammer unter einem Mikroskop.

Plate etwa 40.000 Zellen pro Quadratzentimeter in jedem Poly-L-Lysin vorcodiert in einem Volumen von 1,5 Milliliter warmem Astrozytenmedium. Platzieren Sie die umgedrehten Einsatzfilter am Rand einer abgedeckten 25 Millimeter hohen Schüssel und fügen Sie 250 Mikroliter Kollagen Typ Eins-Lösung zu den Einsatzfiltern hinzu. Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie dann vorsichtig die Kollagenlösung vom Typ eins mit einer Glaspipette, die an ein Ansaugsystem angeschlossen ist. Waschen Sie zweimal mit 250 Mikrolitern DMEM hoher Glukose bei Raumtemperatur und entfernen Sie vorsichtig die gesamte Lösung aus den Einsatzfiltern. Waschen Sie die Perizyten zweimal mit 10 Milliliter warmem 1X PBS CMF und inkubieren Sie die Zellen mit zwei Milliliter warmem Trypsin.

Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Wirkung des Trypsins zu überwachen. Wenn sich die Zellen zu lösen beginnen, entfernen Sie das Trypsin, fügen Sie dann fünf Milliliter warmes Endothelzell-Basalmedium oder ECM zu den Zellen hinzu und beginnen Sie mit der mechanischen Dissoziation. Verdünnen Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension mit 80 Mikrolitern 1X PBS CMF und zählen Sie die Zellen mit einer manuellen Zählkammer unter einem Mikroskop, wie zuvor gezeigt.

Seed 44, 500 Zellen pro Quadratzentimeter auf den vorcodierten revertierten Einsatzfiltern in einem Volumen von 250 Mikrolitern. Halten Sie die Einsatzfilter drei Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff. Verwenden Sie sterile Pinzetten, um die Einsatzfilter vorsichtig in eine 12-Well-Platte mit 1,5 Milliliter warmem ECM pro Vertiefung umzuwandeln.

Die Einsatzfilter können nun auf der anderen Seite beschichtet werden. Beschichten Sie die Oberseite und die Einsatzfilter mit 500 Mikrolitern Hydrogel auf Basis extrazellulärer Matrix. Stellen Sie die Einsatzfilter für eine Stunde in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff.

Waschen Sie sie einmal mit 500 Mikrolitern DMEM-Hochglukose bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Endothelzellkultur einmal mit 10 Milliliter warmem 1X PBS CMF und inkubieren Sie die Zellen mit zwei Milliliter warmem Trypsin. Entfernen Sie das Trypsin, wenn sich die Zellen zu lösen beginnen, fügen Sie dann fünf Milliliter warme ECM hinzu und beginnen Sie mit der mechanischen Dissoziation.

Verdünnen Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension mit 80 Mikrolitern 1X PBS CMF und zählen Sie die Zellen mit einer manuellen Zählkammer. Die Endothelzellen werden mit einer Dichte von 71.500 Zellen pro Quadratzentimeter auf den vorcodierten Einsatzfiltern in einem Volumen von 500 Mikrolitern warmer ECM ausgesät. Ersetzen Sie das Astrozytenmedium durch 1,5 Milliliter warme ECM pro Vertiefung.

Dann werden die ausgesäten Einsatzfilter in die Vertiefungen überführt, die die Astrozyten enthalten. Stellen Sie die Trikulturzellensysteme in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff. Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus dem oberen und unteren Fach mit einer Glaspipette, die mit einem Absaugsystem verbunden ist.

Ersetzen Sie das Medium durch warmes ECM in einem Volumen von 500 Mikrolitern im oberen Fach und 1,5 Milliliter im unteren Fach. Erneuern Sie das Medium jeden zweiten Tag bis zum sechsten Tag, indem Sie den gleichen Vorgang wiederholen. Schließlich legen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff wieder in den befeuchteten Inkubator.

Immunzytochemische Daten bestätigten die Expression konventioneller Marker wie Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktorrezeptor beta und Desmine für Perizyten und glialfibrilläres saures Protein für Astrozyten. Daher zeigt die Monoschicht aus hirnähnlichen Endothelzellen oder BLECs, die mit der adhärenten Verbindungsfärbung von Ve-Cadherin sichtbar gemacht werden, nach sechs Tagen Kultur mit den Perizyten und Astrozyten eine kontinuierliche Lokalisierung der TJ-Proteine CLD5 und Z-01 an den Zellgrenzen. Die parazelluläre Permeabilität von BLECS für fluoreszierende BBB-Integritätsmarker, Natriumfluorescein und FITC-Dextran wird hier gezeigt.

Die intrazelluläre Akkumulation von R123 in BLECs zeigte eine signifikante Zunahme der Anwesenheit des Effluxpumpeninhibitors Elacridar im Vergleich zum Kontrollzustand mit seiner Abwesenheit. Dies deutet auf das Vorhandensein von aktiven Effluxpumpmolekülen, nämlich P-Glykoprotein und Brustkrebsresistenzprotein oder BCRP, in den BLECs hin. Die Genexpression von Tight-Junction-Proteinen, Transportern und großmolekularen Rezeptoren, die durch die Expression von RPLP0 normalisiert wurden, wird hier gezeigt.

Hier entsprechen die Werte größer als eins einer höheren Genexpression im Triple-Kulturmodell. Die rote Linie entspricht einem Wert von eins, bei dem die Ausdrucksebene der beiden Modelle äquivalent ist. Das repräsentative Bild zeigt den Proteingehalt von Tight-Junction-Proteinen, Transportern, in großmolekularen Rezeptoren, die durch die Expression von Beta-Aktin normalisiert sind.

Der Transport von fluoreszenzmarkierten NIPAM-basierten neutralpolymeren Nanogelen wurde evaluiert. Zum Zeitpunkt Null wurden polymere Nanogele in einer Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter in das luminale Kompartiment gegeben. Nach 24 Stunden Inkubation wurden 5,82% der polymeren Nanogele im abluminalen Kompartiment gefunden, was ihre Fähigkeit beweist, die BLECs zu durchqueren.

Die korrekte Beschichtung und Aussaat der Perizyten auf dem revertierten Filter ist entscheidend. Wichtig ist die Aufrechterhaltung der Sterilität und Integrität der Strukturen, um eine Kontamination des Zellkultursystems zu vermeiden.