Wir danken Dr. Craig Roy und Dr. Dario Zamboni für die Bereitstellung einer Vorlage für Protozoen Zelle Infektionen. Wir danken Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, Dr. Fred Heffron und Todd Wisner für Geräte und Reagenzien; Dr. Lulu Cambronne für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Durchflusszytometrie wurde am OHSU Durchflusszytometrie Shared Resource Facility durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss aus dem Medical Research Foundation of Oregon und einer NIH R21 AI088275 (EDC) unterstützt.

Ein. Vorbereitung der Legionella pneumophila Kulturen für Priming Stufe Infektionen <ol><li> Verwandeln Sie alle L. pneumophila-Stämme in dem Assay mit dem Plasmid pAM239 verwendet, die für ein Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbaren grün fluoreszierendes Protein (GFP) 28. Streak die Bakterienstämme auf Eisen und Cystein N-(2-Acetamido)-2-Aminoethansulfonsäure (ACES) ergänzt gepufferten Aktivkohle Hefeextrakt-Agar (CYEA) mit 6,25 g / ml Chloramphenicol (CM) (für Plasmid-Wartung) und inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Übertragen ein Inokulum des Bakterienstammes in ergänzt ACES gepufferten Hefeextrakt-Brühe (AYE) mit 6,25 pg / ml CM und 1 mM IPTG und kultivieren bis zur stationären Phase (O / N) auf einem Schüttler bei 37 ° C </li><li> Bestätigen GFP-Expression in den in vitro-Kulturen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Übertragen 10 ul der Kultur auf einen Objektträger unter einer AbdeckungRutsch-und Bild mit einem 60X-Objektiv mit GFP Anregung / Emission cube (AMG EVOS fl). </li><li> Verdünnen Sie eine 100 ul-Aliquot jeder in-vitro-Kultur bis 1:10 mit sterilem H 2 O. Stellen Sie eine leere mit 100 ul AYE Medien mit 1 mM IPTG und 6,25 pg / ml cm und Wasser. Nehmen OD600 Messungen der Verdünnungen mit einem Spektralphotometer (Bio-Rad Smart-Spec Plus). Berechnen des Volumens erforderlich, eine gut bei einer MOI = 20 infizieren für jede in vitro-Kultur: V = [(Amöben seeded) x MOI] / [OD 600 x (Verdünnungsfaktor) x (konstant)] = [(1 x 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Bakterienkonzentration als OD 600 = 1,0 ermittelt = 1 x 10 9 CFU / ml. </li></ol> 2. Priming Stufe Infektion mit Acanthamoeba castellanii <ol><li> Pflegen und pflegen die Amöben in ATCC 712 PYG Medium in 175 cm 2-Kolben bei RT. </li><li> Ersetzen Medien in Amöben culturen 24 Stunden vor Beginn der bakteriellen flüssigen Kulturen. Am gleichen Tag flüssigen Bakterienkulturen gestartet werden, zu sammeln und zu zählen Zellen auf einem Lichtmikroskop unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Verdünnt das Amöben mit frischem Medium auf eine Endkonzentration von 1 × 10 6 Zellen / ml. Seed 12-Well-Zellkultur-Platten mit 1 ml Aliquots der Amöben mit einem Repetierpipette und inkubieren bei RT O / N. </li><li> Nach der Inkubation die Wells der 12-Well-Zellkultur-Platten 3x mit 1 ml steriler PBS mit einem 10 ml serologische Pipette und eine manuelle Pipette Hilfe. </li><li> Nach dem Absaugen des PBS, 1ml der Infektion Medien (ATCC 712 PYG media minus Glukose, Pepton und Hefeextrakt) mit 1 mM IPTG und 6,25 pg / ml cm in jede Vertiefung. Die Inkubation bei RT für 1 Stunde. </li><li> Infect Vertiefungen bei einer MOI = 20. Zentrifuge die Platte bei 400 xg für 5 min (Eppendorf 5810R) und schwimmen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. Übertragen der Platte an einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 18 Stunden. </li><li> Bestätigen Sie die Infektionen mit Live Cell Imaging auf einem Fluoreszenzmikroskop vor Zelllyse und Ernte von Bakterien beherbergen. </li></ol> 3. Seeding THP-1-Zellen für Target-Zell-Stadium Infektion <ol><li> (Beginn dieses Prozesses 24 Stunden vor dem Einrichten flüssigen Bakterienkulturen). Kultivieren THP-1-Zellen in einem 75 cm 2-Kulturflaschen nahe-Konfluenz in RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Zählen der Zellen unter Verwendung einer Suspension Hämozytometer, verdünnt den THP-1-Zellen in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS und 100 ng / ml Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) zu einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml und die Platte in 1 ml Aliquots auf 12-Well-Zellkultur-Platten. Die Inkubation erfolgt 48 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 4. Verarbeitung von Bakterien für Target-Zell-Stadium Infektion nach der Grundierung Bühne Infektion <ol><li> Saugen Sie das Medium aus dem grundiert Amöben. </li><li> Lysieren die amoebae mit 500 ul eiskaltem, sterilen ultrafiltriertes (UF) H 2 O und Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Pool Die Lysate nach Art belasten und nehmen eine E 512 nm Messung für jede der gepoolten Lysaten mit einem Fluoreszenz-Reader (Molecular Devices Spectramax Zwilling EM). </li><li> Berechnen Sie einen OD 600-Messung für den gepoolten Lysaten: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - Lysat Hintergrund) + 0,0019. Die Formel wurde zuvor durch die grafische Darstellung einen direkten Vergleich sowohl der OD 600 und der E 512 nm Messungen von Verdünnungen von L. ermittelt pneumophila Wildtyp-GFP exprimieren von stationärer Phase in vitro-Kultur (1 *). Die Lysate der nichtinfizierten Amöben, unterliegen den gleichen experimentellen Bedingungen wie die infizierten Amöben, werden als Rohling verwendet und einen Korrekturwert (zB Lysat Hintergrund), die in die Gleichung eingearbeitet wurde. Das notwendige Volumen to infizieren auch bei einer MOI = 20 wird für jedes Lysat Pool berechnet: V = [(THP-1 seeded) x MOI] / [calcOD 600 x (konstant)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20/600 calcOD. </li><li> Waschen Sie die THP-1-Zellen 3x mit PBS und 1 ml frisches RPMI 1640 (10% FBS) in jede Vertiefung. Inkubieren THP-1-Zellen für 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Infizieren die THP-1 Zellen bei der Verwendung der berechneten MOI gepoolt Lysaten. Zulassen, dass ein Satz von Vertiefungen bleiben uninfizierten, dient als negative Kontrolle für die durchflusszytometrische Analyse. Verarbeitung der Grundierung Stufe sollte in weniger als 30 Minuten abgeschlossen werden. Die Lysate werden auf Eis gehalten, um Veränderungen in bakterielle Genexpression vor der Infektion zu begrenzen. </li><li> Zentrifuge die Platte schweben um die Temperatur zu erhöhen, und inkubieren, wie in der Grundierung Bühne. </li><li> Eine Stunde nach der Infektion, entfernen Sie die Medien durch Aspiration und waschen Brunnen 3x mit PBS auf extrazelluläre Bakterien zu entfernen. </li><li> 1 ml fresh RPMI 1640 (10% FBS), in Vertiefungen und kehren die Platte in den Inkubator. Der Zeitpunkt unmittelbar nach Medienersatz dient als Zeitpunkt Null (T 0). Inkubieren der THP-1-Zellen für 14-16 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 5. Experimental Analysis 5.1 Live Cell Imaging Bild die infizierten Brunnen mit einem Fluoreszenzmikroskop (AMG EVOS fl) bei 10X oder 20X Vergrößerung (1A-D). Die Bilder können entweder qualitativ oder quantitativ verglichen werden, um Niveaus einer Infektion sowohl in der Initialisierungszusammensetzung Stufe und Stufe Infektionen Zielzelle zu bestimmen. 5,2 Durchflusszytometrie <ol><li> Die Emissions-Peaks verschiedener Infektionen können durch Durchflusszytometrie (BD FACS Calibur) verglichen werden. Trypsinieren die infizierten THP-1-Zellen und vorsichtig waschen sie aus den Vertiefungen durch Mischen in PBS mit einer Pipette. </li><li> Pool die Zellen von Stamm-Typ in 15 ml Falcon-Röhrchen und Pellet bei 1.800 xg für 2min in der Tischzentrifuge. </li><li> Suspend die Pellets in 1 ml PBS und Transfer zum 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.800 x g (Eppendorf 5424) und wieder aussetzen Pellets in 1 ml PBS. Wenn die resultierenden Suspensionen stark trüb werden (OD 600 ≥ 1,0) sie müssen in zusätzlichen PBS (1:3) verdünnt werden, um ein Verstopfen der Leitungen in dem Durchflusszytometer verhindern. </li><li> Verwenden sterilfiltriert PBS für die Äquilibrierung des Durchflusszytometers und Waschschritte zwischen Probeninjektionen. Zur Erstellung der Vorwärts / Seitenstreuung von nicht infizierten Targetzellen vor der Injektion von Zielzelle Infektion Proben. </li><li> Sammle 20.000 insgesamt Veranstaltungen für jeden Zustand mit 488 nm Laser-Anregung und die FL1-Kanal. </li><li> Tor nach der Aufnahme Zellpopulationen auszuschließen infizierten Zellen und Grundstück Fluoreszenzintensität in einem Histogramm (FlowJo) (Abbildung 1E). </li></ol> 5,3 CFU plating <ol><li> Untersuchen Sie die Effizienz of Infektion durch Plattieren CFU der Zellen für Durchflusszytometrie geerntet. Planen serielle Verdünnungen der Proben in ultrafiltriertes H 2 O bei 10 -1, 10 -2 und 10 -3. </li><li> Platte 20 ul jeder Verdünnung auf 1/3 einer CYEA Platte mit 6,25 pg / ml CM. </li><li> Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 72 Stunden. </li><li> Zählen Sie die Kolonien mit einem Zahnstocher und Zell-Zähler. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Bakterielle Genexpression dicht durch eine Kombination von Lebenszyklus Progression und ansprechend auf Signale in der umgebenden Mikroumgebung gesteuert. Vacuolar Krankheitserreger wie L. pneumophila zu einer Vielzahl von Host-Zellen abgeleiteten Signale reagiert, wenn in einem Phagosom kompartimentiert. Als Ergebnis der kollektiven Erschöpfung Nährstoff in der Wirtszelle, kompensiert das Bakterium durch Expression für erfolgreiche Verbreitung erforderlich zu einer nachfolgenden 25 Wirtszelle. <e...

Zahlreiche bakterielle Krankheitserreger allgemeine Strategien zur Wirtszellen für das Überleben und Replikation in einem intrazellulären Kompartiment nutzen angepasst. In vielen Fällen sind pathogenen Mechanismen ähnlich zwischen Protozoen und Metazoen Zellen. Jedoch sind diese beiden Mikroumgebungen sehr verschieden sein und in unterschiedliche Expression von Virulenzfaktoren 1-4 führen. Die Legionärskrankheit Bakterium Legionella pneumophila ist ubiquitär mit Süßwasser-Umgebungen weltweit 5 verbunden. Wichtig ist, dass L. pneumophila in Protozoen Zellen vor der Infektion von menschlichen Monozyten gewinnen eine pathogene Vorteil kultiviert, was darauf hindeutet, dass globale Genexpressionsprofile des Bakteriums Verlassen eines Protozoen-Zelle unterschiedlich sind als die der in vitro kultivierten Organismus 6-8. In der Natur, bieten Süßwasser Amöben nährstoffreichen Grenzen für eine schnelle Verstärkung eines eindringenden Bakteriums. Menschliche Akquisition von L. pneumophila wird häufig die Inhalation von kontaminiertem Wasser Tröpfchen, die das Bakterium enthalten, zurückzuführen. Es ist wahrscheinlich, dass diese Tröpfchen Hafen Protozoen Zell-assoziierten Bakterien, wo Protozoen Zellen sind resistent gegen herkömmliche Wasseraufbereitung Praktiken 9,10. Infektion der Lunge Alveolarmakrophagen verläuft in einer Weise nahezu identisch mit dem intrazellulären Lebenszyklus des Bakteriums in Protozoon-Wirtszellen 11-13. Um zu überleben und zu replizieren in eukaryotischen Zellen, L. pneumophila verwendet eine spezielle Art IVb Sekretionssystem bezeichnet Dot / Icm auf fast 300 &quot;Effektor&quot;-Proteine ​​in das Zytosol der Wirtszelle 14-16 liefern. Diese Effektorproteine ​​kollektiv funktionieren, um zelluläre Prozesse zu unterlaufen, um eine Replikation permissiv Abteil für das Bakterium 17,18 erzeugen. Deletionen in einem der 26 Gene, die die Dot / Icm Transporters defekt Ergebnis in Stämmen für intrazelluläre mult umfasseniplication 19-23. Historisch Löschen einzelner Effektor-Gene kodieren selten führte Stämme gedämpft für die intrazelluläre Wachstum. Dieses Phänomen hat mehrere Hypothesen, einschließlich redundanter Funktion und paraloge Kopien von Effektoren zugeschrieben. Einige Virulenzfaktoren sind nur im Rahmen der Wirtszell-assoziierter intrazelluläre Wachstum 24 exprimiert. Wir nahmen an, dass, wenn eine bestimmte Effektorzellen wurde nur im Kontext von Protozoen-Infektion exprimiert wird, dann der Beitrag des Effektors nicht durch einen Wildtypstamm, wenn sowohl in vitro kultiviert wurden verglichen werden. L. pneumophila Übergänge von einem replikativen zu einer transmissiven Phase, wie sie der stationären Phase in der Kultur 25 eintritt. Die Phase Switching Phänotyp stellt die Nährstoffverarmung während der intrazellulären Wachstums gestoßen und wird durch die Montage von Flagellen für Motilität 26 veranschaulicht. Da L. pneumophila ist invasive und virulent, wenn sie von Protozoen Zellen geerntet, haben wir versucht, einen Test, dass mehr treu die pathogenen Zustand des Bakteriums vertreten, wenn es Host-Makrophagen begegnet entwickeln. Zu diesem Zweck haben wir ein vielseitiges Protozoen Priming-Assay, die jeden geeigneten Wirt für sowohl den ersten (Priming Zelle) und zweiten (Zielzelle) Stufe Infektionen unterbringen kann. Die Infektion Prozess ist lenkbar durch Verwendung von Bakterien stabil exprimieren grün fluoreszierendes Protein (GFP). Die Infektion Modell für die Protozoen Acanthamoeba castellanii folgt eine Methode weit verbreitet im Bereich 27 verwendet. Für die Grundierung Schritt, L. pneumophila-Stämme werden in vitro bis zur stationären Phase in flüssigen Medien kultiviert, um als &#39;durchlässigen&#39; Bakterien (1A) zu erzeugen. Bakterien nächsten zur Monolagen A. infizieren castellanii 18 Stunden zur Erzielung einer späten Stufe des intrazellulären Lebenszyklus. Große Vakuolenten Bakterien können zu diesem Zeitpunkt mittels Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1A) visualisiert werden. Protozoischen Zellen werden dann lysiert und Bakterien aus dem Lysat gewonnen werden für die Emission bei 512 nm unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät gemessen. Fluoreszenz wird mit optischen Dichte korreliert Multiplizität-of-Infektion (MOI) für die Infektion von Zielzellen (Abb. 1, * Korrelation Kurve) zu berechnen. Nach Invasion (T 0) und 18 Stunden nach der Invasion (T 18), werden die Zielzellen für Fluoreszenz quantifiziert darstellt intrazellulären Bakterien. Fluoreszenz kann durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie überwacht werden, und kann durch Keimzahlen Kolonie Plattieren gemessen werden. Die Grundierzusammensetzung Assay wird immer durch Infektionen mit Wildtyp L. begleitet pneumophila und ein Stamm einen Defekt im Dot / Icm Typ IV-Sekretionssystem (Δ dota) (Abbildung 1A). Dies wichtiger bietet interne Kontrollen für direkte Vergleiche zwischen Wildtyp-and keine isogenen Mutanten bei der Infektion verwendet. Die Einbeziehung des avirulenten Stamm Δ DOTA während des Priming Stufe einen Schwellenwert für die Beobachtung eines abgeschwächten Wachstums Phänotypen mit isogenen Mutantenstämmen, die in vitro kultiviert werden, zugeordnet ist.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>chloramphenicol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP904-100</td>
 <td>antibiotic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1755-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ACES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9758-1KG</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATCC medium: 712 PYG</td>
 <td>ATCC</td>
 <td></td>
 <td>growth media for protozoans</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X PBS</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>SH30256FS</td>
 <td>phosphate buffered saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>activated charcoal</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>C272-212</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>yeast extract</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1422-500</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>peptone</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>211677</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1423-2</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-cysteine, 99%+</td>
 <td>Acros organics</td>
 <td>173601000</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferric nitrate nonahydrate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>I110-100</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>AMG</td>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>fluorescence microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Smart Spec Plus</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-2525</td>
 <td>spectrophotometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5810 R centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22627023</td>
 <td>bench top centrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repeater plus</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22230201</td>
 <td>repeating pipette</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SpectraMax Gemini EM</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td></td>
 <td>microplate reader</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Softmax Pro 5.3</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>0200-310</td>
 <td>microplate reader software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5424 microfuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22620401</td>
 <td>table top microcentrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fast-release pipette pump II</td>
 <td>Scienceware</td>
 <td>379111010</td>
 <td>pipette aid</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FACS Calibur</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td></td>
 <td>flow cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FlowJo 7.6.1</td>
 <td>FlowJo</td>
 <td>license</td>
 <td>flow cytometery software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>polypropylene conical tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.6 ml microfuge tube</td>
 <td>Neptune</td>
 <td>3745.X</td>
 <td>microcentrifuge tubes</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

tractable mammalian cell infections with protozoan-primed bacteria

Viele intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger verwenden Süßwasser Protozoen als natürliches Reservoir für die Proliferation in der Umwelt. Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit Lungenentzündung, gewinnt eine pathogene Vorteil gegenüber in vitro kultivierten Bakterien beim ersten von Protozoen Zellen geerntet vor der Infektion von Säugetieren Makrophagen. Dies deutet darauf hin, dass wichtige Virulenzfaktoren möglicherweise nicht richtig in vitro exprimiert werden. Wir haben eine tractable System zur Grundierung L. entwickelt pneumophila durch seine natürliche Protozoen Host Acanthamoeba castellanii vor Säugetierzellen Infektion. Der Beitrag eines Virulenzfaktor durch Vergleichen intrazellulären Wachstum eines Mutantenstammes zu Wildtyp-Bakterien nach Protozoen Priming untersucht werden. GFP-exprimierenden Wildtyp und Mutante L. pneumophila-Stämme verwendet werden, um Protozoen Monoschichten in einem Priming-Schritt infizieren und dürfen späten Stadien der intrazellulären Wachstum zu erreichen. Fluoreszierende Bakterien werden dann aus diesen infizierten Zellen geerntet und normiert durch Spektrophotometrie um vergleichbare Anzahl von Bakterien für eine nachfolgende Infektion in Säugern Makrophagen erzeugen. Zur Quantifizierung werden lebenden Bakterien nach der Infektion überwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie, durch Kolonie und Plattieren. Diese Technik hebt und stützt sich auf den Beitrag der Wirtszelle-abhängige Genexpression durch Nachahmung der Umgebung, die in einem natürlichen Erwerb Weg begegnet wäre. Dieser Ansatz kann modifiziert werden, um jegliche Bakterium, das einen Vermittler Host verwendet als Mittel zur Gewinnung eines pathogenen Vorteil unterzubringen.

Ein typisches Ergebnis für die gesamte Infektion ist in Abbildung 1 dargestellt. Live-cell Fluoreszenzaufnahmen Darstellung Monolagen A.castellanii mit Wildtyp L. infiziert pneumophila während des Priming Stufe wird in 1A gezeigt. Eine erfolgreiche Maßnahme des Priming-Schritt würde zu einer Bevölkerung von etwa 90% der Wirtszellen mit großen Vakuolen mit GFP markierten Bakterien an dieser MOI besiedelten führen. Bei 18 Stunden nach der Infektion, die m...

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Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K Aufrufe.  Oregon Health & Science University. Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.

Serie: Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

Das WinCF-Modell - Ein preiswerter und tragbarer Mikrokosmos eines Schleims verstopfte Bronchiole zur Untersuchung der Mikrobiologie von Lungeninfektionen

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...