Der Autor dankt Roberto Kolter (Harvard Medical School) für seine wertvolle Ratschläge und Unterstützung bei der Entwicklung dieser Kokultur Bildschirm. Sie hat auch dank Matthew Powers zum Lesen des Manuskripts für Klarheit und Chia Cheng-yi um Unterstützung bei der Erlangung Abbildung 6.

<ol>
	<li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+microbial+metabolites.">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis.">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus.">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li><li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fluorescent Proteins. , (2013).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. 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Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis.">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li><li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis.">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li><li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis.">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li><li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis.">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li><li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+(CGG)+genes+in+different+bacterial+genera.">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li><li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li><li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. 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D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas-Saccharomyces+interactions:+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival.">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Eine der inhärenten Beschränkungen des Protokolls ist, dass es auf der Kultivierbarkeit von mikrobiellen Organismen beruht. Wie gut dokumentiert 24, die meisten mikrobiellen Lebens auf dem Planeten kann (noch) nicht unter den Kulturbedingungen bis heute erforscht angebaut werden. So wird eine große Anzahl von Interaktionen zwischen Mikrobenarten, die in natürlicher Umgebung auftreten, unerkannt mit diesem Ansatz. Da unser Wunsch ist es, die Existenz solcher Wechselwirkungen nicht nur zu identifizieren, da...

Wir interessieren uns für das Verständnis, wie die Metaboliten, die Bakterien absondern, beeinflussen die Physiologie und die Entwicklung der Nachbar Mikroben. Viele Metaboliten wurden für ihre bioaktiven Effekte auf andere Mikroben gekennzeichnet. Zwei gut beschriebenen Beispiele sind Antibiotika, die das Wachstum anderer Mikroorganismen hemmen und Quorum Sensing-Moleküle, die die globale Genexpression von anderen Mikroben zu ändern. Allerdings Bakterien produzieren viele andere kleine Molekül natürlichen Produkten, die keine bekannten Bioaktivitäten 1 haben. Wir vermuten, dass Bakterien entwickelt haben und erhalten die Möglichkeit, einige dieser Stoffwechselprodukte, weil sie es ihnen ermöglichen, die zelluläre Physiologie ihrer mikrobielle Nachbarn in den komplexen mikrobiellen Gemeinschaften, in dem die meisten Bakterien existieren modulieren. Bacillus subtilis Zelltypen Wir haben unsere Studien über chemisch vermittelte mikrobielle Interaktionen, die bacil beinhalten konzentriertlus subtilis. Dies ist nicht nur wegen ihres Status als den gram-positiven Bakterium Modell und den daraus resultierenden genetischen Werkzeuge für seine Betätigung zur Verfügung, sondern auch wegen seiner Fähigkeit, gekennzeichnet Zelltypen. Beispiele sind Zellen, die sind: Schwimmen, Herstellung der extrazellulären Matrix, die für robuste Biofilmbildung erforderlich ist; zuständigen aufnehmen DNA aus der Umgebung, und sporenbildenden, unter anderen zwei. Jeder dieser Zelltypen exprimiert ein Merkmal Transkriptions-Regulon, das sie physiologisch und / oder physikalisch von den genetisch identischen Geschwistern macht. Unter vielen Wachstumsbedingungen, mehreren Zelltypen existieren verschiedene Subpopulationen innerhalb einer einzigen Kolonie von B. subtilis-Zellen 3. Obwohl viele Arten von Bakterien können analog Zelltyp Heterogenität aufweisen, dieses Phänomen wurde besonders gut in B. studierte subtilis. Insbesondere sind Gene, die UPRInnerhalb jeder dieser spezifischen B egulated subtilis Zelltypen identifiziert worden. Identifizieren solcher hochregulierte Gene ist für die hier beschriebene Arbeit, weil viele dieser mikrobiellen Phänotypen von Interesse schwierig oder unmöglich direkt zu beobachten sind. Zum Beispiel können wir nicht visuell ein Merkmal zu erkennen, wie Schwimmen auf solide (1,5%)-Agar-Platten, auch wenn eine Subpopulation von B. subtilis-Zellen produzieren Geißeln unter diesen Bedingungen 3. Ein weiteres Beispiel ist Biofilmmatrix-Produktion. Matrixproduktion durch Koloniemorphologie sichtbar gemacht werden (wie es in makroskopisch faltige Kolonien führt), sondern nur auf bestimmte Wachstumsmedium, und erst nach mehreren Tagen des Wachstums 4. Doch wir wissen, welche Gene während der Differenzierung hochreguliert, können wir Transkriptions Reportern, die als Marker für zelluläre Differenzierung in diesen Zelltypen wirken zu konstruieren. Reporter-Konstrukte Diese Fluoreszenz transcriptional Reporter aus den Promotoren für die Zelltyp-spezifische Gene Antreiben der Herstellung eines Reportergens, zum Beispiel ein fluoreszierendes Protein ist. Beispiele umfassen P hag-YFP (zum Schwimmen Zellen), P Tapa-YFP (für Biofilm-Matrix-produzierenden Zellen) und P SSPB-YFP (für sporen Zellen), wobei P x die Promotorregion für die Gen-x. Diese Reporterkonstrukte werden in einem neutralen Locus auf Chromosom integriert (Fig. 1 und siehe unten), so daß das native Regelung der Phänotyp bleibt intakt. Aber jetzt, wenn eine Zelle diesen Phänotyp exprimiert, es drückt auch ein fluoreszierendes Protein. Dies stellt eine leicht visualisiert Auslesen der Aktivierung bestimmter phänotypisches Verhalten, so dass wir für diese Mikroben, die physiologische Reaktion zu aktivieren screenen. Obwohl solche Journalisten werden häufig in der Mikrobiologie eingesetzt, sie wurden nicht weitgehend Bildschirme identif angewendety metabolische Wechselwirkungen zwischen Mikroben vor dieser Methode wurde 5 beschrieben. Es gibt eine Anzahl von wichtigen Überlegungen bei der Gestaltung und Konstruktion von Zelltyp-spezifischen Reporterstämmen. Wir haben ausschließlich Transkriptions fluoreszierenden Reportern verwendet, obwohl andere Typen von Konstrukten sind sicherlich möglich. Wir raten von der Verwendung der translationalen Fusionen als Marker für Zelltyp Differenzierung in unserem Bildschirm, jedoch aus zwei Gründen: 1) der Wunsch, die nativen Zelltyp-spezifischen Protein unbeeindruckt lassen, und 2) die Erkenntnis, dass eine diffuse, Zell- breite Fluoreszenz wird leichter zu erkennen als in den Zellen lokalisiert puncta (gemeinsam mit translationale Fusionen). Reporter-Gen-Auswahl Nach der Entscheidung, die Transkription als Auslese verwenden, muss der Reporter-Gen ausgewählt werden (zB LacZ, Fluoreszenz oder Luciferase). LacZ hat den Vorteil, benötigen mindestens die SonderIzed Ausrüstung, um zu erkennen, aber es gibt eine viel höhere Wahrscheinlichkeit von Fehlalarmen unter Umwelt Mikroben. In unseren Händen, der Hintergrundpegel von Lac + Organismen unter Bodenmikroben war unerschwinglich hoch (&gt;&gt; 10% der Bodenmikroben waren blau (Lac +) auf der X-Gal-Platten, Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, dass durch Titrieren der Konzentration von X-gal in dem Medium, das könnte optimiert werden, um die Verwendung einer X-Gal-Reporter ermöglichen, obwohl wir nicht versucht dieses. Luciferase eine hohe Nachweisempfindlichkeit und ist die orthogonale Reporter: Es gibt nahezu keine Chance Umweltmikroben inhärent Leucht. Allerdings fanden wir es schwierig, Instrumentierung an unserer Hochschule, die Lumineszenzdetektion erlaubt über die gesamte Petrischalen zu identifizieren, da die meisten wurden entwickelt, um nur lokalisierte Bereiche in Multi-Well-Platten zu scannen. Es könnte auch Komplikationen bei der Visualisierung Leucht Kolonien in einer Weise, die auch erlaubt die gleichzeitige körperliche ist seinBildung von Ol-Organismen zu induzieren. Bei der Verwendung von Treuhändern kann dies möglich gemacht haben, haben wir entschieden, statt Transkriptions fluoreszierenden Reporter, die bewiesen wurden in B. arbeiten, verwenden subtilis, sofern ausreichende Nachweisempfindlichkeit und niedrige False-Positive-Raten unter den Bodenorganismen und erlaubt, von leicht verfügbaren Instrumente sowohl für die Visualisierung und Isolierungsverfahren zu verwenden. Fluorophor-Auswahl Die spezifische Fluorophor ausgewählt werden auf Ihrem Bakterienarten ab, die Agar-Nährmedium Sie verwenden, und die insbesondere Fluoreszenzfilter setzt Sie zur Verfügung haben. Mit unserer Messtechnik, haben wir festgestellt, dass sowohl die B. subtilis Kolonien selbst und die sie auf Agar zeigten weniger Hintergrundfluoreszenz gewachsen, wenn YFP (gelb fluoreszierendes Protein)-Filter verwendet wurden, so dass Reporter überlegen GFP (green fluorescent protein) in unseren Händen. Die Codon-Verwendung von fluoreszierenden Proteinen sindhäufig für Eukaryoten optimiert, so dass es wichtig ist, eine Fluorophor entweder aus der Literatur bekannt, in Ihrem Bakterienarten zu arbeiten, oder sie explizit über einen konstitutiven Promotor testen auswählen. Eine große Anzahl von sich ständig weiterentwickelnden fluoreszierenden Protein-Varianten sind derzeit verfügbar 6, die in einer Reihe von Quellen, 7,8, von denen einige Leitlinien ausdrücklich vor, auf die Auswahl eines geeigneten Fluoreszenzprotein für Ihr Experiment 9 wurde bewertet haben. Promoter Auswahl Die Auswahl eines Promotors wird weitgehend auf Zelltyp oder Phänotyp von Interesse ab. Für Organismen wie B. subtilis wurden einige Zelltyp-spezifische Reportergene in der Literatur etabliert. Für andere Bakterienstämme, werden untersucht Mikroarray-oder Transkriptions Daten erforderlich sein, Informationen darüber, welche Gene stark unter den Bedingungen hochreguliert werden bieten, wo Ihr Zelltyp von Interesse is manifestierten. Eine aktuelle Studie katalogisiert die Transkription von B. subtilis unter 104 verschiedenen Wachstumsbedingungen mit 10 Fliesen-Microarrays. Dieses Papier bietet umfassende Informationen darüber, welche Gene sind stark unter verschiedenen Bedingungen hochreguliert, die von unschätzbarem Wert für weniger gut charakterisierten Phänotypen ist. Anstatt genaue Kartierung Promotorregionen für jedes Gen von Interesse, wir verwenden in der Regel einfach die Sequenz 200-500 bp stromaufwärts des Gens als Promotor. Der genaue Ablauf Länge ist abhängig von der genomischen Kontext: kürzere Regionen verwendet werden, wenn notwendig, um zu vermeiden, einschließlich der vor-kodierenden Regionen aus Nachbar offene Leserahmen. Neutral Loci und Integration Wie pflegen Sie die Reporter Konstrukt in Ihrem Bakterienstamm wird die letzte Frage bei der Gestaltung eines fluoreszierenden Transkriptions-Reporter-Stamm. In Bakterien sind die Gene von Interesse häufig beibehaltenauf Plasmiden mit antibiotischer Selektion. Jedoch kann es nicht möglich sein, während der Co-Kultur ohne Antibiotika töten die Umweltmikroben verwendet werden. Wenn Plasmide stabil in Ihrer Bakterienarten gehalten, kann es möglich sein, das Wachstum Ihres Bakterien, die ein Plasmid-borne Reporter in Gegenwart von Antibiotika, um Ihre Reporter für das Screening vorbereiten und dann zu beseitigen Antibiotika während der Co-Kultur selbst, in der Hoffnung, dass das Plasmid wird ausreichend aufrechterhalten werden, um Fluoreszenz zu ermöglichen. Allerdings, wenn Plasmide sind leicht in Ihre Bakterium verloren, oder werden unter Stressbedingungen verloren, wird dies nicht eine sinnvolle Option sein. In vielen Fällen ist die beste Lösung, um das Reporterkonstrukt auf dem bakteriellen Chromosom, das die stabile Aufrechterhaltung des Reporter auch in Abwesenheit von Selektion ermöglicht integrieren. Um für die Integration, um die normale Expression oder Regulation des Gens von Interesse nicht zu stören, empfehlen wir, in einer Eileiter Website integrieren auf dem Chromosom, dass CAn als handeln &quot;neutralen Ort&quot;. In B. subtilis diese Integrationsstellen sind Gene, die - wenn sie mutiert sind - vermitteln einen Phänotyp in bestimmten Minimalmedien (so dass Integranten ohne Antibiotika-Selektion identifiziert werden kann), aber nicht Wachstum oder Sporenbildung Raten in Rich-Media verändern und umfassen solche Gene als amyE, lacA, thrC pyrD, gltA und sacA (Fördern der Fähigkeit, Stärke zu nutzen, β-Galactosidasen, Threonin, Uracil, Glutamat und Saccharose, jeweils) 11-13. Während die Integration in diesen Genen haben viele Jahre zuverlässig in B verwendet wurde subtilis (insbesondere bei amyE und lacA) können ähnliche Wissen nicht für Gene, die in vielen anderen Bakterienarten zur Verfügung. Der Einsatz von Phagen-Bindungsstellen sind gute Alternativen für neutrale chromosomalen Integrationsstellen: Viele Spezies-spezifische 14-16, sowie allgemeine Integrationsstellen wie dem Tn7 Befestigungsstelle (att Tn7) habenidentifiziert worden, und in vielen Bakterienarten 17,18 für die Gen-Insertionen verwendet. Umweltmikroben Wir verwenden Boden als direkte Quelle von Umweltmikroben für unsere Co-Kultur-Bildschirm. Der Boden enthält eine große Vielfalt an Mikroorganismen, und viele dieser Organismen sind reich an natürlichen Produkten. Durch die Verwendung von flüssigen Suspensionen von Boden direkt auf Platten mit unseren Transkriptions fluoreszierenden Reporter-Stamm (ohne vorherige Isolierung von Bakterien aus dem Boden) gelegt, wir vereinfachen den experimentellen Ansatz. Der Boden kann entweder unmittelbar nach der Ernte verwendet werden oder bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung eingefroren werden. Sofortige Anwendung hat den Vorteil, dass eine größere Vielfalt von Mikroben kann möglicherweise aufgewachsen werden, einschließlich derjenigen, die nicht überleben Einfrieren gut. Es hat den Nachteil, dass die Konzentration der Anbaubodenorganismen aus diesen Proben nicht bekannt ist, die Anzahl von Siebplatten, die verwendet werden müssen. Delayed Verwendung hat den Vorteil, dass die KBE / ml für jeden Boden Quelle kann im Voraus bestimmt werden, so dass eine optimierte Anzahl der Kolonien, die auf jeder Bildschirmplatte angebaut werden. Allerdings erfordert es, dass die Bodenorganismen überlebensfähig Gefrierpunkt. Beachten Sie, dass die Diversifizierung der Induktor Pool wird (dh den Bodenquellen) untersucht zu sein scheint, bei der Identifizierung neuer Inter Wechselwirkungen als eingehende Screening auf demselben Boden effektiver: mehr phylogenetischen Vielfalt wurde in den in unserer Matrix-Bildschirm, wie Induktions identifizierten Hits beobachtet zusätzlichen Bodenquellen wurden anstatt Screening der gleichen Erde Quellen gründlicher (EA Shank und R. Kolter, Harvard Medical School, unveröffentlichte Ergebnisse) untersucht. Überblick Der Ansatz, den wir hier beschreiben, ist einfach in seiner technischen Anforderungen. Es beinhaltet: 1) Konstruktion eines fluoreszierenden Reporter-Transkriptions in B. subtilis oderandere Bakterienspezies von Interesse, 2) Identifizieren Bedingungen, unter denen der Reporter nicht aktiviert ist, 3) Herstellung von Aliquots dieser Reporter-Stamm und Organismen gescreent werden (in diesem Fall Erde, aber andere Quellen könnten stattdessen verwendet werden), 4) Mischen derselben zwei Sätze von Mikroben auf festen Medien, 5) Identifizierung und Isolierung von mutmaßlichen Induktion Organismen, und 6), die bestätigt, dass diese Organismen tatsächlich diesen Phänotyp in einem sekundären Bildschirm zu aktivieren. Einmal identifiziert, diese Organismen und deren Stoffwechsel uns mit chemischen Methoden, um bakterielle Verhalten modulieren, um bakteriellen Physiologie und mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen und möglicherweise handeln als neue Gerüste für zukünftige therapeutische Verbindungen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth, Lennox</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80017-484</td>
			<td>Alternative media sources may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 3 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26396-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading tips, round</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59060-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions

In der Natur, Bakterien existieren selten isoliert, sondern werden durch eine Vielfalt von anderen Mikroorganismen, die die lokale Umwelt zu verändern durch Sekretion von Metaboliten umgeben. Diese Metaboliten haben das Potenzial, die Physiologie und die Differenzierung ihrer mikrobielle Nachbarn modulieren und sind wahrscheinlich wichtige Faktoren bei der Errichtung und Instandhaltung von komplexen mikrobiellen Gemeinschaften. Wir haben eine Fluoreszenz-basierten Kokultur Bildschirm, um solche chemisch vermittelte mikrobielle Wechselwirkungen identifizieren. Der Bildschirm beinhaltet die Kombination eines fluoreszierenden Reporterstamm mit Transkriptionsumwelt Mikroben auf festen Medien und so die Kolonien in Co-Kultur wachsen. Die Leuchtstofftranskriptions Reporter ist so konzipiert, dass die gewählte Bakterienstamm fluoresziert, wenn es einen bestimmten Phänotyp von Interesse exprimieren (dh die Biofilmbildung, Sporenbildung, Virulenzfaktor Produktion, etc.) Screening ist unter Wachstumsbedingungen durchgeführt wheWieder dieser Phänotyp nicht exprimiert wird (und damit der Reporter-Stamm ist in der Regel nicht fluoreszierend). Wenn ein Umwelt Mikrobe sondert ein Metabolit, der diesen Phänotyp aktiviert, diffundiert es durch den Agar und aktiviert die fluoreszierenden Reporter-Konstrukt. Dies ermöglicht die Induzierung Metaboliten produzierenden Mikroben nachzuweisenden: sie sind nicht-fluoreszierenden Kolonien meisten proximal zu den fluoreszierenden Kolonien. Somit ermöglicht dieser Bildschirm die Ermittlung von Umwelt Mikroben, die diffusionsfähige Metaboliten, die eine bestimmte physiologische Reaktion in einem Reporterstamm aktivieren produzieren. Diese Publikation beschreibt, wie: a) wählen Sie die entsprechende Co-Kultur Screeningbedingungen, b) bereiten die Reporter und Umwelt Mikroben für Screening, c) führen die Co-Kultur-Bildschirm, d) zu isolieren mutmaßlichen Induktion Organismen, und e) bestätigen ihre Tätigkeit in einem zweiten Bildschirm. Wir haben diese Methode, um für Bodenorganismen, die Biofilmmatrix-Produktion in Bacillus subtilis aktivieren Bildschirm </em&gt;, aber wir diskutieren auch Überlegungen für die Anwendung dieses Ansatzes auf andere genetisch manipulierbaren Bakterien.

Dieser Bildschirm wurde verwendet, um Bodenorganismen zu identifizieren sezer Verbindungen, die die Physiologie von B. ändern subtilis. Die hier beschriebenen Ergebnisse konzentrieren sich auf die Matrix-produzierenden Zelltyp von B. subtilis, die das Protein und Exopolysaccharid, die für robuste Biofilmbildung in diesem Bakterium benötigt werden produziert. Wir haben uns für den Promotor des Tapa-sipW Tasa-Operon für unsere fluoreszierenden Reporter-Konstrukt (P Tapa-YF...

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Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Bakterien produzieren sezernierten Verbindungen, die das Potenzial, die Physiologie der Mikroorganismen ihre Nachbarn beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur Bildschirm, der Nachweis solcher chemisch vermittelte Inter Wechselwirkungen durch Mischen von Bodenmikroben mit fluoreszierenden Reporter-Transkriptions Stämmen von Bacillus subtilis auf festen Medien ermöglicht.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Aufrufe.  University of North Carolina at Chapel Hill.  Bakterien produzieren sezernierten Verbindungen, die das Potenzial, die Physiologie der Mikroorganismen ihre Nachbarn beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur Bildschirm, der Nachweis solcher chemisch vermittelte Inter Wechselwirkungen durch Mischen von Bodenmikroben mit fluoreszierenden Reporter-Transkriptions Stämmen von Bacillus subtilis auf festen Medien ermöglicht. 

Serie: Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Forschung

Biologie

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using scanning transmission electron microscopy (STEM). Cells of the mammalian breast cancer cell line SKBR3 were grown on silicon microchips with silicon nitride (SiN) windows. Cells were chemically fixed, and HER2 proteins were labeled with quantum dot nanoparticles (QDs), using a two-step biotin-streptavidin binding protocol. The cells were coated with multilayer graphene to maintain a hydrated state, and to protect them from electron beam damage during STEM. To examine the stability of the samples under electron beam irradiation, a dose series experiment was performed. Graphene-coated and non-coated samples were compared. Beam induced damage, in the form of bright artifacts, appeared for some non-coated samples at increased electron dose D, while no artifacts appeared on coated samples.

Presented here is a protocol for labeling membrane proteins in mammalian cells and coating the sample with graphene for liquid-phase scanning transmission electron microscopy. The stability of the samples against the damage caused by radiation can also studied with this protocol.

Graphengehäuse chemisch fixierter Säugetierzellen für die Flüssigphasenelektronenmikroskopie

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Bioinformatics Resources for the Study of Glycan-Mediated Protein Interactions

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In particular, it aims at highlighting interactions between glycoproteins (such as cell surface receptors) and carbohydrate-binding proteins mediated by glycans. Here, major resources of the collection are introduced through two illustrative examples centered on the N-glycome of the human Prostate Specific Antigen (PSA) and the O-glycome of human serum proteins. Through different database queries and with the help of visualization tools, this article shows how to explore and compare content in a continuum to gather and correlate otherwise scattered pieces of information. Collected data are destined to feed more elaborate scenarios of glycan function. Glycoinformatics introduced here is, therefore, proposed as a means to either strengthen, shape, or refute assumptions on the specificity of a protein glycome in a given context.

This protocol illustrates how to explore, compare, and interpret human protein glycomes with online resources.

Bioinformatik-Ressourcen zur Untersuchung von Glykan-vermittelten Proteininteraktionen

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In ...