Name: a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba at JoVE.com

KP und AS schrieb und das Manuskript überarbeitet. KP durchgeführt die Experimente und die Analyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Career Transition Award (K22AI112816), as unterstützt.

Alle experimentelle Verfahren erfolgten an der University of California, Irvine.
1. Puffer und Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie Lysogeny Brühe (LB) in einer 1 L Glasflasche durch Zugabe von LB-Miller-Mischung 25 g in 1 L bidestilliertem Wasser (DdH2O vor). Fügen Sie für Petrischalen eine zusätzliche 20 g Agar. Autoklav zu sterilisieren. Gießen Sie 25 mL des flüssigen Agar Medium in 10 cm-Durchmesser-Petrischalen und bei Zimmertemperatur erstarren lassen. Speichern von flüssigen Medien bei Raumtemperatur und Agarplatten bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Glukose Hefe Pepton (Gips) Platten in eine 1 L-Glas-Flasche durch das Mischen von 1 g D-Glucose, 2 g Pepton, 0,25 g Hefe-Extrakt, 4,2 g KH2PO4, 5,1 g Na2HPO47 H2O und 25 g Agar in 1 L DdH2 O. Autoklav zu sterilisieren. Gießen Sie 25 mL des geschmolzenen Nährbodens in 10 cm-Durchmesser-Petrischalen und bei Zimmertemperatur erstarren lassen. Shop bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Pepton S (PS) Medium in eine 1 L-Glas-Flasche durch das Mischen von 10 g Pepton, 7 g Hefe-Extrakt, 15 g D-Glucose, 0,12 g Na2HPO47 H2O, 1,4 g KH2PO4, 40 µg Vitamin B12 , und 80 µg Folsäure in 800 mL DdH2O. kalibrieren eine elektronischen pH-Meter pH 4 und pH 7 Standards verwenden, wenn der pH-Meter nicht innerhalb eines Tages verwendet worden ist.<ol>
<li>Messen Sie den pH-Wert des Mediums PS mit dem pH-Meter. Fügen Sie entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 zur Einstellung des pH-Wertes auf 6,5. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O. Filter sterilisieren mit 0,22 µm Vakuumfilter und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Gehen Sie vorsichtig mit den pH-Wert Anpassungen durch das Tragen von Schutzausrüstung einschließlich Schutzkleidung, Handschuhe, Augenschutz und stellen Sie Schutz zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 x Entwicklung Puffer Prime vorzubereiten (DB ") Puffer in einer 1 L Glasflasche durch Zugabe von 3,4 g KH2PO4, 13,4 g Na2HPO4 7 H2O und DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 800 mL. Kalibrieren einer elektronischen pH-Meter pH 4 und pH 7 Standards verwenden, wenn der pH-Meter nicht innerhalb eines Tages verwendet worden ist.<ol>
<li>Messen Sie den pH-Wert des Puffers mit dem elektronischen pH-Meter. Passen Sie den pH-Wert 6,5 indem sanft entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 nach Bedarf an. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O und durch Autoklavieren zu sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern. Hinweis: Gehen Sie vorsichtig mit den pH-Wert Anpassungen durch das Tragen von Schutzausrüstung einschließlich Schutzkleidung, Handschuhe, Augenschutz und stellen Sie Schutz zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 x Entwicklung Puffer (DB) zu machen, durch Mischen 100 mL 10 x DB "Puffer mit 1 mL sterilisiert 2 M MgCl2und 1 mL 1 M CaCl2sterilisiert. Die letzte Lautstärke zu 1 L in einer 1 L Glasflasche mit einem Autoklaven sterilisiert DdH2O. Store bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie PS:DB Medium in einer 1 L Glasflasche durch Mischen 100 mL sterilisiert PS Medium, 100 mL sterilisiert 10 x DB "Puffer und sterilisierte DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 1 L. Ergänzung mit 1 mL sterilisiert 2 M MgCl2 und 1 mL sterilisiert 1 M CaCl 2. Store bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Calcein-AM Lager Lösung durch Zugabe von 50 µL von DMSO auf 50 µg von Calcein-AM in der vom Hersteller gelieferten Kunststoffbehälter. Shop bei-20 ° C.</li>
</ol>(2) Wachstum und Erhaltung der Amöben
<ol><li>Wachsen Sie E. Coli -Stamm B/r17 als Nahrungsquelle für die Amöben in der ersten Wachstumsphase. Streak E. Coli B/r aus einem gefrorenen bestand bei-80 ° C auf eine LB-Agar-Platte gespeichert und Inkubation bei 37 ° C über Nacht um einzelne Kolonien zu erhalten.</li>
	<li>Eine einzige Kolonie von E. Coli B/r in 2 mL LB-Medium zu impfen und über Nacht in einer Bandage oder einem Shaker bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Bringen Sie die Übernachtung E. Coli Kultur auf die Raumtemperatur. Mit einem Holzstab, impfen Sie Amöben aus einem gefrorenen bestand in 750 µL der Übernacht-Kultur bei-80 ° C gehalten. Hinweis: Verwendung D. Discoideum Stamm AX3, axenic Wachstum18dar. Dieser Schritt erfordert keine axenic Wachstum, aber nachfolgende Schritte habe seine Verpflichtung.</li>
	<li>Fügen Sie sofort 700 µL der Amöben -E. Coli -Mischung auf einen Teller Glukose Hefe Pepton (Gips). Verbreitung der Kultur gleichmäßig auf der Oberfläche der Platte durch Kippen es hin und her und Seite-an-Seite nach Bedarf. Vermeiden Sie die Verwendung von einem Spreader.</li>
	<li>Platzieren Sie die GYP-Platte mit Agar nach oben in eine Box, die hohen Luftfeuchtigkeit führt. Verwenden Sie zwei Einweg-Kunststoff-Behälter (183 x 183 cm x 91 cm) oben auf einander gestapelt. Füllen Sie den unteren Behälter mit ca. 25 mL Wasser und stellen Sie den oberen Behälter mit mehreren 0,5 cm Durchmesser Löcher gebohrt, durch den Boden des Behälters, um Feuchtigkeit aus dem Wasserreservoir in den oberen Behälter verschieben kann.</li>
	<li>4-5 Tage bis Amöbe Sporen beobachtet sind nahe der Oberfläche der Platte (Abbildung 2) wächst inkubieren Sie die GYP Platte und Box bei 22 ° C. Verwenden Sie einen gekühlten Inkubator, um Platten anstatt Inkubation bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Nachdem Sporen gewachsen sind, bleiben sie auf Platten für mehrere Wochen lebensfähig, wenn bei 4 ° c gelagert Speichern Sie die Platten mit Agar Seite nach oben. Nach 3-4 Tagen Inkubation können Zonen Clearing innerhalb des bakteriellen Rasens beobachtet werden, die zeigen des Beginn der Amöbe Sporenbildung.<ol>
<li>Beobachten Sie kleine Amöben Sporen über die Plattenoberfläche nach 4-5 Tagen Inkubationszeit (Abbildung 2). Hinweis: Wachsen Sie nicht die Amöben für länger als eine Woche, da die Qualität der Sporen nach Ablaufen dieser Frist abnimmt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie Amöben Sporen vorzubereiten für das axenic Wachstum der Amöben durch eine sterile 1 mL PIPETTENSPITZE parallel zur Oberfläche der Platte zu fegen. Sporen aus der Hälfte einer 10 cm Petrischale zu sammeln. Hinweis: Berühren Sie die Spitze an die Oberfläche der Agar-Platte wie diese Bewegung große Zahlen von E. Colisammeln wird.</li>
	<li>Aufschwemmen der Amöben an der Spitze der Pipette durch Eintauchen der Spitze in 1 mL PS Medium und sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die beimpfte Mischung in einen 250-mL-Flasche mit 25 mL des Mediums PS ergänzt mit der Antibiotikum-antimykotische Lösung bei 0,25 X Konzentration. Hinweis: Bewahren Sie die Antibiotikum-antimykotische Lösung als 250 µL-Aliquots bei-20 ° C. Vermeiden Sie wiederholte Zyklen der Auftauen und Einfrieren dieser Lösung, da dadurch seine Wirksamkeit verringern kann.</li>
	<li>Amöben axenically bei 22 ° C in einem rotierenden Shaker bei 100 u/min zu wachsen. Für die Virulenz-Assay in Schritt 5 Zellen wachsen zu einer optischen Dichte, gemessen bei 600 nm (OD600) von 0,2 bis 0,5. Hinweis: Dieser Schritt erfordert ca. 3-4 Tage Wachstum ab dem Zeitpunkt der Impfung (Schritt 2.7). Wenn Zellen zu einer höheren Dichte gewachsen sind, verdünnen die Kultur zurück in PS Medium zu einem OD-600 von 0,05 oder niedriger und wachsen wieder zu einem OD-600 von 0,2 bis 0,5.</li>
</ol>(3) das Wachstum von p. aeruginosa
<ol><li>Wählen Sie eine einzelne Kolonie von p. Aeruginosa von eine LB-Platte, in ein 2 mL PS:DB Kultur zu impfen und wachsen über Nacht bei 37 ° C, Sättigung. Hinweis: Fügen Sie die Antibiotikum antimykotische Lösung nicht zu den PS:DB Medien.</li>
	<li>Verdünnen Sie Nacht Kultur 1: 100 oder 1:1,000 in eine 6 cm-Durchmesser Petrischale mit PS:DB. Wenn die Virulenz von planktonischen Zellen ausschließlich untersucht wird ist, wachsen Sie die Kulturen mit herkömmlichen Kultur Röhren statt. Schütteln Sie die Kultur auf ein Benchtop-Rotator bei 100 u/min bei 37 ° c eingestellt</li>
	<li>Ernte-Kulturen zu bestimmten Zeitpunkten auf Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Bereiten Sie bei 30 min bis 1 h vor der Beurteilung der Virulenz eine Agar-Pad, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Hinweis: Virulenz in p. Aeruginosa wird durch ca. 8 h des Wachstums auf Oberflächen induziert.</li>
	<li>Um die Oberfläche angebracht Zellen zu isolieren, entfernen Sie das flüssige Medium aus der Petrischale, waschen Sie sofort mit 1 mL der DB-Puffer, planktonischen Zellen zu entfernen und gehen Sie sofort zum Schritt 5.1. Achtung: Waschen Sie nicht länger als 30 s da dies durcheinanderbringen und Oberfläche angebracht Zellen zu lösen und die Virulenz Messung beeinträchtigen.</li>
	<li>Um planktonischen Zellen zu isolieren, übertragen Sie 10 µL der Kultur von der Petrischale auf einer sauberen Petrischale und gehen Sie sofort zu Schritt 5.1.</li>
</ol>(4) Mikroskopie - Vorbereitung der Agar-Pad
<ol><li>Bereiten Sie Agar Pads ca. 30 min bis 1 h bis Amöben mit p. Aeruginosamischbar sind.</li>
	<li>Mikrowelle 50 mL von 1 % (w/V) Agar in DB-Puffer in einem 250 mL-Kolben. Mix alle 20 s bis Klumpen von Agar verschwinden.</li>
	<li>Kühlen Sie die geschmolzene Agar indem man sie in vorgeheizten 55 ° C Wasserbad für 15 min.</li>
	<li>15 mL des geschmolzenen Nährbodens in einem konischen Rohr 15 µL der Stammlösung Calcein-AM hinzufügen. Mischen Sie durch sanft das Rohr 4 - 5 mal umdrehen und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren. Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Polypropylen 15 mL Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen dickes Glas-Container nicht, als dadurch der Agar, vorschnell zu festigen.</li>
	<li>Gießen Sie die flüssigen Agar Mischung auf einer 12 cm x 10 cm Glasplatte und erlauben Sie den Nährboden für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu festigen. Schneiden Sie indem du die Glasplatte über einem gedruckten Raster und schneiden entlang des Rasters ein Metall-Lineal mit erstarrtem Agar-Pad in kleinere Abschnitte von 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Halten Sie das Gel in einer feuchten Box hydratisiert, bis es betriebsbereit ist.</li>
</ol>(5) Mikroskopie - Vorbereitung der Bakterien-Amöbe Probe für die Bildgebung
<ol><li>Um die Virulenz der Oberfläche befestigt Bakterienzellen assay, fügen Sie 10 µL der Amöbe Zellen aus Schritt 2.10 Oberfläche befestigt Bakterien aus Schritt 3.4 hinzu. Hinweis: Diese Schritt beschreibt das Mischen von Amöben mit Bakterien.</li>
	<li>Um die Virulenz von planktonischen Zellen assay, mischen Sie 10 µL der Amöbe Zellen aus Schritt 2.10 mit 10 µL der planktonischen Bakterien aus Schritt 3.5. Hinweis: Waschen Sie die axenically gewachsen Amöbe Zellen (bei einer OD600 von 0,2 bis 0,5) vor dem Mischen mit den Bakterien nicht. Kein Wachstum von E. Coli wird in die Amöbe Kultur durch den Einsatz von Antibiotika-antimykotische Lösung beobachtet werden.</li>
	<li>Legen Sie sofort das 1,5 x 1,5 cm Calcein-AM Agar Pad ab Schritt 4.5 auf die Bakterien-Amöben-Mischung auf der Petrischale Oberfläche. Hinweis: Legen Sie das Agar-Pad auf der Mischung mit einer schnellen reibungslosen Bewegung. Senken Sie das Pad langsam auf die Mischung nicht, da diese Bewegung dazu neigt, Zellen in Richtung der Peripherie und Weg von der Unterseite des Pads schieben. Diese Schritt wird sichergestellt, dass Bakterien und Amöben gleichmäßig sind gemischt, immobilisiert und, dass beide Arten Zelle sind auf der gleichen Ebene beschränkt.</li>
	<li>Sanft pipettieren Sie alle verbleibenden Flüssigkeit umgibt das Agar-Pad, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lassen Sie die Petrischale für 20 min bei Raumtemperatur trocknen.</li>
	<li>Mit der Petrischale mit einem Deckel decken Sie ab und inkubieren Sie die immobilisierten Amöben-Bakterien-Mischung bei Raumtemperatur für eine zusätzliche 40 min. gehen Sie zu Schritt 6.1. Hinweis: Es ist wichtig, alle Proben für die gleiche Menge an Zeit, wenn der Hintergrund Fluoreszenz erhöht im Laufe der Zeit zu inkubieren. Es empfiehlt sich eine Inkubationszeit von 1 h. Inkubationen länger als 1 h sind weniger reproduzierbar wie Amöben Zellen zu platzen beginnen können.</li>
</ol>(6) Mikroskopie - Bilderfassung
<ol><li>Bild Amöben mit einem Fluoreszenzmikroskop Hellfeld und grün Fluoreszenzbilder erwerben. Verwenden Sie für grüne Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz Protein (GFP) Filter mit 474/27 nm und 525/45 nm für Anregung und Emission, beziehungsweise. Verwenden Sie ein 10 X (≥0.3 numerische Apertur) Ziel der Amöben Image. Hinweis: Die Calcein-AM im Agar bewirkt sterbende Amöben, Fluoreszenz in den grünen Fluoreszenz-Kanal. Gesunde Amöben sind sonst nicht fluoreszierend.</li>
	<li>Einstellen Sie Erfassungszeiten für Phasenkontrast, GFP-Kanäle zu begrenzen Phototoxizität und optimiert den Dynamikumfang des Bildes Intensitäten. Das differential Interferenz Kontrast (DIC) Phasenkontrast zu ersetzen, wenn nötig. Hinweis: Verwenden Sie wenn möglich 100-200 ms Belichtungen für Phasenkontrast und GFP Fluoreszenz. Halten Sie die Einstellungen für Belichtung und Instrument unverändert während des gesamten Experiments. Dies ist entscheidend für die Berechnung des Host-Tötung-Indexes.</li>
	<li>Bilder für mindestens 100 Amöbe Zellen zu erwerben, um gute Statistiken zur Berechnung des Hosts Tötung Index zu erhalten.</li>
</ol>7. Bild-Analyse und Host-Tötung-Index
<ol><li>Durchführen Sie Bildanalyse mit ImageJ.</li>
	<li>Die Phase Kontrast-Image-Datei in ImageJ durch Anklicken Datei öffnen | Offene und das Bild auswählen. Passen Sie den Schwellenwert durch Bild anklicken | Analyse | Schwelle. Passen Sie den unteren und oberen Schwellenwert wählen Sie nur die Intensität Peak(Abbildung 3).</li>
	<li>Konvertieren Sie das Bild in Binary, indem Sie auf Prozess | Binäre | Stellen binäre. Löcher füllen, indem Sie Prozess auswählen | Binäre | Löcher füllen. Hinweis: Mit dem Bild in Abbildung 1 als Quelle, werden Schritte 7.1-7.2 ein Bild erzeugen, in denen die Amöben und Bakterien Oberfläche angebracht als dunkle Bereiche (Abbildung 3B) vorkommen.</li>
	<li>Sicherzustellen, dass die Felder Bereich und bedeutet Grauwert in Analyze geprüft werden | Legen Sie Messungen. Messen Sie die ungefähre Größe der Amöben durch Auswahl des ovalen Tools auf der Hauptsymbolleiste. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme und beachten Sie den Bereich der repräsentativen Amöben.</li>
	<li>Erstellen von Masken für die Amöben durch Klicken auf analysieren | Analysieren Sie Partikel. Geben Sie im Größenfeld des Bereichs, der wird die Amöben unter anderem die Bakterien ausschließen. Wählen Sie Masken im Dropdown-Menü die Option "anzeigen". Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Manager hinzufügen aktiviert ist.</li>
	<li>Klicken Sie auf "OK" und ein Bild zeigt nur die Amöben und ein ROI-Manager Dialogfeld wird angezeigt (Abbildung 3C).</li>
	<li>Die fluoreszenzbild mit Datei öffnen | Offene und die entsprechende Datei auswählen. Wählen Sie alle Regionen im ROI Manager durch Gedrückthalten der Shift-Taste und einem Klick auf jede Region in der Liste (Abbildung 3D).</li>
	<li>Klicken Sie auf Messen , im ROI-Manager. Dadurch öffnet sich ein Ergebnisfenster zeigt den mittleren Intensitätswert jede Amöbe.</li>
	<li>Die Fluoreszenz-Werte für jede Amöbe in einem Tabellenkalkulations-Programm kopieren und die Host Index zu töten, indem man den Durchschnitt aller Fluoreszenz-Werte zu berechnen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine rasche und quantitative Methode zur Virulenz in p. Aeruginosaassay. Dieses Protokoll kann mit anderen Bakterien getestet werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Wachstumsmedium mit der Amöbe Wachstumsbedingungen kompatibel sein sollten. Insbesondere haben wir das Protokoll mit PS:DB als das Bakterienwachstum Medium optimiert. Wenn andere Medien verwendet werden, ist es möglicherweise erforderlich, Wachstumskontrolle Medien nur durchzuführen, bei denen gibt es keine...

Bakterielle Infektion gehört zu den führenden Todesursachen in Mensch und Tier1,2. Die Fähigkeit, Virulenz der Bakterien in Kulturen oder Biofilme zu messen ist wichtig in Medizin und Forschung Einstellungen. Hier beschreiben wir eine vielseitige, schnelle und relativ einfache Methode, um bakterielle Virulenz zu quantifizieren. Die Eukaryotische Organismus Dictyostelium Discoideum (Amöben) dient als Modell Wirtsorganismus. D. Discoideum wurde als Host verwendet, um Virulenzfaktoren in Pseudomonas Aeruginosa (p. Aeruginosa)3,4,5 und andere Bakterien6,7 identifizieren ,8 und ist anfällig für weitgehend die gleichen Virulenzfaktoren, die Säugerzellen einschließlich Typ III-Sekretion9,10zu töten. Vorherigen Virulenz-Assays mit D. Discoideum haben im Laufe der Stunden3,4,5über längere Zeit von Bakterien mit D. Discoideum Zellen beteiligt. Hier das Protokoll stellt eine schnelle Methode zur Bestimmung der Virulenz verwenden diese Amöbe. Dieses Protokoll (Abbildung 1) beschreibt wie man: (1) wachsen die Amöben axenically (in Abwesenheit von Bakterien), (2) wachsen Bakterien für den Assay, (3) bereiten Bakterien und Wirtszellen für Mikroskopie, (4) Epifluoreszenz mikroskopie durchzuführen, und (5) analysieren Sie Amöbe Fluoreszenz.
Amöben sind zunächst gestreift von gefrorenen Vorräte und auf eine Rasenfläche von Escherichia coli (E. Coli), angebaut, wo die Amöben Sporen produzieren. Diese Sporen sind abgeholt und in eine angereicherte Medium für axenic Wachstum geimpft. Die Amöben sind durch axenic Wachstum in nährstoffreichen Bedingungen beibehalten, bis sie bereit sind, mit Bakterien für die Beurteilung der bakteriellen Virulenz gemischt werden. Das Überleben oder den Tod der Amöben wird durch die Messung der Fluoreszenz von Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM), die durch intrazelluläre Esterasen abgespalten und, dadurch aktiviert für Fluoreszenz11,12quantifiziert. Live Amöben zeigen wenig oder gar keine Fluoreszenz betont, und sterbende Zellen intensiv fluoreszieren. Dieses Ergebnis ist durch eine kleine oder gar keine Einarbeitung von Calcein-AM gesunden Amöben und Einbeziehung und Spaltung des Substrats im gestressten Amöben13. Dieses Verhalten unterscheidet sich vor allem von Calcein-AM Fluoreszenz in Säugerzellen11,14,15,16.
Bakterien, die für die Virulenz beurteilt werden separat angebaut. Hier beschreiben wir wie Sie messen die Virulenz von opportunistischen Erreger p. Aeruginosa und ausführlich, wie man die Virulenz von planktonischen (Schwimmen) und Oberfläche befestigt Sub-Populationen zu quantifizieren. Dieses Protokoll möglicherweise angepasst, die Virulenz von anderen Bakterien zu testen. Im Abschnitt Vertreter Ergebnisse wir zeigen, dass die Virulenz in Oberfläche angebracht Zellen aktiviert und ist niedrig im planktonischen Zellen, die hieß zuvor13. Virulenz-aktivierte Oberfläche angebracht p. Aeruginosa tötet Amöben, während nicht virulente planktonischen Zellen von den Amöben konsumiert werden. Wenn die Virulenz von planktonischen Bakterien ausschließlich untersucht wird ist, können Bakterien in gewöhnlichen Kultur Röhren anstatt Petrischalen zu verwenden, wie im Protokoll beschrieben kultiviert werden.
Das Wachstum der Amöben und p. Aeruginosa Kulturen muss koordiniert werden, so dass p. Aeruginosa Kulturen die beabsichtigten Wachstumsphase erreichen, während die Amöben im Steady-State in nährstoffreichen Bedingungen wachsen. Dieser Zustand erfordert in der Regel Amöben Kulturen mindestens 1 Tag vor dem verdünnt werden, wenn sie mit Bakterien vermischt werden. Amöben und Bakterien sind immobilisiert mit Agar-Pads sind für 1 h Co inkubierten und abgebildet, mit einer niedrigen Auflösung (10 X, numerische Apertur 0,3) Objektive, grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) filtert und eine Wärmebildkamera. Analyse mit frei verfügbare ImageJ-Software ausgeführt werden kann oder Bildanalyse-Software angepasst. Unsere Analyse erfolgte mittels eigener Software mit einer wissenschaftlichen Analyse Paket13geschrieben. Die Software sollte erstellen Sie eine Maske mit dem Phase Kontrast Bild und die maskierten Bereiche in der fluoreszenzbild Fluoreszenz Werte extrahieren. Fluoreszenz-Werte sind über mindestens 100 Zellen, was zu einer numerischen Host Tötung Index gemittelt.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, dehydrated</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot &amp;lt; 1 mL and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Special peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hyroxide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain AX3&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain B/r&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 strain&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &amp;Delta;lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14-derived strain&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>For filter sterilization</td></tr><tr><td>Conical tube, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Glass storage bottles</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Petri dish, 6 cm diameter</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Petri dish, 10 cm diameter</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Plastic containers with lid</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Square 3-cup containers</td></tr><tr><td>Glass plates</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td></tr><tr><td>Wooden sticks</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 objective&amp;nbsp; 0.3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence excitation source</td><td>Lumencor</td><td>Sola light engine</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>For growth of bacteria at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Platform shaker</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Undercounter refrigerated incubator</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Isotemp waterbath&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>For cooling media to 55 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

Traditionelle bakteriellen Virulenz Tests beinhalten über längere Zeit Bakterien im Laufe von mehreren Stunden auf Wirtszellen. Während dieser Zeit können Bakterien in der Physiologie aufgrund der Exposition gegenüber Hostumgebung Wachstum und das Vorhandensein von Wirtszellen verändern. Wir entwickelten einen Test um den Zustand der Virulenz der Bakterien schnell zu messen, die das Ausmaß zu minimieren, um das Bakterien in Gegenwart von Wirtszellen wachsen. Bakterien und Amöben sind miteinander vermischt und auf einen einzigen Abbildungsebene mit einer Agar-Pad immobilisiert. Das Verfahren nutzt einzellige Fluoreszenz-Bildgebung mit Calcein-Acetoxymethyl Ester (Calcein-AM) als Indikator für Host Zellgesundheit. Die Fluoreszenz von Wirtszellen ist nach 1 h von Wirtszellen Bakterien ausgesetzt zu sein mit Epifluoreszenz mikroskopie analysiert. Bildanalyse-Software wird verwendet, um einen Host-Tötung-Index zu berechnen. Diese Methode wurde verwendet, um die Virulenz innerhalb von planktonischen und Oberfläche befestigt Pseudomonas Aeruginosa Messen Sub-Populationen in der Anfangsphase der Biofilmbildung und andere Bakterien und andere Wachstumsstadien Biofilm angepasst werden kann. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und robuste Methode zur Messung der Virulenz und vermeidet viele der komplexen Zusammenhang mit Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien. Virulenz Phänotypen mit Amöben hier gemessen wurden auch mit Maus Makrophagen validiert. Insbesondere wurde dieser Assay verwendet, um die Oberfläche Anlage reguliert Virulenz in p. Aeruginosazu etablieren.

Wir wuchsen Wild-Art p. Aeruginosa Belastung PA1419 oder eine ΔLasR 20 im gleichen PA14 Hintergrund in 6 cm Durchmesser-Petrischalen belasten und die Virulenz von planktonischen und Oberfläche angebracht Zellen untersucht. Kulturen wurden aus einzelnen Kolonien in PS:DB Kulturen, gewachsen über Nacht in Kultur Röhren in eine Bandage bei 37 ° C, Sättigung geimpft, verdünnt 1: 100 in PS:DB, für 8 h in 6 cm Durchmesser...

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A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Virulenz von planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterien mit D. Discoideum (Amöben) als Host zu messen. Virulenz wird gemessen über einen Zeitraum von 1 h und Host töten wird quantifiziert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse. Wir zeigen dieses Protokoll mit dem Bakterium p. Aeruginosa.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K Aufrufe.  University of California. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Virulenz von planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterien mit D. Discoideum (Amöben) als Host zu messen. Virulenz wird gemessen über einen Zeitraum von 1 h und Host töten wird quantifiziert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse. Wir zeigen dieses Protokoll mit dem Bakterium p. Aeruginosa.

Serie: A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identifikation der Virulenz Marker von Mycobacterium Abscessus für die intrazelluläre Replikation in Phagozyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Langzeitverfolgung und Quantifizierung der Motilität von Akanthamöbenarten

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential contamination of contact lenses after water exposure, the natural behavior of this pathogen remains elusive. Understanding Acanthamoeba's movement patterns can inform us about how it colonizes contact lenses and contaminates the patient's cornea. It is fortunate that Acanthamoeba spp. are visible via brightfield microscopy starting at 4x magnification. Previous techniques have been developed to quantify Acanthamoeba motility in regard to cytopathic effects or under-exposure to the electric field. Here, we describe a method to track and quantify Acanthamoeba spp. motility long-term (hours to days), which is a protocol applicable to multiple amoeba strains, surfaces, and nutritional status of amoeba. This procedure is germane to determining many core motility quantifications, such as distance, speed, confinement, and directionality, which are necessary to monitor different stages of infection, proliferation, or behavioral change.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Untersuchung des Verhaltens von Akanthamöben , um gezielte Strategien zur Vorbeugung von Akanthamöben-Keratitis zu entwickeln</

This procedure describes how to visualize, track, and quantify Acanthamoeba spp. motility.

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Identifikation der Virulenz Marker von Mycobacterium Abscessus für die intrazelluläre Replikation in Phagozyten

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität

Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität

Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität