Wir möchten Andrea Portbury für die kritische Durchsicht des Manuskripts, das Mikroskop Service Labor von UNC für die Unterstützung bei der Zeitraffer-Bildgebung und die NIH (grant # R01HL061656) für finanzielle Unterstützung danken.

1. Bereiten Antikörper-konjugierten Beads <ol><li> Einen Tag vor der Dissektion, kombinieren die Antikörper der Wahl mit den entsprechenden Dynabeads (zB Ratte IgG Dynabeads für einen Antikörper bei Ratten erhöht, 4 x 10 8 Perlen / ml) pro Anweisungen des Herstellers. Für die BD Ratte anti-CD31-Antikörper (0,5 ug / ul, verwendet werden, um Endothelzellen isolieren), wird 3 ul Antikörper für jeweils 25 ul Perlen hinzugefügt, für eine endgültige Konzentration von 1,5 ug anti-CD31-Antikörper und 1 x 10 7 Perlen / 25 ul Puffer. </li><li> Inkubieren Perlen und Antikörper über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung der Collagen Teller <ol><li> Isolierte Zellen bilden Tubuli schneller als auf einem Kollagen-Gel gewachsen als lediglich eine Kollagen-beschichtete Platte entgegen. Daher sind Kollagengelen machte die Nacht vor der Dissektion, wie in 6 beschrieben. Auf dem Eis in einer Gewebekultur Kapuze, kombinieren Sie die folgenden Reagenzien (ausreichend für 19 Wells): 206,4 ul sterilem H &lt;sub&gt; 2 O, 140,4 ul Kollagen Typ I (4,08 mg / ml), 38,4 ul 10x M199 und 1,15 ul 5 M NaOH. </li><li> Pipette 20 ul dieses Kollagen-Gel in die Vertiefungen einer 384-well Gewebekulturplatten. Legen Sie die Platte in einem 37 ° C Gewebekulturinkubator für 30 min. </li><li> In 80 ul DMEM in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei 37 ° C Entfernen Sie das Kulturmedium und wiederholen Sie noch zweimal. </li><li> Nach dem letzten Spülgang, fügen Sie 80 ul 10% FBS / DMEM in jede Vertiefung und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. Entfernen des Kulturmediums vor der Zugabe der isolierten Zellen. </li></ol> 3. Verbrauchsteuern und die Digest Herz <ol><li> Euthanize eine Zeitfahr-schwangeren Maus an der gewünschten embryonalen Tag mit einem zugelassenen Euthanasie Technik. Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt. </li><li> Mit der Maus in Rückenlage, großzügig sprühen die Bauchseite des Weibchens mit 70% Ethanol vorDissektion. Mit einer Pinzette, um den unteren Bauch-Haut und Muskeln abzuheben von den inneren Organen, aufschneiden der weiblichen unteren Bauchraum um die inneren Organe zu visualisieren. </li><li> Halten Sie den Muttermund mit einer Pinzette vorsichtig geschnitten kaudal der Zange und beginnen die Aufhebung des Uterushorn aus der Bauchhöhle. Während die Aufhebung des Uterushorns, wegschneiden jede Bindegewebe, das Horn an ihrem Platz hält. Zum Abschluss Ausschneiden des Uterushorns, schneiden Sie die Kreuzung der Uterushorns mit den Eileiter, die Uterushorns befreien. </li><li> Legen Sie die Uterushorns in eine Petrischale mit kaltem 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und spülen Sie nach Bedarf. Schneiden Sie die Uterushorns über der Mittellinie, um die angeschlossenen embryonalen Säcke freizulegen. </li><li> Schneiden Sie einen Fruchtblase an der Kreuzung von der Plazenta und den Embryo zu vermeiden, versehentlich Schneiden der Embryo ein Embryo und abrufen. Setzen Sie den Embryo in einer zweiten Petrischale mit kaltem PBS. Bringen Sie die Petrischale mit dem Uterushorn zu Eis. </li><li> Decapitate des Embryos, um den Zugriff auf die Brustwand zu verbessern. Wenn Genotypisierung notwendig ist, schneiden Sie den Schwanz, um es zu entfernen und speichern in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis gelegt. </li><li> Mit dem Embryo auf dem Rücken, schnitt den Brustwand, um das Herz und die Lunge zu visualisieren. Um zu vermeiden, schneiden das Herz, einen vertikalen Schnitt entlang der Seite des Brustkorbs, nahe einem Vorderbein, durch einen horizontalen Schnitt über der Unterseite der Rippen gefolgt, dann, ziehen Sie die Brustwand und aus dem Weg. Bis in etwa embryonalen Tag 13,5, ist die Brustwand transparent, Unterstützung in der Visualisierung. </li><li> Heben Sie das Herz mit einer Pinzette und schneiden Sie die Schiffe unten. Dann, vor den großen Gefäßen geschnitten, um das Herz zu befreien. Wenn die Lungengefäße nicht geschnitten werden, kann die Lunge mit dem Herzen entfernt werden. So entfernen fremden Gewebe wie Lunge, falls erforderlich. </li><li> Trennen und entsorgen Sie die Vorhöfe und der großen Gefäße aus den Herzkammern. Mit einer Schere zerkleinern die Ventrikel in kleine Stücke (ca. 1 mm 3 &lt;/ Sup&gt;) und in etwa 500 ul Kollagenase (1 mg / ml in sterilem PBS). Die Proben auf Eis, bis alle Kammern haben gehackt worden und in Kollagenase. </li><li> Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis die Ventrikel aus allen Embryonen herausgeschnitten haben, sammeln jedes Herz in einem separaten Eppendorf-Röhrchen. Wenn alle Embryonen die gleiche Genotyp haben, können in einem einzigen Herzen Eppendorf-Röhrchen gepoolt werden. Die Anzahl der Proben zu einem einzigen Zeitpunkt verarbeitet werden, können auf der Grundlage der Magnet für die Isolierung verwendet beschränkt werden, die Dynamag (123-21D) verwendet hier hält maximal 16 Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Legen Sie die gehackte Ventrikel bei 37 ° C unter Schütteln für 45 min. Alle 15 min, entfernen Sie vorsichtig die Proben und Pipette auf und ab, um mechanisch distanzieren die Zellen. </li></ol> 4. Isolierung der Endothelzellen <ol><li> Führen Sie das Ventrikel-Kollagenaselösung durch ein 70 um-Filter, um weitere Klumpen von Zellen zu entfernen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 g für 10 min. Verwerfender Überstand mit rund 200 ul 10% FBS in DMEM ersetzen und Pipette auf und ab, um die Zellen zu distanzieren. </li><li> Wiederholen Sie den vorherigen Schritt einmal. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 g für 10 min nach der zweiten 10% FBS / DMEM waschen. Die Zellen in 50 ul 10% FBS / DMEM. </li><li> Während der letzten Zentrifugationsschritt, bereiten Sie die Perlen. <ol><li> Legen Sie die Eppendorf-Röhrchen, die den Antikörper und Perlen auf einem Magneten für 1 min. </li><li> Mit dem Rohr an Ort und Stelle auf dem Magneten, entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie den Schlauch vom Magneten und fügen etwa 100 ul 10% FBS / DMEM. </li><li> Legen Sie das Rohr auf der Magnet für 1 min. Entfernen Sie den Überstand und wäscht nochmals mit 10% FBS / DMEM. Wiederholen für insgesamt 3 wäscht. </li><li> Nach dem letzten Waschen, resuspendieren Antikörper-konjugierten Perlen in 10% FBS / DMEM (5 ul pro Probe). </li></ol></li><li> Zu jeder Zelle Probe 5 ul der Antikörper-konjugierten Perlen. Legen Sie die Perlen-Zell-Suspensionen bei 4 ° C unter Schütteln for 30 min. </li><li> In einer Laminarströmungshaube, legen Sie die Eppendorf-Röhrchen, die Zellen und Antikörper-konjugierten Perlen auf dem Magneten für 1 min. Entfernen Sie den Überstand, entfernen Sie die Rohre aus dem Magneten und waschen mit ca. 100 ul 10% FBS / DMEM. Wiederholen Sie dies für 5 Wäschen. </li><li> Nach dem letzten Waschen, legen Sie die Rohre auf der Magnet für 1 min, den Überstand entfernen, und entfernen Sie die Rohre von dem Magneten. In etwa 100 ul DMEM. </li><li> Legen Sie die Rohre auf der Magnet für 1 min, den Überstand entfernen, und entfernen Sie die Rohre von dem Magneten. 100-200 ul vorgewärmt 0,25% Trypsin-EDTA. Inkubieren der Proben bei 37 ° C und 5% CO 2 für 5 min. </li><li> Legen Sie die Rohre auf den Magneten für 2 min. Sorgfältig übertragen die Zellen enthaltende Überstand in frische Eppendorf-Röhrchen. Zentrifugieren für 5 min bei 400 x g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. Die Zellen in 80-100 ul Wachstumsmedium und Platte in einer 96 - oder 384-Well-Kulturschale behandelt, abhängig von der erwarteten Ausbeute(Ca. 450-600 Zellen aus den Herzkammern E14.5-E16.5 Embryonen). Für Endothelzellen, verwenden endothelial growth Kulturmedium (nachstehend definiert). </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media.">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li><li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Arbeiten mit primären embryonalen Zellen ermöglicht neuartige Experimente in vitro kritischen Schritte der Entwicklung zu befassen. Allerdings ist das Verfahren zur Isolierung nicht trivial. Kritische Schritte zur Isolierung jede Art von Zellen auch gewährleistet, dass die Zellen gut auf Kollagenaseverdau getrennt und dann, dass sie gut in den Waschschritten suspendiert. Mechanische Präparation durch Pipettieren sehr hilft Trennung der Zellen während der Kollagenase Schritt, und der Schritt des Filterns en...

Das Aufkommen der immortalisierten Zelllinien revolutioniert hat grundlegende zellbiologische 1. Die derzeit verfügbaren Zelllinien werden aus einer Vielzahl von Organen abgeleitet und sind alle wichtigen Zelltypen. Allerdings haben etablierte Zelllinien einige Einschränkungen. Verfahren nach Immortalisierung offensichtlich verändert das Verhalten der Zellen, insbesondere in Bezug auf Lebensdauer und Proliferation, kann aber auch Einfluss auf die Expression von unerwarteten Proteine ​​wie Zytoskelettproteinen 2. Darüber hinaus, obwohl viele verschiedene Zelllinien zur Verfügung stehen, gibt es erhebliche Vielfalt selbst unter einem Zelltyp in einem gesamten Organismus. Endothelzellen zeigen insbesondere diverse Verhaltensweisen, ob sie Linie Arterien oder Venen und welche Art von Flow ist in dem Gefäß 3 basierend. Noch Pressen aus einer Entwicklungsstörung Sicht ist jedoch, dass die überwiegende Mehrheit der verfügbaren Zelllinien aus adultem Gewebe abgeleitet sind (siehe zB ter Sammlung via ATCC). Diese Erwachsenen Zelllinien wahrscheinlich nicht rekapitulieren die dynamische Natur von ihrer embryonalen Vorstufen. Die sich rasch verändernden Raumzeit Genexpression während der Entwicklung beobachtet auch darauf hin, dass ein Endothelzellen von einem Organ in einem bestimmten Entwicklungsstadium verhalten sich möglicherweise nicht auf die gleiche Weise als Endothelzellen von demselben Organ in einem anderen Entwicklungsstadium. Als Alternative zur Verwendung von kommerziell erhältlichen immortalisierten Zelllinien können primäre Zellen aus dem spezifischen Gewebe von Interesse isoliert werden. Zu den Vorteilen dieser Technik können diese primären Zellen aus einem bestimmten Organ oder Teil eines Organs zu einem bestimmten Entwicklungsstadium isoliert werden. Weiterhin können diese primären Zellen aus der Vielzahl der verfügbaren transgenen Tieren isoliert werden, so dass die in-vitro-Studie von Gen-Knockout-und Knock-in werden, ohne andere Probleme wie Transfektionseffizienz. Nicht überraschend, vieleTechniken wurden veröffentlicht detailliert, wie zu isolieren spezifischen Zelltypen 4,5. Im Allgemeinen beinhalten diese Verfahren das Sammeln der Region von Interesse, dissoziieren die Zellen, Markieren des spezifischen Zelltyp von Interesse und das Isolieren die Zellen zur weiteren Analyse. Um einen frühen embryonalen Population von koronarer Endothelzellen zu untersuchen, haben wir unten skaliert eine zuvor veröffentlichte Verfahren 4 zur Verwendung mit einem kleineren Organ. Mit diesem verkleinerten Verfahren können wir die koronare Endothelzellen aus dem embryonalen Herzen zu bestimmten embryonalen Stadien isolieren. Diese Zellen können dann in herkömmlichen Assays Endothelzellen wie Migration Analysen verwendet werden. Bis frühen embryonalen Zelllinien häufiger geworden, die Arbeit mit den primären Zellen ist ein unschätzbares Technik.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Timed-pregnant mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-mouse CD31</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat IgG Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>110-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>F2442 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>(made in lab as described in notes)</td>
			<td></td>
			<td>DMEM containing 20% FBS, 5 &mu;M &beta;-mercaptoethanol, 50 &mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECGS</td>
			<td>Biomedical Technologies, Inc.</td>
			<td>BT-203</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>384-well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>T-3037-6</td>
			<td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>BD</td>
			<td>354236</td>
			<td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199, 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Syto-16</td>
			<td>Invitrogen </td>
			<td>S7578 </td>
			<td>Used as directed in 13 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Nikon </td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo </td>
			<td>3110 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DynaMag</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Table-top centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

Zellkultur hat unsere Fähigkeit, einzelne Populationen von Zellen unter Kulturbedingungen unzähligen beurteilen verbessert. Während immortalisierten Zelllinien signifikante Vorteile für ihre Benutzerfreundlichkeit bieten, sind diese Zelllinien nicht für alle möglichen Zelltypen. Durch die Isolierung primärer Zellen aus einer bestimmten Region von Interesse, insbesondere aus einer transgenen Maus, können nuancierter Untersuchungen durchgeführt werden. Die grundlegende Technik beinhaltet Sezieren des Organs oder teilweise Organ von Interesse (zB das Herz oder einen bestimmten Bereich des Herzens) und Dissoziation des Organs, um einzelne Zellen. Diese Zellen werden dann mit magnetischen Kügelchen, konjugiert mit einem Antikörper, der interessierenden Zelltyp erkennt inkubiert. Die Zellen von Interesse kann dann mit Hilfe eines Magneten getrennt werden, mit einer kurzen Inkubation Trypsin Dissoziation der Zellen von den Kügelchen. Diese isolierten Zellen können dann gezüchtet und analysiert werden, wie gewünscht. Diese Technik wurde ursprünglich für erwachsene Maus Orgel konzipierts, kann aber leicht nach unten skaliert werden für die Verwendung mit embryonalen Organe, wie hier gezeigt. Denn unser Interesse ist in der Entwicklung einer koronaren Gefäßsystem, wollten wir diese Population von Zellen in bestimmten embryonalen Stadien zu studieren. Somit hatte die ursprüngliche Protokoll geändert werden, um die Kompatibilität mit der geringen Größe der embryonalen Ventrikel und der geringen Ertragspotenzial von Endothelzellen in diesen Entwicklungsstadien werden. Mit Hilfe dieser abgespeckte Ansatz haben wir koronaren Plexus Umbau in transgenen embryonalen ventrikuläre Endothelzellen beurteilt.

Verwendung eines Endothelzellen-spezifischen Antikörper, der CD31 erkennt, wurden Endothelzellen aus den Ventrikeln des embryonalen (E) 13,5 (1A) und 18,5 (1B-1D) Embryonen isoliert. Wenn auf einer unbehandelten Kulturschale gezüchtet, diese Zellen bleiben gerundet und würde eine Kopfsteinpflaster-Muster bilden, wenn in der Nähe konfluent (Abb. 1A). Verdünnen Kollagen hat auch zur Beschichtung verwendet die Vertiefungen, und während die Endothelzellen an (...

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Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Primäre Zellkultur ist eine nützliche Technik für die Analyse von spezifischen Populationen von Zellen, insbesondere von transgenen Maus-Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien. Hierin werden embryonalen Ventrikel seziert und distanziert, und Antikörper-konjugierten Perlen erkennen und trennen die Endothelzellen für die weitere Analyse.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Aufrufe.  University of North Carolina at Chapel Hill. Primäre Zellkultur ist eine nützliche Technik für die Analyse von spezifischen Populationen von Zellen, insbesondere von transgenen Maus-Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien. Hierin werden embryonalen Ventrikel seziert und distanziert, und Antikörper-konjugierten Perlen erkennen und trennen die Endothelzellen für die weitere Analyse.

Serie: Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Forschung

Biologie

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Embryonale Stammzellen gewonnenen Endothelzellen zur Behandlung von Ischämie Hinterlauf

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...