Diese Arbeit wurde durch die Gewährung von den National Institutes of Health (HL115578 A. Makino) unterstützt.

Die Forschung an Mäusen wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der University of Arizona genehmigt und wurde nach dem National Institute of Health (NIH) Richtlinien durchgeführt. HINWEIS: Die Ziffern 1, 2 und 3 sollte am Tag vor dem Experiment als Setup durchgeführt werden. 1. Vorbereiten Lösungen <ol><li> CD31-Puffer (50 ml) <ol><li> 50 ml 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in ein 50 ml Röhrchen. Man wiegt 0,05 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,037 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und zu der 50-ml-Röhrchen und setzen Sie den Schlauch für etwa 1 h bis das Pulver löst sich zu drehen. PH-Wert auf 7,4, filtriert durch ein 0,2 um-Filter in ein neues 50 ml Rohr und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit HEPES (500 ml) <ol><li> In 1,1915 g HEPES bis 10 mM HEPES in HBSS-Lösung zu machen und gut mischen. Messung des pH-Wertes und Einstellen auf 7,4. Filter und lagern bei 4˚C. </li></ol></li><li> 1x Kreb-Lösung (1 l) <ol><li> In 100 ml 10 × Kreb-Lösung [Tabelle 1] destilliertem Wasser in einem 1 - Liter - Kolben zu verdoppeln. Man wiegt 2,1 g Natriumbikarbonat und 2 g D-Glucose und fügen Sie in den Kolben. Mischen Sie und passen Sie das Gesamtvolumen auf 1 L. </li><li> Bubble - Lösung mit 95% O 2/5% CO &amp; sub2 ; -Gas für 30 min und Filterlösung im Innern der Haube. Lagerung bei 4 ° C und halten auf dem Eis während Experiment. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Magnetic Beads <ol><li> 1 ml CD31-Puffer in jede 1,5-ml-Röhrchen (ein Röhrchen pro Probe). Mischen Sie die Schaf - Anti-Ratten - IgG - Perlen und fügen Sie die entsprechende Menge zu jeder Probe [Tabelle 1]. Schütteln Sie die Röhrchen kräftig 30 Mal und legen Sie sie in der magnetischen Platte für 1 min schütteln. Öffnen Sie die Rohre während auf der Platte und Dump-Lösungen in einen Eimer. </li><li> 1 ml CD31 Puffer in jedes Röhrchen. Hinzufügen 2 &amp; mgr; l Ratten-anti-Maus-CD31 AntiKörper in jedes Röhrchen und drehen Rohre O / N bei 4 ºC. </li></ol> 3. Autoklavierung <ol><li> Autoclave alle chirurgische Werkzeuge und Pipettenspitzen. Schneiden Sie die Enden der Pipettenspitzen, so dass es Spitzen mit 4 verschiedenen Durchmessern, von breitesten engste. Ungefähren Durchmesser für die Spitzen sind 3 mm, 2,5 mm, 2 mm und 1,5 mm. Schneiden Sie die Spitzen und Autoklaven am Tag vor der mit 30 Minuten der Sterilisation bei einer Temperatur von 121 ° C. HINWEIS: Sections 4-11 sollte am Tag des Experiments durchgeführt werden. </li></ol> 4. Vorbereitung Lösungen <ol><li> Bereiten Waschpuffer mit 2% Eisen angereicherte Kälberserum (IFCS) in M199. Für die Bildgebung, Herstellung von 30 ml / Maus. </li><li> Bereiten Enzymlösung (10 ml / Probe). Wiegen 0,6 Einheiten / ml Dispase und 1 mg / ml Kollagenase Typ II in ein 50 ml Röhrchen. In M199 und drehen Sie das Rohr bei 4 ° C für 15 min. Man filtriert durch 0,2 um Filter in eine neue 50-ml-Tube inside die Haube und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie HBSS / HEPES mit Heparin. 10 ml HBSS mit 10 mM HEPES in 15-ml-Tube. 100 l Heparin auf das Rohr und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 5. Waschen Sie die Perlen <ol><li> Nehmen Sie die Röhrchen mit Perlen aus dem Rotor bei 4 ° C und an der Haube zu bringen. Die Röhrchen in der magnetischen Platte und schütteln für 1 min. Sichern Sie die Lösung und 1 ml CD31 Puffer in jedes Röhrchen. </li><li> Nehmen Sie die Rohre aus der Magnetplatte und kräftig schütteln, 30-mal. Setzen Sie die Rohre in der magnetischen Platte zurück und wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. Nach der Fertigstellung setzen die Rohre 4 ° C zurück und halten bis zur Verwendung drehen. </li></ol> 6. Dissection <ol><li> Injizieren die Mäuse intraperitoneal mit 0,1 ml Heparin Blutgerinnungs zu verhindern. Warten Sie 10 Minuten, dann betäuben die Mäuse intraperitoneale Injektion von 0,01 ml Pentobarbital verwendet. Überprüfen Sie, ob die Maus fühltSchmerzen, die durch den Fuß einklemmen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer Polystyrolplatte mit Kopf nach oben und halten Sie die Arme mit Stiften. Verwenden einer Pinzette und zäh-cut-Schere die Haut an der oberen Brustbereich zu schneiden bis zum Hals. </li><li> Machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Brustkorbs knapp über der Membran. Schneiden Sie den Knochen seitlich und nach oben in Richtung der Kehle ein Dreieck zu machen Aussetzen des Herzens und der Lunge. Schneiden Sie die Aorta knapp über der Membran. </li><li> Halten Sie die Thymusdrüse mit einer Pinzette, ohne zu ziehen und mit einer Schere jede Bindegewebe zu schneiden sorgfältig Lunge und Herz zusammen zu entfernen. Platz Gewebe in einem Becherglas mit 1 × Kreb, schütteln mit einer Pinzette und Transfer zu 6 cm Schale mit 1 × Kreb. </li><li> Entfernen Sie die Lungenlappen mit einer Schere und Pinzette. Legen Sie eine 20 G sterile Katheter in die Aorta. Spülen Sie das Blut in das Herz-Kreislauf-System mit HBSS / Heparin. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Ventrikel, schütteln das Herz und Transfer in ein Probenröhrchen von M199. Halten Sie Röhrchen auf Eis. </li></ol><p<html> class = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. Tissue Verdauung <ol><li> Übertragen Sie das Herz auf eine 6 cm Schale mit 10 ml Enzymlösung gefüllt und Hackfleisch in kleine Stücke mit einer Schere. Die Schalen werden in den 37 ° C Inkubator für 15 min. Rühre verdauten Materialien durch Auf- und Abpipettieren 30 mal durch eine Spitze mit einem abgeschnittenen Ende das Gewebe zu ermöglichen, durch leichter zu passieren. </li><li> Legen Sie es für weitere 15 Minuten im 37 ° C-Inkubator zurück. Wiederholen Aufregung drei Mal, jedes Mal mit Pipettenspitzen von größten Öffnungen engste und 15 min Inkubation zwischen den einzelnen. </li><li> Nach letzten 15 min Inkubation Proben zu nehmen und in die Haube. Pipettieren Lösung nach oben und unten 30-mal mit Pipettenspitze mit der engsten Öffnung und durch ein 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb in eine neue 50-ml-Tube. </li><li> Waschen Sie die Schale mit 10 ml Waschpuffer eine 10 ml Pipette und übertragen auf Zellsieb verwenden. Stellen die 50-ml-Röhrchen in der Zentrifuge und Schleudern bei 400 g für 10 min bei RT. </li></ol>itle &quot;&gt; 8. Waschen und Konjugation mit Perlen <ol><li> Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Wash-Zellen mit 5 ml Waschpuffer zweimal. </li><li> Holen Sie sich eines der zuvor 1,5 ml Röhrchen hergestellt mit Perlen und die Arbeit an einem Rohr zu einem Zeitpunkt. Setzen Sie ein 1,5-ml-Röhrchen in der magnetischen Platte, schütteln 3-mal und öffnen. </li><li> Nach dem letzten Zentrifuge, entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Distanziere die Zellklumpen durch kräftiges Ausklopfen. </li><li> 1 ml Waschpuffer zu den 50-ml-Röhrchen und Mischen der Zellen mit einer 1 ml Pipette. Sichern Sie die Lösung aus dem 1,5-ml-Röhrchen und 1 ml Zellsuspension aus dem 50-ml-Röhrchen an die Kügelchen. Flick die Rohre 30-mal drehen dann bei 4 ° C für 30 min. </li></ol> 9. Vorbereitung für Zellkultur / Imaging <ol><li> Bereiten Kammern für Zellen Plattierung. In Gelatinelösung (5% w / v, 300 &amp; mgr; l) in die Kammer und die Oberfläche zu beschichten und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Nach der Inkubation remove Gelatine und trocken die Oberfläche. </li><li> Nehmen Sie die Röhrchen mit Perlen / Zellen nach 30 min Dreh und in der Magnetplatte im Inneren der Kapuze setzen. Schütteln für 2 min, dump und 1 ml Waschpuffer. </li><li> Nehmen Sie Rohre aus der Platte, kräftig schütteln, 30-mal dann flick 30 mal. Setzen Sie sie in Magnetplatte zurück und schütteln für 1 min. Wiederholen 4 mal für insgesamt 5 Wäschen, jedoch mit 1 min auf der Platte ausgeschüttelt. </li><li> Nach der letzten Waschung, nehmen Sie einen Schlauch heraus und zu einer Zeit, an jedem Rohr ein arbeiten. Schütteln Sie 30-mal dann 30-mal Flick. Legen Sie es auf der Magnetplatte und schütteln für 1 min. Dump und 1 ml 20% IFCS EG-Medien (vorgewärmt auf 37 ° C). </li><li> Kräftig schütteln 30 mal Flick dann 30-mal. Stellen Sie pipettieren bis 500 &amp; mgr; l und pipettieren nach oben und unten 10-mal. Übertragen Sie 500 ul zu jeder Kammer. </li><li> Setzen Sie bei 37 ºC-Inkubator und lassen O / N. Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit 10% FBS EG-Medien. </li></ol> 10. Vorbereitungen für die Western Blot (WB) Proben <ol><li> Take aus der Röhrchen mit Perlen / Zellen nach 1 Stunde der Rotation. Setzen Sie sie in der magnetischen Platte und schütteln für 2 min. Dump Überstand und 1 ml kaltem HBSS. Kräftig schütteln 30 mal Flick dann 30-mal. Wiederholen Sie zweimal für 3 Waschungen, aber mit 1 min auf der Platte schütteln. </li><li> Nach dem letzten Waschen, legen Rohre auf Magnetplatte und schütteln für 1 min. Entfernen Pufferpipette und Lyse der Zellen für WB unter Verwendung eines Verfahrens zuvor 11,12 beschrieben. Gesammelte Lysat enthält in der Regel etwa 30 ug Protein. </li></ol> 11. Imaging <ol><li> Waschen Sie die Zellen 3 mal mit Medien, mit der endgültigen Volumen von 250 &amp; mgr; l für eine Kammer. Fügen 1,5 ul Dil-acLDL zu den Zellen. Von diesem Punkt halten die Zellen im Dunkeln. </li><li> Inkubieren für 3,5 Stunden bei 37 ° C. In 1,5 ul Hoechst, gut mischen und Inkubation für 30 min bei 37 ˚C.Wash Zellen mit PBS und fixieren mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT. </li><li> Zweimal waschen mit PBS und Block mit 5% BSA-PBS für 30 min bei RT. Wasche zweimal mit 1% BSA-PBS. Verdünnte BS-Lectin-FITC unter Verwendung von 1% BSA-PBS auf eine Konzentration von 2 ug / ml und 300 &amp; mgr; l zu jeder Kammer. </li><li> Setzen Sie die Kammer auf dem Orbitalschüttler bei RT für 30 min. Waschen mit PBS 3 mal. </li><li> Visualisieren Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop mit Belichtungszeit von 200 ms für FITC (Lektin-Färbung, eine EG-Marker, Anregung / Emission 488 nm / 519 nm), 30 ms für DAPI (Hoechst, eine Kernfärbung, Anregung / Emission bei 358 nm / 461 nm) und 300 ms für TRITC (acLDL Färbung, eine EG-Marker, Anregung / Emission bei 557 nm / 576 nm). Erwerben Sie Bilder mit einem 20X Objektiv verwendet wird. </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Die am häufigsten verwendeten Endothelzellen in Forschung sind menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) wegen ihrer Bequemlichkeit und Leichtigkeit der Kultivierung. Jedoch erfordert eine Menge Forschung die Verfügbarkeit eines physiologischen Modells durch die Isolierung von Endothelzellen aus anderen spezifischen Organen 10 erreicht. Endothelial-Zellen machen einen sehr geringen Population von Zellen in dem Herzgewebe auf; ihre Isolation und Kultivierung kann sich als sehr schwierig erwiesen. ...

Mausmodelle verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen und Stoffwechselstörungen tragen physiologischen und molekularen Veränderungen, die mit denen in Patienten gefunden ähnlich sind. Weiterhin ist die genetische Veränderung von Mäusen ein leistungsfähiges Werkzeug, das uns die pathogene Rolle spezifischer Gene bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheiten zu untersuchen erlaubt. Heutzutage zelltypspezifische Gen-Knock-in oder -out Mäuse werden in vielen Labors und die Messung von mRNA und Protein-Ebene in spezifischen Zelltypen ist der erste Schritt bei der Bestimmung, ob die Mäuse wurden wirklich genetisch veränderten leicht erzeugt. Das Endothel ist eine dünne einzelne Schicht aus Endothelzellen (ECs), die Linien der inneren Gefäßwand. Endothelial - Zellen spielen eine entscheidende Rolle 1,2 Gefäßspannung, die vaskuläre Permeabilität und neue Gefäßbildung bei der Regulierung. Endotheliale Dysfunktion ist ein Markenzeichen vieler pathologischer Zustände und Veränderungen in der Endothelfunktion zu verschiedenen Auto führen kannKreislauf- Erkrankungen 3,4. Es ist somit signifikant die Funktion von Endothelzellen unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Es gibt mehrere Möglichkeiten , um ECs isolieren 5-8 und die Isolierungsmethode muss optimiert werden , abhängig von dem Gewebe und Arten verwendet. Dies liegt daran , ECs aus verschiedenen Geweben hinsichtlich ihrer Oberflächenmarker und Proteinexpression 9 eine hohe Heterogenität anzuzeigen. Erfolgreiche Isolierung von Endothelzellen kann oft schwierig sein und erfordert ein gewisses Maß an Ausbildung und Praxis. Einmal erreicht, erweist sich die Methode der Isolierung in diesem Protokoll vorgeschlagen, stabil und effizient zu sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, Maus koronarer ECs (MCECs) von hoher Qualität und Quantität zu erhalten. Auch wenn die Menge der Zellen, die aus einem Herzen gesammelt weniger als aus anderen Geweben gesammelten Zellen unter Verwendung anderer Techniken, diese Technik bietet noch better Qualität. Die Reinheit von Endothelzellen in der resultierenden Population größer ist als 90%. Somit wäre diese Technik ideal für Anwendungen, die auf rein isolierten Endothelzellen verlassen wie Cell Imaging.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads pan mouse IgG beads&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD31 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (Neutral Protease)</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ml</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>Heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-Valine</td><td>Sigma</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>Corning</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of mouse coronary endothelial cells

Endothelzellen kleiden die Innenwand der Blutgefäße und eine wichtige Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus, vaskuläre Permeabilität spielen und neue Gefäßbildung. Endothelzelldysfunktion ist in der Entwicklung und dem Fortschreiten vieler kardiovaskulärer Erkrankungen, einschließlich ischämischer Herzkrankheit beteiligt ist. Um die Funktion und Charakterisierung von koronaren Endothelzellen untersuchen, Zellisolierung ist der erste Schritt, und es erfordert eine hohe Reinheit und Menge zur nachfolgenden Experimenten durchzuführen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren adulten Maus-Koronar-Endothelzellen zu isolieren. Die Maus Herz wird in kleine Stücke zerschnitten und zerkleinert. Nach der Verdauung des Herzens unter Verwendung Dispase und Kollagenase II werden die Zellen gewaschen und mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD31-Antikörper konjugiert sind. Die Kügelchen mit Endothelzellen sind mehrmals gewaschen und bereit sind, in verschiedenen Anwendungen zu verwenden, einschließlich Bildgebung und molekularbiologische Experiments. Effiziente Isolierung ergibt etwa 10 4 Zellen pro ein Herz mit über 90% Reinheit.

Die erfolgreiche Isolierung von koronaren Endothelzellen aus einer Maus Herz ergibt typischerweise etwa 10 4 Zellen mit über 90% Reinheit mit einer gepflasterten Form. Für eine reine Population von Endothelzellen, Vorsicht sollte im gesamten Protokoll genommen werden, um eine sterile Umgebung, die frei von jeglicher Verunreinigung zu gewährleisten. Das Auftreten von länglichen Zellen oder vergrößerten Zellen innerhalb der Population zeigt an Kontamination mit anderen Zel...

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Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Aufrufe.  University of Arizona, Tucson. This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Serie: Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biologie

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Neurowissenschaften

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunologie und Infektion

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in the endothelium at the transcriptomic and epigenomic levels, resulting in proatherogenic responses. Recently, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies were performed to determine the transcriptomic and chromatin accessibility changes at a single-cell resolution using the mouse partial carotid ligation (PCL) model. As endothelial cells (ECs) represent a minor fraction of the total cell populations in the artery wall, a luminal digestion method was used to obtain EC-enriched single-cell preparations. For this study, mice were subjected to PCL surgery to induce d-flow in the left carotid artery (LCA) while using the right carotid artery (RCA) as a control. The carotid arteries were dissected out two days or two weeks post PCL surgery. The lumen of each carotid was subjected to collagenase digestion, and endothelial-enriched single cells or single nuclei were obtained. These single-cell and single-nuclei preparations were subsequently barcoded using a 10x Genomics microfluidic setup. The barcoded single-cells and single-nuclei were then utilized for RNA preparation, library generation, and sequencing on a high-throughput DNA sequencer. Post bioinformatics processing, the scRNAseq and scATACseq datasets identified various cell types from the luminal digestion, primarily consisting of ECs. Smooth muscle cells, fibroblasts, and immune cells were also present. This EC-enrichment method aided in understanding the effect of blood flow on the endothelium, which could have been difficult with the total artery digestion method. The EC-enriched single-cell preparation method can be used to perform single-cell omics studies in EC-knockouts and transgenic mice where the effect of blood flow on these genes has not been studied. Importantly, this technique can be adapted to isolate EC-enriched single cells from human artery explants to perform similar mechanistic studies.

We present a method for isolating endothelial cells and nuclei from the lumen of mouse carotid arteries exposed to stable or disturbed flow conditions to perform single-cell omics experiments.

Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...