Die intravitale Mikroskopie der kleinen Darmschleimhaut kann Einen Einblick in die raumzeitliche Dynamik zellulärer Wechselwirkungen innerhalb des Epithels zwischen verschiedenen Immunzelltypen oder zwischen diesen beiden Kompartimenten geben. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Erfassung von hochgeschwindigkeits- und hochauflösenden Bildern in der Darmschleimhaut in Echtzeit ermöglicht. Live-Bildgebung des Darms kann zusätzliche Einblicke in die zellulären Wechselwirkungen bieten, oder Zellsignalisierung beteiligt in SchleimhautImmunität, Epithelbiologie oder Krebsbiologie.
Dies ist eine anspruchsvolle Methode, die Die Praxis der chirurgischen Technik erfordert, sowie Geduld und optimale Positionierung der Maus für die Bildaufnahme. Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in einer anästhesierten transgenen Maus bestätigt haben, indem sie ein verbessertes grünes fluoreszierendes Protein oder EGFP, Gamma-Delta-T-Zell-Rezeptor, exezieren, verwenden Sie eine Tuberkulinspritze, um langsam 200 Mikroliter frisch zubereitete Hoechst 33342 Farbstofflösung in die retro-orbitale Venensaus zu injizieren. Ein bis zwei Minuten nach der Injektion Salbe auf die Augen des Tieres auftragen, damit sie nicht austrocknen.
Dann machen Sie einen 2CM vertikalen Schnitt durch Haut und Peritoneum, entlang der Mittellinie des Unterbauchs und verwenden Sie abgewinkelte Zangen, um das Caecum vorsichtig aus der Peritonealhöhle zu ziehen. Identifizieren Sie einen 2-3CM Bereich des Dünndarms, der minimale Fäkaliengehalte enthält, wobei darauf zu achten ist, die mesenterischen Blutgefäße nicht zu zerreißen, und kehren Sie vorsichtig das Caecum und den verbleibenden Dünndarm in die Peritonealhöhle zurück, so dass das Segment des Interesses externisiert bleibt. Platzieren Sie zwei Paar Zangen auf beiden Seiten der Unterstreichen Senterie zwischen den Blutgefäßen, reiben Sie sanft die Spitzen der Zange zusammen, um ein Loch in der Membran zu schaffen.
Mit abgewinkelten Zangen und einer gekrümmten Kegelspitze, die an einer 5CM-Naht befestigt ist, dringen Sie eine Seite des Peritoneums durch das Loch in der Membran und durch die andere Seite der Peritonealauskleidung, indem Sie eine Naht an der Spitze und eine andere in der Nähe der Unterseite des Schnitts platzieren, um den Schnitt zu schließen, während die Darmschleife externisiert bleibt. Um die Erfolgswahrscheinlichkeit zu erhöhen, binden oder reißen Sie keine Blutgefäße, während Sie die Bauchnaht platzieren und begrenzen Sie jede fremde Handhabung des Darms. Schließen Sie dann die Haut unter der Darmschleife auf die gleiche Weise, indem Sie eine Naht in die Mitte des Schnittes zwischen den vorherigen Nähten im Unterstreichungsperitoneum legen.
Mit hilfe einer Elektrokauterie eine Perforationslinie entlang der antimesenter Grenze bilden und sofort ein paar Tropfen Wasser auf die Darmoberfläche auftragen, um zusätzliche hitzeinduzierte Gewebeschäden zu verhindern. Blot mit einem Kimwipe, um Restwasser zu entfernen. Verwenden Sie eine Vanna-Schere, um einen ca. 1,5CM horizontalen Schlitz an der distalen Kante des kauterisierten Gewebes entlang der Länge der kauterisierten Linie in Richtung des proximalen Endes des externalisierten Gewebesegments zu schneiden.
Wenn die Schleimhautoberfläche freigelegt wird, bedecken Sie den Bauch mit einem feuchten Kimwipe, um das Gewebe hydratisiert zu halten. Für Spinning Disk Confocal Microscopy Imaging transportieren Sie die Maus zum Mikroskop in einem abgedeckten Gefäß. Starten Sie die Bildgebungssoftware und kippen Sie den Kopf des Mikroskops zurück, und fügen Sie 150 Mikroliter von 1 Mikromolar Floh Alexa Fluor Farbstoff und Hank s Buffered Saline Solution auf dem Glasdeckel rutschten Boden.
Positionieren Sie die Maus so, dass die geöffnete Schleimhautoberfläche direkt mit dem Deckslip in Kontakt steht. Legen Sie die Maus und die Schale in einem vorgewärmten Inkubator auf die Bildstufe. Legen Sie die Anregungsintensität und Belichtungszeit für jeden Laser auf nicht mehr als 10-15 Milliwatt bzw. 120-150 Millisekunden fest, und passen Sie den Frame-Durchschnitt auf 2 an.
Aktivieren Sie die Funktion Elektronen-Multiplizieren, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren, und wählen Sie die 63X Objektivkalibrierung aus, um eine korrekte Messung der Pixelgröße sicherzustellen. Visualisieren Sie die Kerne manuell, um ein Feld von Zotten zu lokalisieren, in dem es an spürbarer Bewegung oder Drift mangelt, wodurch Bereiche der Artefaktbewegung durch Atmung, Peristaltik oder Herzschlag vermieden werden. Zeichnen Sie mit dem X-Y Scan die X-Y-Koordinate des Interessensfeldes auf und wechseln Sie zum Glycerin-Immersion 63X-Objektiv.
Erfassen Sie ein Live-Bild auf dem 405-Nanometer-Kanal für bis zu 1 Minute, um zu bestätigen, dass die Zotten im ausgewählten Feld stabil sind, während Sie den Fokus anpassen, um die orthogonale Ebene direkt unter der Villusspitze zu finden. Dann erwerben Z-Stacks, beginnend von direkt unterhalb der Villus-Spitze Epithel, etwa 15-20 Mikrometer bis zum Villus, bis es schwierig ist, die Kerne zu lösen, mit 1,5 Mikrometer-Schritten. 3-5 Minuten nach Beginn der Erfassung, bestätigen Sie die Bildstabilität und die Gamma-delta Intraepithelcell Motility, und weiterhin Bilder für 30-60 Minuten für jedes Feld der Zotten zu erfassen.
Gamma-Delta Intraepitheliale Lymphozyten zeigen ein dynamisches Überwachungsverhalten, bei dem sie das Epithel patrouillieren, indem sie entlang der Kellermembran in den lateralen interzellulären Raum im Studienzustand wandern. In diesen repräsentativen Bildern zeigen die farbigen Spuren die Migrationspfade einzelner Gamma-Delta Intraepithellymphozyten im Laufe von 30 Minuten an. Obwohl die Häufigkeit von Intraepithelulären Lymphozyten im lateralen interzellulären Raum bei Mäusen erhöht wurde, die mit Anti-Interleukin-2-Rezeptor-Beta-Antikörperbehandelt wurden, zeigten mehr als 30% dieser Gamma-Delta Intraepithellymphozyten ein Leerlaufverhalten.
Dieser im Leerlauf abfallende Phänotyp wurde durch eine signifikante Verringerung sowohl der Momentangeschwindigkeit als auch des Einschließungsverhältnisses der Gamma-Delta Intraepithel lymphozyten nach Interleukin-2-Rezeptorblockade im Vergleich zu Kontrollen bestätigt. Darüber hinaus hatten die im Leerlauf befindlichen Gamma-Delta Intraepithellymphozyten längere Verweilzeiten und wurden häufiger im lateralen interzellulären Raum lokalisiert, verglichen mit motilen Gamma-Delta Intraepithellymphozyten. Es kann schwierig sein, Zottenfelder zu identifizieren, in denen es aufgrund der Peristalse an übermäßiger Bewegung mangelt.
Das Neupositionieren der Maus kann beim Auffinden eines stabileren Feldes helfen. Eine weitere Analyse der Zellverfolgungsdaten kann dazu beitragen, ein bestimmtes Motilitätsverhalten zu identifizieren oder zusätzliche Metriken für die Messung zellulärer Wechselwirkungen bereitzustellen. Intravital Imaging und Analyse der IEL-Motilität hat sich zu einem Standard-Auslesen der IEL-Funktion, die einen Einblick in die Art und Weise gibt, wie angeborene Immunsignalisierung die Gamma-Delta IEL-Funktion reguliert.
