Wir danken Pr. Bernard La Scola für hilfreiche technische Ratschläge und interessante Diskussion über Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung. Wir danken auch Dr. Vincent Thomas für seine Hilfe bei der Umsetzung der Technik in unserem Labor.

1. Amöben Cokultur 1.1 Probenvorbereitung <ol><li> Umweltproben <ol><li> Wasserproben Filtern Sie die Wasserprobe (500 ml auf 1 L) durch einen 0,22 um Porengröße Membran. Dann schütteln Sie die Membran in Pages Amöbe Salzmedium PAS (120 mg NaCl, 4 mg MgSO 4 • 7H 2 O, 4 mg CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg Na 2 HPO 4 und 136 mg KH 2 PO 4 in 1 l destilliertem Wasser). </li><li> Feste Proben Resuspendieren festen Proben wie Erde oder Sand Proben und halbfesten Proben wie Belebtschlamm in destilliertem Wasser oder PBS und filtern sie durch einen 0,22 um Porengröße Membran. Dann schütteln Sie die Membran in PAS. </li><li> Proben mit endogenen Amöben und Protozoen hoch belasteten Erste sedimentieren die Proben durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (180 xg) for 10 min oder filtern sie durch eine 5 um Porengröße Membran. Weiterzuverarbeiten den Überstand (bzw. Filtrat), wie in 1.1.1. Hinweis: Andere Dekontaminationsverfahren könnte verwendet werden, um weiter zu dekontaminieren Umweltproben werden: Erhitzen Sie die Probe bei 50 ° C für 30 min oder Behandlung mit sauren oder basischen Lösungen 14. </li></ol></li><li> Klinische Proben Verarbeitung klinischer Proben in Abhängigkeit von ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften. Filter oder Zentrifuge Flüssigkeiten zu großen Verunreinigungen zu entfernen. Resuspendieren festen Proben. Um Gewebe zu verwenden, schleifen sie zum Beispiel durch die Verwendung eines Dounce homogeneiser oder Glasperlen und Lyse der Zellen, die intrazellulären Bakterien zu befreien. </li></ol> 1.2 Amöben Vorbereitung <ol><li> Bouillon Vorbereitung Bereiten Sie die folgenden Medien: eine reiche Medien mit Pepton, Hefeextrakt und Glucose (PYG, 100 g Proteosepepton, 10 g Hefeextrakt, 4,9 g MgSO 4 • 7H 2O, 5 g Natriumcitrat • 2H 2 O, 0,1 g Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g KH 2 PO 4, 1,97 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g Glucose und 0,295 g CaCl 2 in 5 l destilliertem Wasser) und einem nicht-Nährmedium wie PAS für Acanthamoeba Spezies. </li><li> Amöbenkultur <ol><li> Pflegen Amöben (vorzugsweise Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 oder A. polyphaga Linc-AP1) bei 25 ° C in Zellkulturflaschen mit 30 ml PYG Medium. </li><li> Ernten Sie die Amöben durch kräftiges Schütteln der Flasche und Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 1.500 x g. Zweimal Waschen des Pellets mit PAS Medium. Zählen Sie die Zellen in einer Kova Rutsche und die Lautstärke anpassen, um eine Suspension von 5 x 10 5 Zellen pro ml zu erhalten. </li><li> Übertragen Sie die Amöbensuspension in Mikroplatten. Verwenden Sie 1 ml pro Vertiefung für 12 - und 24-well Platten, 500 ul für 48-Well-Platten und 300 ul für 96-Well-Platten. Die Mikrotiterplatte für mindestens 2 h bei 25 ° C. Dies ermöglicht Sedimentation und Anhaftung der Amöben zum Boden jeder Vertiefung. </li></ol></li></ol> 1.3 Cokultur <ol><li> Beispiel Impfung <ol><li> Inokulieren die Platte aus 2.3.3 mit seriellen Verdünnungen der Probe von 1.1 oder 1.2 in der Regel mit 10-fach-Verdünnungsreihe, beginnend mit 100 ul der unverdünnten Probe. </li><li> Zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatte bei 1.800 g für 10 min auf Sediment auf dem Rasen Amöben die Mikroorganismen möglicherweise in der Probe vorhanden. Dies erhöht die Kontakt und Phagozytose von Mikroorganismen durch Amöben. </li><li> Die Inkubation für 45 min bei 25 ° C und dreimal mit PAS durch Austausch der Medien mit frischen PAS. 1 ml pro Vertiefung von PAS mit oder ohne Zusatz von Antibiotika (Streptomycin, Penicillin, Gentamycin und / oder Vancomycin), abhängig von den bakAl-Spezies, nach dem gesucht werden. </li><li> Die Mikrotiterplatte bei 32 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre, um Verkapselung der Amöben vermeiden. Beachten Sie jeweils auch täglich mit einem 20x-Objektiv, um die Anwesenheit von Bakterien eindringen und Lyse Amöben zu erkennen. </li><li> Im Falle der Lyse führen eine Subkultur auf frischen Amöben durch Inokulation von 100 &amp;mgr; l von Kokulturen auf einer Monoschicht von etwa 10 5 Amöben / cm 2. Um speziell isolieren eine gegebene Bakterienarten, impfen auch spezifische Agar-Medien für diese Bakterien (dh BCYE-Agar für Legionella spp.) Ausgelegt. </li><li> In Abwesenheit von Lyse, nehmen Sie 100 ul Cokulturen vier bis sieben Tage nach der ersten Impfung und impfen einen frischen Amöben Kultur von 900 ul in einer 24-Well-Platte. Wenn schnelle Lyse der Amöben ohne Vermehrung von Bakterien beobachtet, könnte ein Virus vorhanden sein. In diesem Fall, filtern die Stand bei 0,22 um und verwenden Sie die Suspension filtriert, frische Amöben infizieren. </li></ol&gt; </li></ol> 1.4 Bakterielle Isolierung und Charakterisierung <ol><li> Bakterielle Färbung Führen Cokulturen direkt auf Deckgläschen in 24-Well-Mikroplatten. Entfernen Sie das Medium und durchzuführen, Färbung oder Immunfluoreszenz. <ol><li> Geändert Romanowsky Färbung <ol><li> Lassen Sie das Deckglas trocken. Tauchen Sie die Deck fünf Mal in der Fixierungslösung (2 mg / L Fast Green in Methanol). </li><li> Tauchen die Deck fünfmal in der Färbungslösung I (1,22 g / L Eosin G in Phosphatpuffer pH 6.6) </li><li> Schließlich tauchen die Deckglas 5 Mal in der Farblösung II (1,1 g / L Thiazin in Phosphat-Puffer pH 6.6). </li><li> Mit destilliertem Wasser spülen die Probe. Trocknen lassen und beobachten durch Mikroskopie. </li></ol></li><li> Ziehl-Neelsen-Färbung <ol><li> Lassen Sie das Deckglas trocken. Decken Sie die Probe mit Ziehl Fuchsin. Heizen Sie den Farbstoff mit einer Flamme, bis Dämpfe auftreten. </li><li> Kühlen bei Raumtemperatur für mindestens 5 minund mit destilliertem Wasser spülen. Decken Sie die Probe mit 3% iger Salzsäure-Lösung in Isopropanol für 2 Minuten und spülen mit destilliertem Wasser. </li><li> Abdeckung für 30 Sekunden mit Methylenblau und mit destilliertem Wasser spülen. Trocknen lassen und beobachten durch Mikroskopie 22. </li></ol></li><li> Gimenez-Färbung <ol><li> Vorbereitung einer Fuchsin-Stammlösung durch Vermischen von 100 ml 10% basisches Fuchsin (10 g basisches Fuchsin in 100 ml 95% Ethanol), 250 ml 4% ige wässrige Phenol und 650 ml destilliertem Wasser. Inkubieren bei 37 ° C für 48 Stunden vor dem Gebrauch. </li><li> Lassen Sie das Deckglas zu trocknen und zu beheben, indem es durch Flamme. Decken Sie die Probe mit frisch gefiltert Basisfuchsinlösung (4 ml Fuchsin Stammlösung in 10 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,45) für 2 min. </li><li> Mit Wasser spülen die Probe und Inkubation in Malachitgrün (0,8% in destilliertem Wasser) für 10 Sekunden. Wieder mit Wasser spülen und wiederholen Malachitgrün Färbung. Wieder mit Wasser spülen. Lassen Sie das Deckglas trocken, mount, und beobachten durch Mikroskopie 23. </li></ol></li><li> Immunfluoreszenz <ol><li> Befestigen Sie das Deckglas durch Inkubation in Methanol für 5 min oder mit Paraformaldehyd 4% für 10 min. </li><li> Dreimaliges Waschen mit PBS und Inkubation für 2 h in Blockierungslösung (5% BSA, 0,1% Saponin in PBS) bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Sie die Deckglas für 1 h in Blockierlösung Antikörper gegen den Mikroorganismus von Interesse angehoben enthält. </li><li> Nachwaschen dreimal in PBS und Inkubation für 1 h mit einem gegen den primären Antikörper gerichtet und an einen Fluorophor gebunden sekundären Antikörper. Dreimal mit PBS waschen, montieren Sie die Deckglas und beobachten durch Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol></li></ol></li><li> DNA-Nachweis durch PCR Extrahieren DNA von 100 bis 200 ul Amöben Kokultur. Erkennen Mikroorganismen mit universelle Primer gezielt den 16S rRNA-Gen oder spezifische Primer für Arten von Interesse, wie Mykobakterien 24, Legionellen oder 25 Mitglieder des Chlamydiales 26. </li></ol> 2. Amöben Enrichment 2.1. Probenvorbereitung Resuspendieren festen und halbfesten Proben in PAS durch Vortexen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei niedriger Geschwindigkeit (180 × g) für 10 min. Dies ermöglicht die Anreicherung von frei lebenden Amöben im Pellet. Der Überstand kann Amöben Co-Kultur und das Pellet für 21 Amöben Anreicherung verwendet werden. 2.2. Mittelzubereitung <ol><li> Hinzufügen von 1,5 g Agar zu 100 ml PAS und autoklaviert das Medium 15 min bei 121 ° C. Gießen Sie die warmen Medium in Petrischalen erstarren und lassen bei Raumtemperatur. </li><li> Wachsen Escherichia coli (ATCC 25922) in LB oder Thioglykolat Brühe über Nacht bei 37 ° C Waschen Sie die Bakterien mit PBS resuspendieren und sie in PAS Medium. Verdünnen 10x in PAS und breitete 2-3 ml dieser Verdünnung auf eine PAS-Agar-Platte und trocknen lassen. </li></ol> Fügen Sie einen Tropfen der Probe (oder ein Stück Filter) auf einer Seite der Platte und ließ es über der Petrischale zu fließen, um eine Linie in der Mitte der Schale zu bilden. 2.4. Amöbenwachstum und Amöben Subkultur <ol><li> Beachten Sie die Petrischale täglich. Wenn eine Amöbenmigrationsfront erkannt wird, schneiden Sie ein kleines Stück Agar bei der Migration vor und impfen NNA eine frische Petrischale mit einem Rasen von E. bedeckt coli. </li><li> Wiederholen Sie die Reinokulation mehrmals in Abhängigkeit von der Reinheit der Probe, um eine reine Kultur eines bestimmten Stammes Amöben haben. </li></ol> 2.5. Amöben und Bakterien Charakterisierung <ol><li> Kratzen Sie die Zellen und resuspendieren sie in PAS. </li><li> DNA zu extrahieren und zu bestimmen, die Identität von Amöben und / oder bakteriellen Symbionten durch PCR und Sequenzierung (16S rRNA-Amplifikation für Bakterien, resp. 18S rRNA für die Amöben und Sequenzierung, zum Beispiel). </li> &lt;li&gt; Verwenden Sie diese abgekratzt Zellen in PAS an die frische Amöben impfen und führen Sie eine Amöben Co-Kultur, um Bakterien möglicherweise in der Probe zu erkennen. </li></ol>

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Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).</li><li>Thomas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lausannevirus,+a+giant+amoebal+virus+encoding+histone+doublets.">Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets.</a> Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).</li><li>Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+infection+of+a+technician+by+mimivirus.">Laboratory infection of a technician by mimivirus.</a> Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).</li><li>Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parachlamydia+acanthamoebae,+an+emerging+agent+of+pneumonia.">Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia.</a> Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).</li><li>Lamoth, F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebal+pathogens+as+emerging+causal+agents+of+pneumonia.">Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).</li><li>Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+6.">Ch. 6.</a> Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ. Microbiol. , (2012).</li><li>Ovrutsky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooccurrence+of+Free-Living+Amoebae+and+Nontuberculous+Mycobacteria+in+Hospital+Water+Networks,+and+Preferential+Growth+of+Mycobacterium+avium+in+Acanthamoeba+lenticulata.">Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung sind effiziente Methoden, die die Trennung von vielen neuen Bakterien-und Amöbenarten erlaubt. Ergebnisse mit diesen Methoden erhaltenen bestätigen die allgegenwärtige Präsenz der beiden Amöben und Amöbe beständigen Bakterien in der Umwelt und am interessantesten in künstlichen Wassernetze, die als durch chemische Behandlungen wie Chlorung und Ozonierung gesteuert werden. Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung sind wesentliche Instrumente zu isolieren und kultiviere...

Vor dem Aufkommen der molekularen Diagnostik, wurden in der Umwelt Nischen oder in klinischen Proben vorhandenen Mikroorganismen oft durch Kultivierung auf verschiedenen selektiven Medien, vor allem auf Agar in Petrischalen nachgewiesen. Der Phänotyp der Bakterienkolonien und ihre Stoffwechselaktivität erlaubt dann bakterielle Einstufung auf Artenebene. Brühe kann auch verwendet werden, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Allerdings haben beide Techniken erlauben die Gewinnung von Bakterien, die langsam oder gar nicht auf diesen Medien wachsen. Dies ist der Grund, warum molekulare Ansätze werden so heute weit verbreitet. Dennoch Nachweis von DNA bietet keine Ahnung, auf die Lebensfähigkeit der Bakterien. Darüber hinaus im Gegensatz zu Kultur, Molekularbiologie Ansätze nicht in einem Stamm, der ferner dadurch gekennzeichnet ist, führen. Studieren Krankheitserreger, die schlecht wachsen auf festen Medien oder dass Bedarf Zellen wachsen ist kompliziert. Die meisten dieser &quot;schwierig zu wachsen&quot; Bakterien sind anspruchsvoll intrazellulären Bakterien, oft entdeckt und folgende große Ausbrüche, wie es der Fall bei Legionella pneumophila war gekennzeichnet. Dieses Bakterium wurde nach einem Ausbruch, die während eines American Legion Convention aufgetreten ist. So viel, wie 182 Menschen wurden infiziert und 29 starben an einer schweren Lungenentzündung 1,2. Es wurde später gezeigt, dass Amöben waren die natürlichen Wirte dieses Bakteriums und dass ihre Anwesenheit im Hotelklimaanlage und Wassernetze war der Ursprung des Ausbruchs der sogenannten Legionärskrankheit 3. Amöben sind weltweit präsent und wurden aus Boden, Luft, Wasser und die Nasenschleimhaut von Freiwilligen (in 4 Bewertung) isoliert. Diese &quot;freilebenden&quot; Amöben sind in der Regel selbstständig Aufteilung in die Umwelt, sondern kann gelegentlich dringen zügigen Gastgeber fünf. Amöben ernähren sich von verschiedenen Mikroorganismen durch Phagozytose und anschließende lysosomale Verdauung durch hydrolases 6. Viele fakultativ oder obligat intrazelluläre Bakterien sind in der Lage, um die Verdauung zu widerstehen und damit zu infizieren und zu teilen in Amöben wie beispielsweise Legionellen, Chlamydien-verwandten Bakterien oder Mykobakterien (in 7 überprüft und 8). Freilebende Amöben wahrscheinlich eine wichtige potenzielle Reservoir für die intrazelluläre Bakterien, die noch nicht entdeckt wurden. Dies führte unsere Gruppe in Lausanne implementieren zwei Haupttechniken, die so genannte Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung, die verschiedenen Gruppen zu mehreren neuen obligat intrazelluläre Mikroorganismen aus verschiedenen Umweltproben zu isolieren 9-15 erlaubt. Da Amöben sind professionelle Phagozyten Beweidung auf Bakterien, könnte ein Bakterium in der Lage, die Phagozytose zu widerstehen und innerhalb dieser Protisten wachsen auch kolonisieren menschlichen Phagozyten und sein gegenüber Menschen pathogen. Dies wurde teilweise für einige Chlamydia-verwandten Bakterien, wie gezeigt Waddlia chondrophila. W. chondrophila nicht nur in Amöben, sondern auch in verschiedenen Zelltypen, wie Säuger Epithelzellen, Makrophagen und Fischzelllinien 16-18 wachsen. Die Amöben Kokultur erscheint auch zum Nachweis von intrazellulären Bakterien in klinischen Proben 19,20, darunter Stühle, die stark mit verschiedenen Bakterienarten 21 verunreinigt sind relevant. Hier beschreiben wir die wichtigsten Schritte Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung, einschließlich (a) Behandlung von Umwelt-oder klinischen Proben, (b) das Wachstum von Amöben auf axenischen Medien und auf einem Bakterienrasen von Escherichia coli und (c) der Auswahl und Charakterisierung intrazelluläre Bakterien.

<table><tbody><tr><td>Glucose monohydrate</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m pore size membrane</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>SCVPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>proteose peptone</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>yeast extract</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flasks</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>Kova slide</td><td>Hycor, Indianapolis, IN</td><td>87144</td><td></td></tr><tr><td>cell culture microplates</td><td>Corning Inc, Corning, NY</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik staining kit</td><td>Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Ziehl fuchsin</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>21820</td><td></td></tr><tr><td>basic fuchsin</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>857843</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>P1037</td><td>Corrosive and mutagenic</td></tr><tr><td>malachite green oxalate</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>84510</td><td></td></tr></tbody></table>

discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches

Die intrazelluläre Erreger wie Legionellen, Mykobakterien und Chlamydien-ähnlichen Organismen sind schwierig zu isolieren, weil sie schlecht oder gar nicht wachsen oft überhaupt auf selektiven Medien, die üblicherweise verwendet werden, um Bakterien zu kultivieren. Aus diesem Grund sind viele dieser Krankheitserreger wurden erst vor kurzem oder folgenden wichtigen Ausbrüche entdeckt. Diese Erreger sind oft mit Amöben, die als Wirtszelle dienen und ermöglichen es, das Überleben und das Wachstum der Bakterien verbunden. Wir wollen hier, um eine Demonstration von zwei Techniken, die Isolierung und Charakterisierung von intrazellulären Erregern in der klinischen oder Umweltproben vorhanden ermöglichen bieten: die Amöben Co-Kultur und die Amöben Bereicherung. Amöben Co-Kultur ermöglicht die Wiederherstellung der intrazellulären Bakterien, die durch Impfen der untersuchten Probe auf einem Rasen, der Amöben infiziert werden können und lysiert durch die in der Probe vorhanden sind intrazelluläre Bakterien. Amöben Anreicherung ermöglicht die Wiederherstellung von Amöben in einer klinischen oder Umweltprobe vorhanden. Thwird, kann auf Entdeckung von neuen Amöbenarten, sondern auch von neuen intrazellulären Bakterien wachsen speziell in diesen Amöben führen. Zusammen helfen diese beiden Techniken, um neue intrazelluläre Bakterien in der Lage, in Amöben wachsen zu entdecken. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Amöben infizieren und wider Phagozytose, intrazelluläre Bakterien könnten diese auch zu entkommen Phagozytose durch Makrophagen und somit sein pathogen für höhere Eukaryonten unterschieden.

Mit Amöben Co-Kultur und Amöben Anreicherung, wurden eine ganze Reihe von Umwelt-und / oder pathogene Bakterien entdeckt (Tabelle 1). Amöben Co-Kultur wurde von unserer Gruppe und andere verwendet werden, um Umweltproben, Wasseraufbereitungsanlagen und Wasserverteilungssystemen zu analysieren. Ein breites Spektrum von Mikroorganismen könnten mit dieser Technik isoliert werden. Die häufigsten Bakterien durch Amöben Co-Kultur isoliert sind Mitglieder der Gattung Myco...

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Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Amöben Kokultur ein Zellkultursystem mit adhärenten Amöben, selektiv wachsen intrazelluläre Pathogene in der Lage, phagozytische Zellen wie Amöben und Makrophagen zu widerstehen. Es stellt somit ein wichtiges Instrument, um neue Infektionserreger entdecken. Amöben Bereicherung ermöglicht Entdeckung neuer Amöbenarten und ihrer spezifischen intrazellulären Bakterien.

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

discovery-new-intracellular-pathogens-amoebal-coculture-amoebal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K Aufrufe.  University Hospital Center and University of Lausanne.  Amöben Kokultur ein Zellkultursystem mit adhärenten Amöben, selektiv wachsen intrazelluläre Pathogene in der Lage, phagozytische Zellen wie Amöben und Makrophagen zu widerstehen. Es stellt somit ein wichtiges Instrument, um neue Infektionserreger entdecken. Amöben Bereicherung ermöglicht Entdeckung neuer Amöbenarten und ihrer spezifischen intrazellulären Bakterien. 

Serie: Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical imaging. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometry represents a label-free, in situ imaging modality capable of generating spatial maps for a wide variety of metabolites. While thinly sectioned tissue samples are now routinely analyzed via this technology, imaging mass spectrometry analyses of non-traditional substrates, such as bacterial colonies commonly grown on agar in microbiology research, remain challenging due to the high water content and uneven topography of these samples. This paper demonstrates a sample preparation workflow to allow for imaging mass spectrometry analyses of these sample types. This process is exemplified using bacterial co-culture macrocolonies of two gastrointestinal pathogens: Clostridioides difficile and Enterococcus faecalis. Studying microbial interactions in this well-defined agar environment is also shown to complement tissue studies aimed at understanding microbial metabolic cooperation between these two pathogenic organisms in mouse models of infection. Imaging mass spectrometry analyses of the amino acid metabolites arginine and ornithine are presented as representative data. This method is broadly applicable to other analytes, microbial pathogens or diseases, and tissue types where a spatial measure of cellular or tissue biochemistry is desired.

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

A novel sample preparation method is demonstrated for the analysis of agar-based, bacterial macrocolonies via matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.

Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gezüchtet wurden

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical ...

Biochemie

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Biotechnik

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identifikation der Virulenz Marker von Mycobacterium Abscessus für die intrazelluläre Replikation in Phagozyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

Zusammenfassung

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