Wir danken Barbara Carletti und Anna Marie Kenney für wertvolle Anregungen. , DK07328: Hyl wird durch die Ausbildung Grant &quot;Biochemie und Molekularbiologie Hormone&quot; unterstützt. Unterstützte teilweise durch NIH 5R01 NS16951 (CAM).

Teil 1: Einrichten (1-2 Tage vor Dissektion) (Nicht auf Video gezeigt) <ol><li> VORBEREITUNG Nährlösungen und Medien: <ul><li> 4X CMF-PBS-EDTA (Calcium und Magnesium free-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-EDTA für Percoll Verdünnungen): pro Liter, fügen Sie 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g Glucose, 2 g NaH 2 PO 4, 1 g KH 2 PO 4, 8 ml 2% NaHCO 3 Lager, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) zu destilliertem / deionisiertem Wasser. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 Liter und der pH-Wert auf 7,4. Filter sterilisieren. </li><li> HBSS-GLUCOSE: Add Glukose (6 Gramm / Liter), um Calcium und Magnesium freie Hanks Bilanz Salt Solution (HBSS) und Sterilfilter. 500 ml bei 4 ° C gelagert werden bis zu einem Monat. </li><li> KULTUR MEDIA: serum-freiem Medium (SFM) und 10% FBS-Medium. Um 48 ml Neurobasal A-Medium hinzufügen, 500 ul 100X Glutamax I, 500 ul 100X Penicillin-Streptomycin (final 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin), 6,25 ul 2 M KCl (final 250 uM). Split in 2 Aliquots von 9 ml und 40 ml. Zur Vorbereitung 10% FBS-Medium, 1ml von hitzeinaktiviertem FBS auf die 9 ml Aliquot. Zur Vorbereitung SFM, fügen Sie 800 ul des Serum-freien Ergänzung B-27 auf die 40 ml Aliquot. Filter sterilisiert und bei 4 ° C für maximal 2 Wochen. Für beste Ergebnisse zu frischem Medium für jedes Experiment. </li></ul></li><li> VORBEREITUNG PERCOLL Verdünnungen: <ul><li> Percoll wird als Flüssigkeit geliefert und muss vor Gebrauch angesäuert werden. Zur Vorbereitung der Lager, fügen 1N HCl nach und nach zu der Percoll-Lösung über einen Zeitraum von 1-2 Stunden, bis pH 7,4 erreicht ist. Hinzufügen des HCl zu schnell bewirkt, dass der Percoll zu aggregieren. Etwa 6.5ml 1N HCl werden für jeden Liter Percoll benötigt. Filter sterilisiert und bei 4 ° C. </li><li> A 35% und 60% (vol: vol) Percoll Verdünnung wird in die Percoll-Gradienten Schritt verwendet werden. Es werden 100 ml Percoll Verdünnungen mit 35 oder 60 ml Percoll Lager, 25 ml von 4X CMF-PBS-EDTA und destilliertem / deionisiertem H2O auf das Endvolumen. Fügen Sie ein paar Tropfen Toluidinblau, die 60% ige Lösung, es wird dazu beitragen, visualisieren die Schnittstelle und die Zellen. Filter sterilisiert und bei 4 ° C. </li><li> 4X CMF-PBS-EDTA sollten nicht älter als 3 Monate, als unzureichend Pufferung erhöht Zelltod während des Verfahrens führen. </li></ul></li><li> VORBEREITUNG Deckgläser: Deckgläser (am besten, wenn von Carolina Biological Supply Company) werden mit 10% HCl über Nacht bei Raumtemperatur mit leichtem Rühren gewaschen, gespült gründlich mit destilliertem / deionisiertem Wasser und in 70% Ethanol. Vor der Anwendung werden einzelne Deckgläser Flamme sterilisiert, indem Sie kurz hielt sie mit einer Pinzette über einer offenen Flamme (Bunsenbrenner), bis das Ethanol verdampft. 12-mm Deckgläschen kann in 4-well-Platten und 25-mm-Deckgläschen in 6-well-Platten gelegt werden. </li><li> COATING Kulturgefäße mit Substrat: Für Immunfluoreszenzfärbung oder medikamentöse Behandlungen Deckgläser sind besser geeignet, da sie leicht auf Glasobjektträger für die Visualisierung unter dem Mikroskop montiert werden. Wenn eine große Anzahl von Zellen für die Erfassung Protein oder RNA-Proben werden benötigt, Zellen auf Kunststoff-Kultur kultiviert werden dishes.The Nacht vor ihrer Zerlegung, muss Deckgläser oder Plastikschalen für Kultur mit Poly-D-Lysin (500 ug / ml beschichtet werden; 800 ul / well für 6-Well-Platten oder 350 ul / well für 4-Well-Platten). 5 mg / ml Stammlösung von Poly-D-Lysin wird bei -20 ° C, dann in sterilem destilliertem / deionisiertem Wasser und sterilfiltriert Recht vor Gebrauch verdünnt gespeichert. Kultur Schiffe sind bei 37 ° C über Nacht (oder mindestens 2 Stunden vor dem Ausplattieren) und zweimal mit sterilem destilliertem / deionisiertem Wasser direkt vor dem Beschichten. </li><li> VORBEREITUNG PREPLATING GERICHTE: Diese Gerichte werden für Vor-Vernickelung der isolierten Kleinhirn Zellen vor Kultur Gliazellen Verunreinigungen, die eher auf eine niedrigere Konzentration von Substrat haften zu entfernen, um verwendet werden. Coat zwei 60-mm Kunststoff-Petrischalen mit 4 ml pro Schale aus Poly-D-Lysin (100 ug / ml; Hinweis: Dies ist 1 / 5 der Konzentration für die Kultivierung verwendet). Bei 37 ° C über Nacht (oder mindestens 2 Stunden vor ihrer Zerlegung). Kurz vor der Dissektion, entfernen Sie die Poly-D-Lysin-Lösung, das Geschirr abwaschen zweimal mit sterilem Wasser und lassen Sie sie in die Haube zu trocknen. </li><li> Sterilisieren Dissektion Werkzeuge im Autoklaven oder am Tag der Dissektion, tauchen die Werkzeuge in 70% Ethanol für 20 Minuten. Benötigtes Werkzeug: Permaset Schere, Schere microdissecting, vier Dumont Nr. 5 Pinzette. </li></ol> Teil 2: Vorbereitungen für Dissection (Tag der Dissektion) - (demonstriert im Video) Alle der folgenden Verfahren werden in einer Gewebekultur Abzug durchgeführt, sofern nicht anders. <ol><li> Wischen Sie die Sezieren Bereich mit 70% Ethanol. Warm den Medien bis 37 ° C im Wasserbad oder in einem 5% CO 2 37 ° C Inkubator. </li><li> Beim Start einer neuen Papain Dissoziation System Kit (Worthington), bereiten die Lösung von Albumin-Ovomucoid-Hemmer. Fügen Sie 32 mlvon EBSS (Earle Balanced Salt Solution, vorausgesetzt, in dem Kit) an das Albumin-Ovomucoid Inhibitor-Mischung und lassen Sie den Inhalt zu lösen, während der Vorbereitung der anderen Komponenten. Bereiten Sie für den ersten Einsatz, dann speichern Sie die verbleibende Lösung bei 2-8 ° C und verwenden, bis die fünf Isolierungen von jedem Kit erlaubt abgeschlossen sind. </li><li> 5 ml EBSS zu einem Papain Fläschchen aus der Dissoziation Kit (jedes Fläschchen ist ausreichend für die Dissoziation von 4 bis 15 cerebella von postnatalen Tag 5 Mäuse). Legen Sie die Papain Fläschchen in einem 5% CO 2 37 ° C Inkubator oder 37 ° C Wasserbad für 5 bis 10 Minuten, bis die Papain vollständig gelöst und die Lösung klar erscheint. Pflegen Sie die Lösung bei Raumtemperatur während der Präparation. </li><li> Add 500 ul EBSS eine DNase Fläschchen aus der Dissoziation Kit. Vorsichtig mischen, indem Sie die Flasche seit DNase ist scherempfindlichen Denaturierung. Add 250 ul dieser Lösung in die Durchstechflasche mit dem Papain (Endkonzentration 20 Einheiten / ml Papain und 0,005% DNase). Speichern Sie die verbleibenden DNase Fläschchen für den Einsatz in Schritt 5.1 oder 6.1. </li></ol> Teil 3: Dissection und Hirnhäute Removal <ol><li> Das optimale Alter für Granulat Zellkultur von C57BL/6J-Mäuse ist postnatalen Tag 4-6, wenn die Anzahl der Körnerzellen Vorfahren in der EGL peaks1, 10. Dissect Welpen ein zu einer Zeit und wie Sie besser mit den Kleinhirn-Dissektion werden versuchen, Dissektion Zeit, um nicht mehr als 6 Minuten pro Welpe zu reduzieren. Die Geschwindigkeit ist von fundamentaler Bedeutung. Wenn der Percoll-Gradienten Schritt umgangen wird, können bis zu acht postnatalen Tag-5-Maus Welpen genügend Zellen für eine 6-well-Kulturplatte (oder sechs 25-mm-Deckgläser) oder für sechs 4-well-Platten (oder 24 12 RENDITEOPT - mm Deckgläschen). Ungefähre Kapazität beträgt 4 bis 5x106 Zellen pro Welpe und Galvanisieren Dichten kann zwischen 1 und 5x105 Zellen/cm2 Bereich. Da 15-20% Zellen während der Percoll step4 verloren gehen, werden mehr Tiere benötigt, um die gleiche gewünschte Zelldichte zu erhalten. </li><li> Pipette 15 ml HBSS-Glucose in einer 60-mm Kunststoff-Gewebe Kulturschale und 10 ml in ein steriles Falcon 15 ml konische Kunststoffrohr. Auf Eis gelegt. </li><li> Außerhalb der Haube, wischen den Kopf des Welpen mit 70% Ethanol. Verwenden Sie Permaset Schere, um die Welpen zu enthaupten. (Enthauptung wird nicht in dem Video zu sehen sein.) </li><li> In der Haube, halten Sie den Kopf mit einer Pinzette Dumont, so dass man deutlich sehen kann die Rückseite des Schädels. Besuchen Sie das Gehirn, indem Sie microdissecting Schere in das Foramen magnum und Schneiden direkt auf die Augen. Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Haut und heben Sie den Schädel in das Gehirn freizulegen. Mit Dumont Pinzetten, kneifen Sie das Kleinhirn und die umliegenden Mittelhirn und überträgt es auf die Schale mit HBSS-Glucose. (Es ist einfacher, das Kleinhirn zu manipulieren und entfernen Sie die Hirnhäute, wenn das Kleinhirn noch an das umliegende Gewebe im Anhang). </li><li> Unter dem Binokular vorsichtig schälen Meningen aus dem Kleinhirn und auch zwischen den Lappen mit einer feinen Pinzette Dumont Nr. 5, während mit der anderen Pinzette zu verankern sich das Kleinhirn auf die Platte. Sie werden die Blutgefäße auf der Oberfläche des Kleinhirns kündigen. Diese Blutgefäße sind ein guter Weg, um die Meningen zu identifizieren. Entfernen Sie die Hirnhäute, bis das Kleinhirn nimmt eine verfilzte weißes Aussehen. Separate das Kleinhirn vom Rest des Mittelhirns. Schalten sie ihre Bauchseite und entfernen Sie den Plexus, die wie ein rötliches Band zwischen dem ventralen Kleinhirn und den angrenzenden Mittelhirn aussieht. Platzieren Sie jede Kleinhirn in kaltem HBSS-Glucose in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis so schnell wie seziert. Ändern Sie den Sezieren Lösung an die frische HBSS-Glucose nach Sezieren 3 Gehirne. </li></ol> Teil 4: Die Zellsuspension <ol><li> Nachdem alle Sektionen fertig sind, entfernen Sie die HBSS-Glucose aus der Tube und ersetzen Sie es mit dem Papain-Lösung in Schritt 2.4 gemacht. Obwohl das Kit empfiehlt Schneiden des Gewebes in kleine Stücke, so finden wir, dass es nicht notwendig ist, schneiden oder hacken cerebella in diesem Alter. Legen Sie das Gewebe + Papain-Lösung (in einem 15 ml konischen Rohr) in einem 37 ° C Wasserbad oder 5% CO 2 37 ° C Inkubator für 15 bis 20 Minuten. Für 4 bis 8 cerebella, 15 Minuten bei 37 ° C ausreichend ist, für eine größere Anzahl von cerebella 20 bis 30 Minuten ist besser. Vorsichtig geschwenkt, das Rohr alle 3 bis 4 Minuten. </li><li> Man reibt die Mischung mit einem sterilen p1000 Aerosol Pipettenspitze, die mit FBS beschichtet wurde. Führen Sie diesen Schritt sanft, um die Luft Blasenbildung zu verhindern. Feuerpolierte Glaspipetten kann verwendet werden, aber wir finden, dass das Serum beschichteten sterilen p1000 Aerosol Tipps genauso gut funktionieren. Zur Beschichtung der Pipettenspitze mit FBS, Pipette FBS nach oben und unten zweimal kurz vor dem Gebrauch. Etwa 10 Auf-und Abbewegungen mit der Pipette sind genug, um das Gewebe zu distanzieren. Die Lösung wird trüb. Lassen Sie die Suspension für 30-60 Sekunden so sitzen, dass jede große Stücke von undissoziierten Gewebe wird auf den Boden des Röhrchens absetzen. </li><li> Entfernen Sie die suspendierten Zellen (Achten Sie darauf, die undissoziierten Gewebestücke in der b entfernenottom) in ein frisches 15 ml konische Röhrchen mit einem Serum-beschichteten Pipettenspitze. Zentrifuge bei etwa 200xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Resuspension Medium. Um dies zu tun, mischen 2,7 ml EBSS mit 300 ul rekonstituierte Albumin-Ovomucoid Inhibitor-Lösung in einem sterilen Röhrchen. Add 150 ul DNase-Lösung aus Schritt 2.4. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und sofort Zellpellet in die verdünnte DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung in Schritt 4.3 mit einem Serum-beschichteten p1000 Aerosol Pipettenspitze vorbereitet. </li><li> Bereiten Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten wie folgt. 5 ml Albumin-Ovomucoid Inhibitor-Lösung in ein 15 ml konischen Rohr. Sorgfältig Schicht der Zellsuspension an der Spitze. Zentrifuge bei etwa 70xg für 6 Minuten bei Raumtemperatur. Dissoziierten Zellen Pellet am Boden des Röhrchens, bleiben Membranfragmente an der Grenzfläche. </li><li> Wenn Sie Kulturen, die in Körnerzellen angereichert sind erhalten wollen, Bypass der Percoll-Gradienten Trennschritt (die Erträge reiner Kulturen des Kleinhirns Körnerzellen), und fahren Sie mit Teil 6. Wenn Sie weitere Isolierung der Körnerzellen aus Glia und große Interneuronen durch Percoll-Gradienten Trennung wünschen, Teil 5 fortfahren. Die Nutzung der Percoll-Gradienten Schritt verringert sich die Ausbeute der Zellen. In unsere Hände ist die Verminderung der Ausbeute ca. 20-35%. Es gibt jedoch eine Erhöhung der Anreicherung von Nervenzellen Granulat-und Vorläuferzellen aus ca. 90% auf 95-99%. </li></ol> Teil 5: Percoll Gradient Separation <ol><li> Überstand verwerfen und sofort das Pellet in 2 ml HBSS-Glucose mit 50 ul DNase aus Schritt 2.4. Filtern Sie die Zellsuspension obwohl ein Nylonnetz (Porengröße 70 um) durch die Schwerkraft. Dieser Schritt wird zu entfernen große nicht-neuronalen Zellen und sorgt für eine bessere einzigen Zellsuspension. </li><li> Bereiten Sie zwei Feuer-poliertem Glas Pasteur Pipetten. Um dies zu tun, sanft Flamme der Spitze einer Glaspipette, bis die Kante geglättet wird und die Pipette Bohrung beträgt 40-50% der ursprünglichen Größe. Achten Sie darauf, um die Öffnung zu klein. </li><li> Bereiten Percoll-Gradienten. 10 ml 35% Percoll-Lösung in einem 50 ml sterile konischen Rohr. 60% Percoll (10 ml) wird in eine 10 ml sterile Spritze mit einer sterilen Nadel Wirbelsäule belastet. Vorsichtig Schicht der 60% Percoll-Lösung unter der 35% ige Lösung, indem Sie die 60% ige Lösung an der Unterseite des Rohres mit dem Spinalnadel. Achten Sie darauf, halten eine scharfe Grenzfläche zwischen den beiden Schichten. Fügen Sie die Zellen an die Spitze des Gradienten mit einem feuerpolierte Pipette vorsichtig indem Sie sie entlang der Seite des Rohres, ohne die Oberfläche. </li><li> Legen Sie das Rohr in der Zentrifuge und Zentrifuge bei 1800xg. Ramp up der Geschwindigkeit einen Schritt alle 20 Sekunden (in Schritten von Geschwindigkeit sind wie folgt: ca. 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg), so dass es dauert ca. 2 Minuten auf die gewünschte Geschwindigkeit zu erreichen. Starten Sie den Timer bis 10 min bei 1800xg erreicht wird. Wenn Sie fertig sind, verringern Geschwindigkeit allmählich einen Schritt alle 20 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie die obere Schnittstelle des Gradienten (mit großen Glia, Purkinje-Zellen und Interneuronen) und entsorgen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Zellen an der Schnittstelle zwischen 35% und 60% Percoll mit einer feuerpolierte Pipette aufnehmen und in 50 ml konischen Rohr. Resuspendieren in 3 Bänden von HBSS-Glucose und mischen durch mehrmaliges Wenden. Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 1100xg. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und 4 ml 10% FBS-Medium mit 50 ul DNase. Das Pellet vorsichtig mit einem feuerpolierte Pipette auf eine einzelne Zelle Suspension bilden. Gehen Sie auf 6,2 Schritt. </li></ol> Teil 6: Pre-Beschichtung und Plating <ol><li> Überstand verwerfen und sofort das Pellet in 4 ml 10% FBS-Medium mit 50 ul DNase aus Schritt 2.4. Filtern Sie die Zellsuspension obwohl ein Nylonnetz (Porengröße 70 um) durch die Schwerkraft. Dieser Schritt wird zu entfernen große nicht-neuronalen Zellen und sorgt für eine bessere einzigen Zellsuspension. </li><li> Platte die gesammelten Zellen auf Poly-D-Lysin beschichteten pre-Plating-Schüssel für 20 Minuten in einem 5% CO 2 37 ° C Inkubator. Wiederholen Sie mit einem frischen Teller. Die Astroglia und schwerere Zellen niederlassen und sich an die Gerichte und lassen Sie die kleinen Körnchen Neuronen und neuronalen Vorläuferzellen zu schweben. Nach der Inkubation werden locker eingehalten Granulat Neuronen und neuronalen Vorläuferzellen lösen sich leicht und aufgelockert mit leichtes Ausschlagen der Platte. </li><li> Sammeln Sie die Nervenzellen Granulat und Neuron Vorläuferzellen in einem 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge bei 200xg für 5 Minuten. Das Pellet in 1 ml Serum-freiem Medium und zählen ein Aliquot von 10 ul mit einer Zählkammer. </li><li> Add serum-freiem Medium auf die gewünschte Zelldichte erreicht. Grobe Richtlinien, die Zahl der Zellen, die Platte für mittlere Dichte: für 6-Well-Platten, 3,5 bis 4.000.000 Zellen; für 4-Well-Platten, 650.000 Zellen. Für 6-well-Platten, I Platte 1,5 ml / well und für 4 gut plates, I mit 0,5 ml / well. Die Zellen werden in einem 5% CO 2 37 ° C Inkubator gepflegt. Ändern Sie das Medium komplett 24 Stunden später mit späteren Änderungen jeder zwei vor drei Tagen. </li></ol>

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	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).</li><li>Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Culturing Nerve Cells. , 419-419 (1998).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).</li><li>Carletti, B., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).</li><li>Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).</li><li>Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).</li><li>Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).</li><li>Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).</li><li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cerebellar Cortex: Cytology and Organization. , (1974).</li><li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).</li><li>Ruiz I Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development. 126, 3205-3205 (1999).</li><li>Wallace, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li><li>Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).</li><li>Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).</li><li>Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).</li><li>Kenney, A. M., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).</li><li>Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development. 130 (1), 15-15 (2003).</li><li>Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development. 128, 1481-1481 (2001).</li></ol>

Dieses Protokoll basiert auf Modifikationen der Verfahren, die in der Vergangenheit 3,7,11 beschrieben worden sind, basiert. Es gibt einige wichtige Punkte zu beachten wie unten diskutiert. Die Nervenzellen Granulat-und Vorläuferzellen innerhalb von 2 Stunden plating halten. Gesunde Zellen haben einen runden Morphologie unter dem Phasenkontrast-Mikroskop 4. Innerhalb von 24 Stunden nach dem Ausplattieren werden gesunde Zellen gleichmäßig verteilt auf der ganzen Deckgläser oder der Kunststoff gut und Prozess...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer with 70&mu;m mesh pore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinal Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>405182</td>
<td>20G x 3-1/2 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine mol wt>300,000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>Percoll</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-1644</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175-103</td>
<td>Must be calcium and magnesium free.</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal A-Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10888-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamax I supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum Free Supplement (50x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12-mm circle coverslips </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3029</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>25-mm circle coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3037</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>Papain Dissociation System </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
<td>LK 003150</td>
<td>Kit is good for five isolations.</td>
</tr>
<tr>
<td>Permaset scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS6782</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 (Dumostar)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS4978</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140685</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons 

Die Kleinhirnrinde ist eine gut beschriebene Struktur, einzigartige Möglichkeiten zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften und Entwicklung 1,2 bietet. Von den Kleinhirn-Neuronen-Typen (Körnerzellen, Purkinje-Zellen und hemmenden Interneuronen), sind Nervenzellen Granulat bei weitem die meisten und sind die am häufigsten vorkommende Art von Neuronen im Gehirn von Säugetieren. Bei Nagetieren sind zerebelläre Nervenzellen Granulat während der ersten zwei postnatalen Wochen von Vorläuferzellen in der äußersten Schicht der Kleinhirnrinde, die externen Körnerschicht (EGL) generiert. Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt Techniken zu bereichern und Kultur Granulat Neuronen und ihre Vorläuferzellen aus postnatalen Maus Kleinhirn. Wir beschreiben Verfahren Kulturen von zunehmender Reinheit 3,4, die verwendet werden, um die Differenzierung von proliferierenden Vorläuferzellen in Nervenzellen Granulat 5,6-Studie zu erwirken. Sobald die Vorläuferzellen zu differenzieren, die Kulturen auch eine homogene Population von Nervenzellen Granulat für experimentelle Manipulation und Charakterisierung von Phänomenen wie Synaptogenese, Glutamat-Rezeptor-Funktion 7, Interaktion mit anderen gereinigt Kleinhirn Zellen 8,9 oder Zelle Death 7.

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Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und Kultur des Kleinhirns Granulat Neuron Vorläuferzellen und Kleinhirn Nervenzellen Granulat aus postnatalen Maus.

Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

28.4K Aufrufe.  Columbia University. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und Kultur des Kleinhirns Granulat Neuron Vorläuferzellen und Kleinhirn Nervenzellen Granulat aus postnatalen Maus.

Serie: Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

Serielle Anreicherung von Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) in der Kultur für die Ableitung des langfristigen adulten Maus SSC Linien

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...