Wir danken R. Heintzmann für fruchtbare Diskussionen während der Entwicklung des Streifenbeleuchtung Ansatz, K. Rajewsky und A. Habermann für die Bereitstellung von C57BL / 6 B1-8-GFP-transgenen Mäusen. Wir erkennen die Deutsche Forschungsgemeinschaft unter dem Förder NI1167/3-1 (RN), HA5354/4-1 und SFB633, Projekt-A15 (zum AEH), die Charité unter Gewährung Rahel-Hirsch-Stipendium (RN) für die finanzielle Unterstützung. Wir erkennen insbesondere die Netzwerk JIMI für fruchtbare Diskussionen und infrastrukturelle Unterstützung

Mehrstrahl-Einrichtung für Striped-Beleuchtung TPLSM Das hier verwendete Aufbau ist eine Mehrfachstrahl Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskops, wie oben beschrieben 6,20. Das System ist in Fig. 1 dargestellt. Der Ansatz kann auch für andere Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskope, die in der Lage Kameraerfassung mit der Bewegung der galvanometrischen Spiegel synchronisiert sind, auch wenn sie nur in der Lage, Einzelstrahlabtastung durchzuführen sind, angewendet werden, . In diesem Fall wird der Nachteil einer unteren Erfassungsgeschwindigkeit, aber ähnlich wie die Aufnahmegeschwindigkeit in Standard-PMT-basierten TPLSM sein. Um eine optimale Qualität, so weit wie Auflösung und Kontrast angeht zu erreichen, bei der niedrigsten Photobleaching und Lichtschäden und schnellste Erwerb, empfiehlt es sich, die folgenden Bedienschritte des Setup berücksichtigen: <ol><li> Überprüfen Sie die Laserleistung der Laser TiSa: Check bei 100%, Vergleichen mit ursprünglichen Werkseinstellungen und previouns besitzen Lesungen und verwenden Sie es, wie es ist, wenn eine Anregungswellenlänge im Bereich von 700-1000 nm notwendig ist. </li><li> Testen Sie die Fernbedienung Indikation für den Ti: Sa-Strahlteiler, dh überprüfen, 0% und 100%-Einstellungen. Wenn es eine Rest TiSa Strahl auf 100%, dann überprüfen Sie und stellen Sie die Schrittmotor-Null-Stellung. Der Ti: Sa Strahlteiler besteht aus einem niedriger Ordnung λ / 2-Platte und einen Polarisator, der die senkrecht polarisierte Laserstrahlen senkrecht Strahlengänge aufteilt: ein in das Mikroskop zur Anregung gerichtet, der andere verwendet wird, um den optischen parametrischen Pumpe Oszillator (OPO). Durch automatisches Drehen der λ / 2-Platte, eine kontinuierliche Einstellung des Ti: Sa und OPO Leistung bzw. erreicht wird. </li><li> Einstellen des OPO zu der gewünschten Wellenlänge zu messen und die Ausgangsleistung. Wenn die Stromversorgung ist zu gering: Optimierung der Pumpwellenlänge und überprüfen Sie die Einstellungen der th (mit 4 W Ti Sa-Laser bei 800 nm, sollte man in der Lage, 0,8 bis 1 W OPO Strahl auf etwa 1,050-1,100 nm zu bekommen)e Spiegel und der aufgefächerten Kristall. Wählen Sie die empfohlenen optimalen Werte, die oft als Diagramme oder Grafiken zur Verfügung, und dann die Feinabstimmung, bis die OPO Resonanz bei der gewünschten Wellenlänge Ausgang und die Leistung steigt. <ol type="i"><li> Wenn die Stromversorgung immer noch niedrig ist, stellen die beiden zugänglich Spiegel der OPO mit den vier zugänglich Spiegel-Drehknöpfen. Führen Sie diesen Schritt sehr langsam und in sehr kleinen Bewegungen, abwechselnd zwischen den Vorder-und Ende-Spiegel. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie, dass die Ti: Sa und / oder OPO Strahlen treffen auf den Eintrag in der richtigen Spiegel, zentrale Lage. <ol type="i"><li> Verwenden Sie ein Stück weißes Papier (nicht sehr glänzenden oder reflektierenden!) Und eine Infrarot-Viewer zum Betrachten der OPO Strahl und den höheren Wellenlängen-Ti: Sa Balken. <ol type="i"><li> Schutzbrille bei der Arbeit mit NIR-Ti: Sa Strahlen (in der Regel bis zu 720 bis 750 nm ist für die durchschnittliche Person sichtbar). </li></ol></li><li> Set der Laserleistung (en) so niedrig wie möglich für das Ausrichtungsverfahren um minimize potenzielle Augenschäden. </li><li> Halten Sie immer Umgebungslicht des Raumes auf, so dass die Pupille des Auges verengt ist. </li><li> Beachten Sie, dass die Laserleistung ist in Ordnung gesteuert Dämpfungsglieder, bestehend aus einem λ / 2 Platte und Polarisatoren, die in der Tat noch nicht, wenn der Ti: Sa Strahl tritt in den Scan-Kopf! </li></ol></li><li> Überprüfen Sie, dass der Einstiegspunkt Membran ist in der Mitte durch das Ti-Hit: Sa und / oder OPO Strahl; wenn nicht, stellen Sie die letzten zwei Spiegel, bevor der Laserstrahl in den Scankopf. <ol type="i"><li> Verwenden Sie die IR-Viewer und ein kleines Stück weiß (aber nicht glänzend / reflektierende!) Papier. </li><li> Immer nahe der Membran am Eintritt in das Mikroskop, so dass die Laserstrahlposition genauer beurteilt werden. Wichtig: Vergessen Sie nicht, die Membran, bevor zu Schritt 6 wieder öffnen! </li></ol></li><li> Stellen Sie den reflektierten Laserstrahl Lichtpfad in das Mikroskop entsprechend. Tun Sie dies auf kleine Segmente und iterative Strahl-walking. <ol type="i"><li> Überprüfen Sie die gesamte Lichtpfad, wenn die Lichtausgabe von der Objektivlinse ist nicht ausreichend. </li><li> Überprüfen Sie immer den Lichtpfad, wenn das System zum ersten Mal nach einer langen Ruhezeit, eine größere Reparatur, jeder Ersatz von optischen Elementen, oder wenn Probleme stehen im Verdacht, mit der Ausgabe gibt. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, dass alle aktiven optischen Oberflächen sauber sind, vor allem, dass sie frei von Staub sind! Wenn man die Oberflächen mit einer Staubschicht bedeckt ist, wird die Wellenfront, noch bevor in die Objektivlinse verzerrt und die resultierende Laserstrahl wird nie ein scharfes Bild der Probe zu liefern! <ol type="i"><li> Falls notwendig, reinigen Sie die Spiegel mit einem gefalteten Stück Papier Objektiv, mit Ethanol oder Isopropanol befeuchtet. </li></ol></li><li> Prüfen Sie, ob der Strahl kommt wieder zum Spiegel, der direkt über dem Eingang Spiegel am Ende des Prismas-basierten Pulskompressor befindet, nachdem der Lichtpfad festgelegt ist. Von hier aus wird der Strahl reflektiert into der Strahlmultiplexer (BM). </li><li> Überprüfen, ob der Laserstrahl auf die Membran, die am Eingang der Strahlmultiplexer befindet, direkt vor der λ / 2-Platte, die Änderung der Polarisation des Laserstrahls, um die Anforderungen an ein Breitband 50% Transmission und 50% Reflexion zu passen innerhalb der BM. <ol type="i"><li> Schließen Sie zunächst die Membran, so dass die Strahlposition genauer beurteilt werden und führen Strahl Fuß zwischen den beiden Membranen, dh dem bei der Eintragung in das Mikroskop und die andere an der BM-Eintrag. Für andere Single-Beam-Scanning-Mikroskope die Membran sollte bei der Einreise in der xy-Scanner befinden. </li><li> Wenn der Strahl nicht traf die Mitte des stillgelegten Öffnung, passen Sie die oben genannten Spiegel, direkt vor der BM Eintrag Membran platziert. Wichtig: Vergessen Sie nicht, die Membran, bevor zu Schritt 10 wieder zu öffnen. </li></ol></li><li> Mit Wiedereröffnung der Membran, überprüfen Sie, ob der Laserstrahl auf die BM-Spiegel inihre Mittelpunkt. Verwenden Sie einen schmalen Papierstreifen, um nicht zu einem anderen Teil des BM komplexen Lichtwege zu blockieren! </li><li> Prüfen Sie, ob der Strahl auf die Mitte der Ausfahrt Spiegel: top Spiegel für parallele Polarisation &quot;P&quot;, Bodenspiegel für senkrechte Polarisation &quot;S&quot;. Wenn nicht, stellen Sie den Eintrag vor dem Spiegel BM. </li><li> Überprüfen Sie, ob das &quot;S&quot; und &quot;P&quot; polarisierten Strahl lässt Gruppen geben Sie die Polarisator-Würfel und überschneiden sich entsprechend bei der Einreise in der xy-Scanner. Überspringen Sie diese Schritte, falls ein Single-Beam-Scanning-Mikroskop verwendet. </li><li> Überprüfen Sie, ob das Laserlicht geht zentral den Scan und die Rohrlinsen und bekommt durch die Mitte der Objektivlinse &quot;hinteren Brennebene. Hinweis: dieser Schritt muß mit dem Laserstrahl in Mittelstellung durchgeführt werden, nicht in einer Parkstellung! <ol type="i"><li> Ersetzen Sie das Objektiv mit einem Ziel-Werkzeug (&quot;Bullauge&quot;) und überprüfen, ob der Laserstrahl auf das Ziel in der Mitte, und ob dieAusleuchtung ist gleichmäßig. </li><li> Wenn dies scheint der Fall zu sein, schließen Sie die Blende vor der BM und prüfen, ob eine kreisförmige Interferenzmuster erscheint, mit einem schwarzen Kreis in der Mitte (Interferenz Minimum). <ol type="i"><li> Stellen Sie den Eintrag Spiegel, wenn es eine deutliche Verschiebung in Bezug auf die Mitte der ins Schwarze. </li></ol></li></ol></li><li> Jetzt ersetzen Sie das Bullauge mit einer Objektivlinse, z. B. mit einem 20-fach Wasserimmersionsobjektiv. <ol type="i"><li> Überprüfen Sie die Ausgangslichtfeld mit einem Stück weißem Papier. Dies sollte helle, gleichmäßige und zentral positioniert sein. </li><li> Messen Sie die Ausgangsleistung: bei 100% OPO mit 100% Pump Ti: Sa (4 W), sollte man ca. bekommen. 100-150 mW nach der Linse bei 1100 nm (im Mikroskop verwendet). Niederlaserleistungen wird nicht ausreichen für die Durchführung Mehrstrahl-SI-TPLSM. Für Single-Beam-Scanning-SI-TPLSM sind 5-10 mW ausreichend. Der Laserstrahl muss in der Mittelstellung, ohne scanne bleibend! </li></ol></li><li> Bei Durchführung MB-SI-TPLSM, richten Sie die Spiegel in der BM, wie folgt: <ol type="i"><li> Legen Sie ein homogen fluoreszierende Probe, z. B. eine rote Fluoreszenz Rutsche, auf der Bühne und fokussieren den Laserstrahl im Inneren der Probe aber in der Nähe der Oberfläche (dh nahe an der Objektivlinse &quot;vorne). </li><li> Stellen Sie das Mikroskop auf die Mehrstrahl-Modus zu wählen und die Anzahl der Strahlen am Anfang, vorzugsweise nur ein Strahl, und die Polarisation, z. B. &quot;P&quot;. <ol><li> Finden Sie den Laserstrahl durch Abbildung der Leuchtstoffschlitten: stellen Sie die &quot;P&quot;-Verschluss geöffnet und führen Sie die CCD-Kamera kontinuierlich, während die Fokussierung des Strahls. </li><li> Sicherstellen, dass der Strahl in der Mittelposition, und daß der Scanner ausgeschaltet ist. Stellen Sie sicher, dass der Strahl nicht gescannt! </li><li> Finden Sie den Strahl von der Suche nach einem Lichtblick in der Nähe der Mitte der Kamera-Chip. </li><li> Fokus des Strahls, bis der Fleck ist der hellste und schärfste, dh der Bildebenedas Mikroskop entspricht der Position des Kamerachips; Verringerung der Laserleistung, so dass der Spot ist nicht gesättigt. Mit einem gut ausgerichteten System bedeutet dies, dass die Laserleistung muss in der Nähe sein, wenn mindestens die in der Ein-Strahl-Modus (ca. 0,6 mW Laserleistung funktionieren sollte). </li><li> Wenn der Punkt ist deutlich aus der Mitte, bewegen Sie es näher an der Mitte durch Einstellen der Spiegel vor die BM (oder der Scanner für Single-Beam-Scanning). </li><li> Wenn auch andere Ausrichtung der Polarisation, also &quot;S&quot;-Balken, jetzt 2-Strahl-Modus zu wechseln, öffnen Sie die &quot;S&quot;-Verschluss und überprüfen Sie die Position des Trägers (nur ein Strahl gesehen werden kann, wenn nur die &quot;S&quot;-Verschluss geöffnet ). </li><li> Wenn Sie fertig sind, um 4-Strahl-Modus zu wechseln und das &quot;P&quot;-Modus Polarisation (&quot;P&quot; Shutter offen). Nun sind zwei Teilstrahlen erscheint. </li><li> Ordnen Sie die beiden Teilstrahlen perfekt parallel werden, um den unteren Rand der Kamera-Ansicht und setzen Sie sie auf 2,8 um voneinander entfernt sein. <ol type="i"&gt; <li> Wenn sie nicht richtig ausgerichtet ist, stellen die ersten Spiegel des BM. </li><li> Nie richten Sie die Schraube in der Mitte, verwenden Sie stattdessen die beiden peripheren Schrauben, um den Spiegel zu bewegen, bis die beiden Strahlen sind 2,8 ähm auseinander und perfekt horizontal angeordnet. </li></ol></li><li> Nun zu 8-Strahl-Modus wechseln in &quot;P&quot; Polarisation, und stellen Sie die zweite BM Spiegel (auch ohne roten Punkt), bis die vier Teilstrahlen gleich weit bei 2,8 um, und parallel zur Unterkante des Bildes angeordnet. </li><li> Wiederholen Sie in 16 - und 32-Strahl-Modus, die Anpassung der 3. und 4. BS Spiegel auf. Es ist wichtig, dass die Teilstrahlen äquidistant sein, weil SI-Algorithmen, die einfachste wobei der Min-Max (HiLo-Algorithmus), werden auf dieser Annahme. </li></ol></li></ol></li><li> Ersetzen Sie die gleichmäßig fluoreszierende Probe mit einer heterogen strukturierten ein, z. B. Querbunt Convallaria Wurzeln. <ol type="i"><li> Gehe zu der Parkposition des Anregungsstrahls, werden ist in der Regel bei großen Werten der Scanner Koordinaten, zB (; 10.000 10.000) gegeben. </li><li> Scannen Sie eine (Multi-Strahl) Bild mit der CCD-Kamera. Überprüfen Sie, ob das Bild erscheint scharf, gleichmäßig und gerade. </li><li> Stellen Sie die Kamera, wenn das Bild erscheint gedreht: Drehen Sie das Kameragehäuse axial um die vertikale Achse von Hand (sanft sein!), Bis das Bild begradigt. </li></ol></li><li> Starten Sie den xy-Scanner, um den Scanvorgang zu steuern, um die Erregungsmuster, dh gestreift Bild zu erzeugen. <ol type="i"><li> Im Falle der Mehrstrahl-Scanning, bewegen Sie den y-Scannerspiegel, dh. senkrecht zu der Teilstrahl Linie derart, um eine quadratische Bildstreifen erzeugen. </li><li> Wenn das Sichtfeld erzeugt wird, wie in Schritt 17.1 beschrieben. zu klein ist, erstrecken sich die Scan-Routine, indem Sie den x-Scanner-Spiegel auf eine Position um sicherzustellen, dass der Strahl-let Linie verdoppelt wird und die Teilstrahlen gleich weit auf der ganzen Linie. Wiederholen Sie die exakte Bewegungder y-Scannerspiegel nach der x-Scannerspiegel bewegt wird, um das größere Bild gestreiften erzeugen. </li><li> Im Fall von Single-Beam-Scanning, wechseln die y-Scanner-Spiegelbewegung mit x-Scannerspiegel Bewegung immer wieder in gleichen Positionen - vom Wissenschaftler definiert - um das gewünschte Bild zu erzeugen gestreift. </li><li> Achten Sie darauf, für die Bewegung der y-Scanner-Spiegel ein Befehl zum konstanter Geschwindigkeit (reduzierte Beschleunigung / Verzögerung) und für die x-Scanner-Spiegel ein bei maximaler Geschwindigkeit (maximale Beschleunigung / Verzögerung) zu verwenden. </li></ol></li><li> Automatisch erfassen und speichern Sie die gestreiften Bild mit der Kamera (Feld-Detektor). Deshalb, synchronisieren Sie die Kamera mit dem Scanner und verwenden Sie den Scanner als Master-Trigger. </li><li> Wiederholen Sie den Erwerb gestreiften Bilder, indem Sie den x-Scannerspiegel an verschiedenen Positionen wie folgt (in Protokoll 17 beschrieben Scan-Protokoll): <ol type="i"><li> Wählen Sie genug Wiederholung Schritte und die entsprechende Schrittlänge zwischenzwei Folge gestreiften Bilder, um den Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Teilstrahlen (in diesem Fall 2,8 um und einen Schritt der Scannerspiegel gleich 25 nm) abdecken; kann es ratsam sein, ein wenig überlappen zu lassen, dh eine zusätzliche 0,3 bis 0,4 um. </li><li> Stellen Sie die x-Verschiebung zu einem Wert, der die laterale Auflösungsgrenze bei der vorgegebenen Wellenlänge entspricht. Als ein Beispiel unter Verwendung von 10 Schritten der x-Scannerspiegel pro Schicht und 12 oder 13 Schichten führen zu besten sowohl axialer und lateraler Auflösung führt in diesem System. Prüfen Sie mit einer strukturierten Folie, z. B. Convallaria Wurzeln Rutsche, die Zahlen funktionieren am besten im System verwendet werden. </li><li> Optimieren Sie diese beiden Werte, bis der Convallaria Bild wird das schärfste: Linie Profilwerkzeug auf den berechneten SI Bilder und vergleichen Sie die Breite der Linienprofile (die das Fluoreszenzsignal von Convallaria Zellwände). </li><li> Erwerben Sie jedes Bild mit dem gestreiften Scannerbewegung synchronisiert und separat speichern, z. B. </em&gt; als TIFF-oder Binär-Dateien. </li></ol></li><li> Öffnen einen vollständigen Satz von Streifenbildern als Matrizen, also 3D-Matrix, in der Auswertungsroutine und entweder das Minimum-Maximum-Algorithmus oder einen Fourier-Transformationsalgorithmus, um eine 2D-Matrix der hochauflösenden SI-Bild zu erzeugen. Die Algorithmen wurden bereits im Detail 20 beschrieben. </li></ol> Mäuse Immunisierung und Vorbereitung für die Intravital Imaging Die Tierversuche wurden von den zuständigen staatlichen Komitees für den Tierschutz (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) zugelassen und wurden in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien und Vorschriften (Tierversuch Lizenz G0153/08) durchgeführt. <ol start="21"><li> Die Induktion einer Antwort Keimzentrum in der Popliteallymphknoten und Vorbereitung des Abbildungsfeldes 4 wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Reinige B-Zellen aus der Milz immunomagnetisch von B1-8 + / + J &amp;kgr; - / -und B-Zellen von B1-8 + / + J &amp;kgr; - / - GFP +-Mäusen. </li><li> Injizieren intravenös 3 x 10 6 NP-spezifische B-Zellen mit einer Reinheit von&gt; 95% unter Verwendung von ⅛ B1-8 + / + J &amp;kgr; - / - GFP + und ⅞ nichtfluoreszierenden B1-8 + / + J &amp;kgr; - / - in C57BL / 6 Empfänger . </li><li> Einen Tag nach der Zellübertragung immunisieren die Empfänger mit 10 ug NP-CGG (Nitrophenyl-Huhn ɣ Globulin) in komplettem Freund-Adjuvans (CFA) in die rechte Hinter Essen Pad emulgiert. </li><li> Etikett Fab-Fragmente von Antikörpern, die mit anti-CD21/CD35 ATTO590-Succinimidylester. <ol type="i"><li> Um das Netzwerk von follikulären dendritischen Zellen (FDC) innerhalb der Keimzentren in vivo zu markieren, zu injizieren 10 ug Fluorochrom-markierten Fab-Fragmente in die rechte Hinterpfote der Mäuse 12-24 h vor Intravital Analyse durchgeführt. </li></ol></li></ol> Die folgenden Schritte sollten conside seinrot für die Herstellung der Popliteallymphknoten zur intravitalen Imaging (8-10 Tage nach der Immunisierung): <ol start="25"><li> Maus anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin, die Menge in Abhängigkeit von ihrem Gewicht. </li><li> Testen Reflexe, um die Narkosetiefe über die gesamte Bild Zeitraum zu überwachen. </li><li> Rasur Bein, Rücken und rechten Flanke der Maus strenge und Haarentfernungscreme verwenden, um das restliche Haar vollständig zu entfernen. </li><li> Fix rechten Trochanter major: locate knöchernen Chip mit Finger, legen Sie einen kleinen Hautschnitt mit der Schere bis eine kleine weiße Dreieck-förmige Blende angezeigt. </li><li> Klemmen Sie knöchernen Chip unter dieser Faszie mit spitzen Pinzette der Verzögerer. </li><li> Fix die Wirbelsäule in Lendenbereich mit gezahnten Pinzette. </li><li> Fix rechten Hinterbein auf Rainer und die Schraube anziehen. </li><li> Tape-Schwanz, das Bein in der richtigen Position zu halten. </li><li> Am kaudalen Seite des Oberschenkels, erstellen Sie einen Schnitt in der Haut, in den Bereich, wo der prominente V. poplitea enters das Gewebe, trennen Sie die Haut von der darunter liegenden Gewebe mit stumpfen Pinzette und folgen der V. poplitea von proximal nach distal. </li><li> Setzen Sie die Lymphknoten mit stumpfen Pinzette, versuchen zu vermeiden, schneiden, um die feinen Lymphgefäße schützen (halten die Lymphknoten in PBS während der Belichtung). </li><li> Erstellen Sie einen Kreis von Vakuumfett rund um die Lymphknoten, füllen diese Pfütze mit PBS. </li><li> Setzen Deckglas in seiner Position und legen Sie die Thermometer-Sonde (halten Temperatur bei 37 ° C, da sonst die Zellgeschwindigkeit drastisch variieren). </li><li> Entlang der oberen Kante des Deckglases fügen einen Kreis von Vakuumfett. </li><li> Setzen Sie die Heizspirale in ihrer Position auf dem Vakuumfett, eine Dichtung zu schaffen, in einer ähnlichen Weise wie zuvor und Wasser hinzufügen / PBS auf dem Deckglas, um das Ziel zu tauchen. </li><li> Nach der Bilderzeugung wird die Maus in Narkose gehalten werden, während die Erhöhung der Dosis von Ketamin / Xylazin zu einer tödlichen Dosis, gefolgt durch zervikale Dislokation. </li></ol>

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Volker Andresen ist Gesellschafter der LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Deutschland. Die anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Das Ziel der Intravital optische Bildgebung ist es, zelluläre Motilität und Interaktionen, um Gewebe-und Organfunktion in Gesundheit und Krankheit zu verstehen 5 dynamisch und funktional zu visualisieren. Die leistungsstarke Technologie, um diese, Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie zu erreichen, muss noch Einschränkungen in Bezug auf Frontverzerrungen, Streuen, langsam Erwerb, Bleichen und Lichtschäden, die ihre räumliche Auflösung begrenzen Welle überwinden, Kontrast sowie die Zeitauflösung . ...

Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM), mit seinen Vorteilen für die tiefen Gewebe-Bildgebung mit Infrarotultrakurzpulsanregung ein Zusammenhang hat unsere Sicht auf Lebensprozesse auf Einzelzellebene durch die Enthüllung Motilität und Interaktionsmuster der verschiedenen revolutioniert Zell-Untergruppen in lebenden Tieren 05.02. Allerdings ist aktuelle Technik noch nicht ausreichend, um die Mechanismen der Organfunktion und Dysfunktion als Voraussetzung für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu klären, da es nur spärliche Informationen über die molekularen Grundlagen der Zellantwort im Gewebe in Gesundheit und Krankheit macht. Die derzeitige Technologie ermöglicht nur eine räumliche Fenster einige hundert Mikrometer aufgrund von Streuung und Wellenfront-Verzerrungseffekte auf die räumliche Auflösung und Signal-zu-Rausch-Verhältnis 6, die in der sehr kompakten Gewebe von erwachsenen Tieren besonders offensichtlich sind. Aufgrund einer sehr heterogenen Diese Streuung und ein Wellenfrontverzerrungseffekte sindd anisotrope Verteilung des Brechungsindex im Gewebe, was in einem ersten Schritt bis zu einer Tiefe abhängige Verschlechterung der 3D-Raumauflösung und schließlich zum völligen Verlust der Signal aus ballistischem Anregungsphotonen, also Verlust des Signal-zu-Rausch-Verhältnis Ursprung. In Bezug auf die biowissenschaftliche und biomedizinische tiefen Gewebe Anwendungen bedeutet dies, dass die aktuelle Technologie ist nicht eindeutig offenbaren zellulären Kommunikation, weil schlechte Auflösung würde zu falsch positiven Wechselwirkungen führen, während die Abnahme des Signal-zu-Rausch-Verhältnis würde dazu führen, das System einige Blick Wechselwirkungen zwischen schwachen Strukturen. Um die zelluläre Interaktionen eindeutig erkennen dynamische Weise wird eine stark verbesserte räumliche Auflösung tief im Gewebe erforderlich. Die aktuell eingeführte leistungsstarke Nanoskopie Techniken, die auf spezielle numerische Algorithmen, wie zB Struktur-Beleuchtung Ansätze, auf Erschöpfung des ersten angeregten Zustand, z. B. </em&gt; STED, RESOLFT oder auf Molekül-Lokalisierung, zB dSTORM, PALM, haben viele Anwendungen in fixierten Zellen als auch in Live-Zellkulturen 7 gefunden. Allerdings, um diese Anwendungen zu Gewebeschnitten, lebendes Gewebe und Organismen erweitern wir müssen noch ernsthafte technische Schwierigkeiten zu überwinden. Zwei-Photonen-Anregung mit unterschiedlichen Wellenlängen als auch mit einer einzigen Wellenlänge (sw2PE-STED) zur Anregung STED und stimulierte Emission wurde angewandt, um die laterale Auflösung in Hirnschnitten 8 oder in künstlichen Matrizen verbessern mit eingebetteten Zellen 9, die jeweils an der gleichen axiale Auflösung als Standard TPLSM. Mit einem STED-Photonen, die Dynamik der dendritischen Dornen konnte an der Oberfläche der Hirnrinde (bis zu 10-15 um Tiefe) in einem lebenden Thy1 EGFP-Maus mit einer Auflösung von 67 nm 10 abgebildet werden. Ein vielseitiges Werkzeug für Entwicklungsbiologie wird von der multifokalen strukturierten Beleuchtung Mikroskopie, die zwei-fach verbesserte 2D bereitstelltAuflösung. Allerdings kann diese Technik nur in Organismen mit einer geringen Neigung der Lichtstreuung wie Zebrafischembryonen 11 verwendet werden. Dennoch kann keine dieser Techniken in der hoch-streuendem Gewebe erwachsener Tiere in mehreren hundert Mikrometern, die entscheidend Modelle für die biomedizinische Forschung und klinische Erkrankungen bei Einsetzen nach der Geburt angewendet werden. Unabhängig von der Näherung verwendet, um den beugungsbegrenzten Wellenfrontform zu berechnen, dh die Punktverteilungsfunktion (PSF), nach der Fokussierung durch eine Linse, mindestens dreimal größer ist als die Breite der PSF entlang der optischen Achse (axialer Auflösung) die PSF Breite senkrecht zu der optischen Achse (laterale Auflösung) 12. Wellenfrontverzerrungen durch verschiedene Aufträge Zernikes Koeffizienten quantifiziert die Wellenfrontform von fokussierten elektromagnetischen Welle in tiefen Gewebe-Bildgebung, die zu viel größeren PSFs, vor allem entlang der optischen erheblich ändernal Achse 13-15. Daher sind sowohl die Beugungs Gesetze und die Wellenfrontverzerrungseffekte verweisen auf die Auflösung entlang der optischen Achse als limitierender Faktor bei tiefen Gewebe-Bildgebung. Während Nanoskopie-Techniken konzentrieren sich auf entgegen die Grenzen der Beugungs nur, eine Technologie, die axiale Auflösung und Kontrast entgegenwirkt sowohl Beugung und Wellenfront-Verzerrungseffekte verbessert wird zur hochauflösenden Intravital Bildgebung notwendig. Idealerweise sollte diese Technik auch schnell genug, um die Überwachung der zellulären Dynamik zu ermöglichen. Die Echtzeit-Korrektur von Aberrationen und PSF Kontrastverlust mit Hilfe der adaptiven Optik in TPLSM wurde ausgiebig untersucht und in den letzten zehn Jahren 13,14,16-18 verbessert und es ist daher die derzeit besten Wahl, die zu einer besseren Verwaltung der ballistischen Erregungs 14 Photonen. Dennoch, aufgrund der Tatsache, dass die meisten Wellenfrontkorrektur Ansätze in der adaptiven Optik verwendet werden, sind iterative und dass sie have für kleine Flächen (einige 10 x 10 &amp;mgr; m 2) aufgrund der hohen Heterogenität des Brechungsindex in Gewebe wiederholt werden, ist die Erfassungsgeschwindigkeit wesentlich geringer als für die Bildgebung Zellmotilität und Kommunikation erforderlich. Darüber hinaus ist die physikalische Grenze in der adaptiven Optik-TPLSM verbessert wird immer noch von Beugung bestimmt. Räumliche Modulation der Beleuchtung (SPIN) und zeitliche Modulation auf der Erfassungsseite (SPADE) wurden theoretisch vorgeschlagen, Laser-Scanning-Mikroskopie eingesetzt, um die Auflösung zu verbessern. Ihre praktische Anwendung in der Intravital Bildgebung noch zu 19 nachgewiesen werden. Zusammengenommen gibt es eine hohe Nachfrage nach der Entwicklung von Technologien, die die Auflösung für die tiefen Gewebe-Bildgebung in lebenden erwachsenen Tieren zu verbessern. In dieser Arbeit erreichen wir räumliche Modulation des Anregungsmusters durch Steuern der Scan-Vorgang in Mehrstrahl-Beleuchtungsstreifen Multi-Photonen-Laser-sKonservenmikroskopie (MB-SI-MPLSM) 20. Im Gegensatz zu strukturierten Beleuchtung Ansätze, in denen die Anregungsstrahlquerschnitt räumlich moduliert ist, verwenden wir nur den Scan-Vorgang, um die räumliche Modulation der Anregung zu erreichen. Mit dem Ausbau der Anregung zu einer längeren Wellenlänge, wir sind in der Lage, sowohl die räumliche Auflösung und Signal-zu-Rausch-Verhältnis im tiefen Gewebe von stark streu Gewebe (z. B. Lymphknoten, frei Streupfad 47 um 6) zu verbessern, unabhängig von der optischen nichtlineare Signal wir erkennen, z. B. Fluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen oder anderen Frequenzmischphänomen. Unter Verwendung dieses Ansatzes bei Anregungswellenlängen bis zu 900 nm sind wir in der Lage, dynamisch Bild zellulären Proteinstrukturen in der Größenordnung von wenigen Molekülen in Keimzentren der Lymphknoten der Maus. So kann man besser die Interaktion zwischen Antigen tragenden Einheiten auf der Oberfläche der follikulären dendritischen Zellen und B-Zellen sichtbar in dem Verfahren zum Testen des Antigen während der Immunantwort in sekundären lymphatischen Organe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">ATTO590 &#8211; NSH for coupling</td>
			<td style="width:99px;">ATTO Tec, Germany</td>
			<td style="width:119px;">AD-590-35</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">CD21/35 &#8211; Fab fragment &#8211; ATTO590</td>
			<td style="width:99px;">DRFZ, Berlin</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">B1-8 Jk-/- EGFP+</td>
			<td style="width:99px;">Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment&#160;</td>
			<td style="width:99px;">StemmCell Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">19854</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Polystyren beads (605), 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:99px;">Life Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">F8803</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">TriMScope I</td>
			<td style="width:99px;">LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OPO (manual version)</td>
			<td style="width:99px;">APE, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td style="width:99px;">Coherent, Duisburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm</td>
			<td style="width:99px;">Olympus Germany, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly resolved intravital striped-illumination microscopy of germinal centers

Überwachung zellulären Kommunikation durch Intravital tiefen Gewebe Multi-Photonen-Mikroskopie ist der Schlüssel für das Verständnis, das Schicksal von Immunzellen in dicken Gewebeproben und Organe in Gesundheit und Krankheit. Durch die Steuerung der Scan-Muster in Multi-Photonen-Mikroskopie und Anwendung geeigneter numerischer Algorithmen, eine gestreifte-Beleuchtung Ansatz entwickelten wir, was uns ermöglicht, zu erreichen 3-fach bessere axiale Auflösung und verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis, dh dagegen in mehr als 100 &amp;mgr; m Gewebetiefe in stark streu im Vergleich zu Standard-Multi-Photonen-Mikroskopie Gewebe des lymphatischen Organe. Die Aufnahmegeschwindigkeit sowie Bleichen und Lichtschäden Wirkungen waren ähnlich wie Standard-Photo-Multiplier-basierte Technik, während die Bildtiefe etwas geringer durch den Einsatz von Felddetektoren. Durch die Verwendung der Streifenbeleuchtung Ansatz sind wir in der Lage, die Dynamik der Immunkomplex-Ablagerungen auf sekundären follikulären dendritischen Zellen zu beobachten ̵1; auf dem Niveau von einigen Proteinmoleküle in Keimzentren.

Die räumliche Auflösung in Lymphknoten Die Dimensionen der effektiven Punktbildfunktion (epsf) entsprechen der räumlichen Auflösung eines Mikroskops 12. Wir messen diese dreidimensionale Funktion durch den Erwerb der zweiten Harmonischen Generation Signal von Kollagenfasern in Lymphknoten durch unsere MB-SI-TPLSM im Vergleich zu etablierten Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie-Techniken, dh Felderkennung TPLSM (mittels CCD-Kameras) und Punkterkennung TPLSM (mittels P...

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Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &amp;mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

highly-resolved-intravital-striped-illumination-microscopy-germinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Aufrufe.  Leibniz Institute.  Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen. 

Serie: Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...