우리는 C57BL / 6 B1-8 GFP 형질 전환 마우스를 제공하기위한 스트라이프 - 조명 방식, K. Rajewsky 및 A. Haberman의 개발 기간 동안 유익한 토론을위한 R. Heintzmann 감사합니다. 우리는 재정 지원에 대한 독일 부여 NI1167/3-1에서 Forschungsgemeinschaft (RN에), HA5354/4-1 및 SFB633, 프로젝트 A15 (AEH에) 부여 한 Rahel - 허쉬의 교제에서 샤리 (RN에)을 인정합니다. 우리는 특히 유익한 토론과 인프라 지원을위한 네트워크 JIMI을 인정

스트라이프 - 조명 TPLSM에 대한 멀티 빔 설치 여기서 사용 설치 이전 6,20 바와 같이, 특수한 멀티 빔 이광자 레이저 주사 현미경이다. 시스템은도 1에 도시되어있다. 접근법들은 단일 빔 주사를 수행하기 만 할 수있는 경우에도, galvoscanner 거울의 이동과 카메라의 획득을 동기화 할 수있는 다른 이광자 레이저 스캐닝 현미경에 적용 할 수있다 . 이 경우, 단점은 표준 PMT 기반 TPLSM의 수집 속도로 그러나 유사한 하부 수집 속도 일 것이다. 지금까지의 해상도와 콘트라스트 관한 한 최적의 품질을 달성하기 위해, 최저 및 광표백 광 손상 빠른 습득, 그것은 설치 프로그램의 다음 조정 단계를 참고하기를 권장합니다 : <ol><li> TISA 레이저의 레이저 파워를 확인 : 공장 출하 값과 previo과 비교, 100 %로 확인우리는 독서를 소유하고 범위 700-1,000 nm의에서 여기 파장 필요한 경우 그것이 그것을 사용합니다. </li><li> 티의 원격 제어 표시 테스트 : 사 빔 스플리터, 즉 0 %를 확인하고 100 % 설정. 100 % 남아있는 TISA 빔, 그리고 거기 확인하고 스테핑 모터 null의 위치를​​ 재설정합니다. TI는 : 사 빔 스플리터는 수직 빔의 경로에 수직 편광 레이저 빔 분할 하위 λ / 2 판과 편광판, 구성 하나가 여기에 대한 현미경으로 감독을, 다른 하나는 광 파라 메트릭 펌프하는 데 사용됩니다 발진기 (OPO). 자동으로 λ / 2 판, 티의 연속 조정 회전 : 사 및 OPO 전력을 각각 얻을 수있다. </li><li> 원하는 파장에 OPO를 조정하고, 출력 전력을 측정. 전원이 너무 낮은 경우 : 펌핑 파장을 최적화하고 일의 설정을 확인합니다 (티 W 4 사 레이저는 800 nm에서, 하나는 약 1,050-1,100 nm에서 OPO 빔의 W 0.8-1를 얻을 수 있어야합니다)전자 거울과 삼진 결정. OPO가 원하는 파장의 출력에서​​ 공진 전원이 증가 할 때까지 권장되는 최적의 차트 나 그래프를 자주 사용할 수있는 값, 다음 미세 조정을 선택합니다. <ol type="i"><li> 전원이 여전히 낮 으면, 넷 액세스 미러 조절 노브로 OPO의 접근이 거울을 조정한다. 아주 천천히, 그리고 아주 작은 움직임으로, 전면과 끝 거울 교대로이 단계를 수행합니다. </li></ol></li><li> 사 및 / 또는 OPO 빔이 적절한, 중앙 위치에서 항목 거울 조회수 : 티가 있는지 확인합니다. <ol type="i"><li> 사 광선 : 백서 (! 매우 반짝 또는 반영하지 않음)의 조각과 OPO 빔을 관찰하기위한 적외선 뷰어 및 더 높은 파장 티를 사용합니다. <ol type="i"><li> NIR 티 작업을 할 때 보호 안경을 착용 : 사 광선 (일반적으로 720-750 나노 미터까지의 평균 사람을 볼 수 있습니다). </li></ol></li><li> 미시간하도록 정렬 절차를위한 가능한 낮은 레이저 출력 (들)을 설정잠재적 인 눈 손상을 nimize. </li><li> 동공이 수축되도록 항상에 실내의 주변 조명을 유지합니다. </li><li> 사 빔이 스캔 헤드를 입력 : 레이저 파워 미세 조절 티 때 아직 적용되지 λ / 2 판과 편광판, 밖으로 구성된 감쇠기가 있음을 유의하십시오! </li></ol></li><li> 엔트리 포인트 다이어프램은 티타늄에 의해 중간에 명중되어 있는지 확인 : 사 및 / 또는 OPO 빔; 없는 경우, 레이저 빔이 스캔 헤드 들어가기 전에, 마지막 두 개의 거울을 조정한다. <ol type="i"><li> IR 뷰어 및 흰색 (반사 / 만 반짝하지!) 종이의 작은 조각을 사용합니다. </li><li> 레이저 빔의 위치가보다 정확하게 판단 할 수 있도록 항상 현미경 진입에 진동판을 닫는다. 중요 : 6 단계로 진행하기 전에 다이어프램을 다시하는 것을 잊지 마세요! </li></ol></li><li> 따라서 현미경에 반사 된 레이저 빔의 빛 경로를 조정합니다. 작은 세그먼트에서이 작업을 수행하고 반복적 인 빔 워싱턴을 수행lking. <ol type="i"><li> 대물 렌즈의 광 출력이 충분하지 않은 경우 전체 빛의 경로를 확인합니다. </li><li> 긴 유휴 기간, 주요 수리, 광학 요소의 교체 후 처음으로 시스템을 사용할 때는 항상 빛의 경로를 확인하거나 문제는 출력이 존재하는 것으로 의심되는 경우. </li></ol></li><li> 그들은 먼지 특히 것을, 모든 활성 광학 표면이 깨끗한 지 확인하십시오! 표면이 먼지 층으로 피복하는 경우, 파면 심지어 대물 렌즈를 입력하기 전에 왜곡 및 결과 레이저 빔은 샘플의 선명한 이미지를 제공하지 않을 것이다! <ol type="i"><li> 필요한 경우, 에탄올, 이소프로판올에 적신 렌즈 종이의 접힌 부분으로 거울을 청소합니다. </li></ol></li><li> 빔이 광 경로를 설정 한 후, 프리즘 기반 펄스 압축기의 끝에 직접 진입 미러 위에 위치 미러로 다시 도착한 것을 확인한다. 여기에서, 빔이 반사되어 나광 멀티플렉서 (BM) n을. </li><li> 레이저 빔은 광대역 50 % 투과 및 50 %의 반사를위한 요구에 맞도록 레이저 빔의 편광을 변경하는, 직접 λ / 2 판 전에 빔 멀티플렉서의 입구에 위치되어 다이어프램 나가면 체크 BM 내. <ol type="i"><li> 먼저 빔 위치를보다 정확하게 판단 할 수 있도록 조리개를 닫고 BM 항목에서 현미경 및 기타에 항목의 하나, 즉 두 개의 다이아 프램 사이 빔 산책을 수행합니다. 다른 하나의 빔 스캐닝 현미경 다이어프램은 XY 스캐너의 진입에 위치해야한다. </li><li> 빔 폐쇄 다운 개구의 중심에 충돌하지 않으면, BM 엔트리 조임 바로 앞에 배치 된, 상기 언급 된 거울을 조정한다. 중요 : 10 단계로 진행하기 전에 다이어프램을 다시하는 것을 잊지 마십시오. </li></ol></li><li> 다이어프램이 재개으로 레이저 빔이 BM 거울에 안타 있는지 확인자신의 중간 지점. BM의 복잡한 빛 경로의​​ 다른 부분을 차단하지 않도록 종이의 좁은 스트립을 사용하십시오! </li><li> 평행 편광에 대한 최고 거울 &quot;P&quot;, 수직 편광 &quot;S&quot;에 대한 바닥 거울 : 빔 출구 거울의 중앙을 명중 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면, BM 전에 엔트리 거울을 조정한다. </li><li> &quot;S&quot;와 &quot;P&quot;는 편광 빔 그룹 편광판 큐브를 입력하고 XY 스캐너에 항목에서 적절하게 중첩 할 수 있는지 확인합니다. 경우에 다음과 같이 단일 빔 스캐닝 현미경을 사용하는 건너 뛰기. </li><li> 레이저 광은 중앙에서 스캔 및 튜브 렌즈를 통과하여 대물 렌즈 &#39;초점면의 중간을 통해 얻을 수 있는지 확인합니다. 중요 :이 단계는없는 주차 위치에서 중심 위치에 레이저 광을 수행되어야! <ol type="i"><li> 목표 도구 ( &quot;황소의 눈&quot;)와 대물 렌즈를 장착하고 레이저 빔이 중간에 대상을 안타 확인하고 있는지 여부조명도 있습니다. </li><li> 이 경우 것으로 보인다 경우, BM 전에 조리개를 닫고 원형의 간섭 패턴이 나타나는 경우 중간 (간섭 최소)에서 검은 색 원으로 확인합니다. <ol type="i"><li> 황소의 눈의 중심을 기준에 상당한 변화가있을 경우 항목의 미러를 조정합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 지금 20X 물 침지 렌즈로 예를 들어 대물 렌즈와 황소의 눈을 교체합니다. <ol type="i"><li> 흰색 종이로 출력 광 필드를 확인합니다. 이 밝고 균일하고 중앙에 위치해야합니다. </li><li> 출력 전력을 측정 : 100 % 티타늄을 펌핑 100 % OPO에 : 사 (4 W), 하나는 약 얻어야한다. (여기에 사용 된 현미경) 1,100 nm에서의 렌즈 후 100 ~ 150 mW의. 낮은 레이저 힘은 멀티 빔 SI-TPLSM을 수행하기에 충분하지 않습니다. 단일 빔 주사 SI-TPLSM의 경우, 5 ~ 10 ㎿가 충분합니다. 레이저 빔은 scanne 않고, 중앙 위치에 남아 있어야D! </li></ol></li><li> MB-SI-TPLSM을 수행하는 경우 다음과 같이 BM에 거울을 맞 춥니 다 : <ol type="i"><li> 무대에서 균일하게 형광 샘플, 예를 들어 적색 형광 슬라이드를 놓고 샘플 내부 만 (대물 렌즈 &#39;앞에 즉, 닫기) 표면 근처의 레이저 빔을 초점을 맞추고있다. </li><li> 멀티 빔 모드로 현미경을 설정하고 시작 부분에 빔의 수, 바람직하게는 하나의 빔, 편광, 예를 들어, &quot;P&quot;를 선택합니다. <ol><li> 형광 슬라이드 촬상하여 레이저 빔을 찾기 : 오픈 &quot;P&quot;셔터를 설정하고 빔을 포커싱하는 동안 연속적으로 CCD 카메라를 실행. </li><li> 빔이 중앙 위치에 있고, 스캐너의 전원이 꺼져있는 것을 확인하십시오. 빔이 검색되지 않습니다 있는지 확인합니다! </li><li> 카메라 칩의 중앙 부근에 밝은 반점을 찾아 빔을 찾을 수 있습니다. </li><li> 스폿이 화상면의, 즉 밝고 선명해질 때까지 상기 빔을 초점현미경은 카메라 칩의 위치에 대응하고; 스폿이 포화되지 않도록 레이저 출력을 감소시킨다. 잘 정렬 된 시스템이 레이저 전원이 한 빔 모드 (약 0.6 mW의 레이저 전원이 작동합니다)에서 작업 할 때 인근 이상이어야한다는 것을 의미한다. </li><li> 그 자리는 센터 떨어져 크게 경우, 앞의 BM (또는 단일 빔 스캔 스캐너를) 미러를 조정하여 가까운 센터로 이동합니다. </li><li> 또한, 즉 &quot;S&quot;빔 다른 편광을 정렬 할 때, 이제, 2 - 빔 모드로 전환 &quot;S&quot;셔터를 열고 만 &quot;S&quot;셔터가 열려있는 경우 (하나의 빔이 볼 수있는 빔의 위치를 검사 ). </li><li> 완료되면, 4 빔 모드로 전환하고 &quot;P&quot;편광 모드 ( &quot;P&quot;셔터 개방)를 사용합니다. 이제 두 빔릿가 나타납니다. </li><li> 두 빔릿 완벽하게 카메라의 뷰의 아래쪽 가장자리에 평행하고, 떨어져 2.8 μm의 수를 설정할 수 있도록 준비. <ol type="i"&gt; <li> 이들이 적절하게 정렬되지 않으면, BM의 제 1 미러를 조정한다. </li><li> 두 개의 빔이 음 분리와 완벽하게 수평으로 배열 2.8가 될 때까지 대신 거울을 이동하는 두 개의 주변 장치 나사를 사용, 중간에 나사를 정렬하지 마십시오. </li></ol></li><li> 이제 &quot;P&quot;편광의 8 - 빔 모드로 전환하고, 4 빔릿 2.8 UM에서 등거리이고, 이미지의 하부 에지에 평행하게 배치 될 때까지 제 BM 밀러 (도 빨간 점없이)를 조정한다. </li><li> 각각 32 빔 모드, 3, 4 BS 거울을 조정 - 16에서 반복합니다. SI-알고리즘, 간단한이 최소 - 최대 (힐로) 알고리즘되고,이 가정에 기초하기 때문에 빔릿 등거리이어야하는 것은 중요하다. </li></ol></li></ol></li><li> 불균일 한 구조, 예를 들어 크로스 스테인드 Convallaria 뿌리와 균일하게 형광 샘플을 교체합니다. <ol type="i"><li> w, 여기 빔의 주차 위치로 이동HICH는 일반적으로 스캐너 좌표, 예를 들어 (10,000 10,000)의 큰 값에 배치됩니다. </li><li> CCD 카메라와 함께 (멀티 빔) 이미지를 스캔합니다. 이미지가 선명한 유니폼과 직선이 나타나는지 확인합니다. </li><li> 이미지를 회전 것 같으면 카메라를 조정 : 이미지가 정리 될 때까지 (! 온유) 손으로 축 방향으로 수직 축을 중심으로 카메라 본체를 비틀어. </li></ol></li><li> 여기 패턴, 즉 줄무늬 화상을 생성하기 위해 스캐닝 프로세스를 제어하기 위하여 XY 스캐너를 시작. <ol type="i"><li> 멀티 빔 주사의 경우, 즉, Y 스캐너의 미러를 이동. 이차 줄무늬 화상을 생성하는 방식으로 빔릿 라인에 수직. </li><li> 단계 17.1에 설명 된대로 시야가 발생합니다. 빔 렛 라인이 두 배로 빔릿은 전체 라인을 따라 등거리되는 것을 보장하는 위치로 x-스캐너의 미러를 이동하여 스캔 루틴을 연장 너무 작다. 정확한 움직임을 반복합니다x-스캐너 미러는 스트라이프 확대 화상을 생성하는 이동 Y 스캐너 미러의 전후. </li><li> 원하는 스트라이프 화상을 생성 - 과학자에 의해 정의 - 단일 빔 주사의 경우, 등거리의 위치에 반복적으로 x-스캐너 미러 움직임-Y 스캐너 미러의 움직임을 번갈아. </li><li> 일정 속도 (감소 가속 / 감속)에 대한 Y-스캐너 거울 명령의 움직임과 최대 속도 (최대 가속 / 감속)의 X-스캐너 거울 하나에 사용할 수 있는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 자동으로 획득하고 카메라 (현장 검출기)와 스트라이프 이미지를 저장합니다. 따라서, 스캐너와 카메라를 동기화 및 마스터 트리거로 스캐너를 사용한다. </li><li> 줄무늬 화상을 취득 반복은 다음과 같이 다른 위치에서 x-스캐너의 미러를 이동하여 (프로토콜 17에 기재된 주사 프로토콜) <ol type="i"><li> 충분히 반복 단계 사이의 적절한 단계 길이 선택두 개의 연속 된 빔릿 (이 경우 2.8 μM 및 스캐너 미러의 하나의 단계가 25 nm의 동일) 사이의 거리를 커버하는 두 개의 연속 스트라이프 이미지; 조금 중복을 허용하는 것이 바람직 할 수 있으며, 추가로 0.3 ~ 0.4 μm의 즉. </li><li> 주어진 파장에서 측 방향 해상도 한계와 일치 값 x-시프트를 설정한다. 예를 들어, 이동, 12 또는 13 교대 당 X-스캐너 거울의 10 단계를 사용하여지도에 가장 축이 시스템의 측면 해상도 결과 모두. 번호가 사용되는 시스템에 가장 적합한 구조화 된 슬라이드, 예를 들면 Convallaria 뿌리 슬라이드, 확인하십시오. </li><li> Convallaria 이미지가 선명해질 때까지이 두 값을 최적화 : 계산 된 SI 이미지에서 라인 프로파일 도구를 사용하여 라인 프로파일 (Convallaria 세포벽에서 형광 신호이다)의 폭과 비교. </li><li> 스캐너의 움직임과 동기화 각 스트라이프 이미지를 획득하여 따로 저장, 예를 들어, </EM&gt; TIFF 또는 이진 파일로. </li></ol></li><li> 평가 루틴의 행렬, 즉 3 차원 매트릭스로 줄무늬 이미지의 전체 집합을 열고 고해상도 SI-이미지의 2D 매트릭스를 생성하는 최소 - 최대 알고리즘 또는 푸리에 변환 알고리즘 중 하나를 사용합니다. 알고리즘은 이전에 세부 (20)에 설명했다. </li></ol> 의 intravital 이미징 마우스 예방 접종 및 준비 동물 실험은 동물 복지 (LAGeSo, Landesamt FÜR 아퍼 싶게 Soziales, 베를린)에 해당하는 국가위원회에 의해 승인되었고, 현재의 지침과 규정 (동물 실험 라이센스 G0153/08)에 따라 수행되었다. <ol start="21"><li> 4 전에 설명한대로 오금 림프절 및 이미징 필드의 제조에서 본원 중심 응답 유도를 수행 하였다. immunomagnetically의 비장에서 B 세포를 정화 B1-8 + / + Jκ - / -와 B1-8 + / + Jκ의 B 세포 - / - GFP + 마우스. </li><li> / - + / - + Jκ ⅛ B1-8을 사용하여&gt; 95 %의 순도로 정맥 3 × 106 NP 특정 B 세포를 주입 GFP + 및 ⅞ 비 형광 B1-13 + / + Jκ - / - C57BL / 6받는 소재 . </li><li> 셀 전송 후 어느 날 NP-CGG 오른쪽 뒷다리 음식 패드에 완전 프로 인트 아쥬 반트 (CFA) 유화 (니트로 페닐 - 닭 ɣ 글로불린)의 10 μg과받는 사람 면역. </li><li> ATTO590 - 숙신 에스테르와 anti-CD21/CD35 항체의 라벨 Fab 단편. <ol type="i"><li> , 생체 내에서 싹 센터에서 여포 수지상 세포의 네트워크 (FDC)을 강조의 intravital 분석이 수행되기 전에 쥐 12 ~ 24 시간의 오른쪽 뒷다리 발바닥에 형광 색소 표지 Fab 단편의 10 μg을 주입합니다. </li></ol></li></ol> 다음 단계는 conside해야의 intravital 이미징을위한 오금 림프절 (하루 8 ~ 10 예방 접종 후)의 준비를 위해 빨간색 : <ol start="25"><li> 케타민 / 자일 라진의 IP 주입, 자신의 체중에 따라 양에 마우스를 마취. </li><li> 전체적인 촬상 기간 동안 마취 깊이를 모니터링하기 위해 테스트 반사. </li><li> 다시 다리, 엄격한 마우스의 오른쪽 측면을 면도하고 완전하게 남아있는 머리카락을 제거하기 위해 제모 크림을 사용합니다. </li><li> 주요 우측 대퇴 전자 수정 : 손가락 뼈 칩을 찾은 작은 흰색 삼각형 모양의 밴드가 나타날 때까지 가위로 작은 피부 절개를 설정합니다. </li><li> 제한 기의 날카로운 핀셋이 근막 아래 뼈 칩을 클램프. </li><li> 이빨 핀셋을 사용하여 요추 영역에서 척추를 고정합니다. </li><li> 제한 수단을 마우스 오른쪽 뒷다리를 고정하고 나사를 조입니다. </li><li> 올바른 위치에있는 다리를 유지하는 테이프의 꼬리. </li><li> 허벅지의 꼬리 측면에서, 지역 유명 슬와 정맥 차가운 제품으로, 피부에 절개를 만들RS 조직, 무딘 핀셋 기본 조직으로부터 피부를 분리하고 말단에 인접한에서 슬와 정맥을 따르십시오. </li><li> 무딘 집게를 사용 림프절을 노출 (노출 동안 PBS에서 림프절을 계속) 미세 림프관을 보호하기 위해 절단 피하려고. </li><li> 림프절 주위에 진공 그리스의 원형을 만들어, PBS에이 웅덩이를 입력합니다. </li><li> 그 위치에 커버 슬립을 넣고 온도계 프로브 (그렇지 않으면 셀 속도가 극적으로 변화 할 것이다, 37 ° C 온도에서 보관) 놓습니다. </li><li> 커버 슬립의 위쪽 가장자리를 따라 진공 그리스의 원을 추가합니다. </li><li> , 진공 그리스에서의 위치에 가열 코일을 넣어 이전과 비슷한 방식으로 실을 만들고 목표로 찍어 유리 커버 슬립에 물 / PBS를 추가합니다. </li><li> 치사량에 케타민 / 자일 라진의 투여 량을 증가하고있는 동안 촬영 한 후, 마우스는 자궁 경부 전위 다음으로, 마취에 보관됩니다. </li></ol>

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N., Cui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superpenetration+optical+microscopy+by+iterative+multiphoton+adaptive+compensation+technique.">Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).</li><li>Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+via+pupil+segmentation+for+high+resolution+imaging+in+biological+tissues.">Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues.</a> Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+laser+scanning+microscopy+through+spatiotemporal+modulation.">Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation.</a> Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).</li><li>Andresen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+intravital+microscopy.">High-resolution intravital microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (12), (2012).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+structured-illumination.">Adaptive optics for structured-illumination.</a> Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).</li></ol>

폴커 안드레 독일 LaVision 바이오텍 GmbH의 빌레펠트의 주주입니다. 다른 저자는 이익의 충돌이 없습니다.

의 intravital 광학 영상의 목적은 동적으로 기능적 조직과 건강과 질병 5 장기의 기능을 이해하기 위해 세포 운동성 및 상호 작용을 시각화하는 것입니다. 이러한 다중 광자 레이저 주사 현미경을 달성하기 위해 가장 강력한 기술은, 아직, 그 공간 해상도를 제한 전면 왜곡 산란 느린 취득 photobleaching에 및 광 손상을 거절 관련된 한계를 극복 대조뿐만 아니라 시간 해상도를 가지고 . <p clas...

두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)는 적외선 초단 펄스 여기 1 관련 깊은 조직 이미징을위한 장점과 함께, 각종의 운동과 상호 작용 패턴을 공개하여 단일 세포 수준에서 중요한 프로세스에 대한 우리의 관점을 혁명 동물에게 2-5 살아있는 세포의 부분 집합. 그러나, 현재의 기술은 건강과 질병에있는 조직 내에서 세포 반응의 분자 기초에 대한 전용 스파 스 정보를 렌더링하기 때문에, 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전제 조건으로 장기의 기능과 장애의 메커니즘을 규명하는 것은 여전히​​ 불충분하다. 현재의 기술은 산란에 의한 수백 미크론의 공간 만 창을 가능하게하고, 공간 해상도 및 성인 동물의 매우 컴팩트 한 조직에서 특히 명백하다 신호대 잡음비 (6), 프런트 왜곡 효과 거절. 이러한 산란 및 파면 왜곡 효과는 매우 이질적인에 기인3D 공간 해상도의 깊이 의존 열화에 대한 첫 번째 단계에서 주요한 조직의 굴절률 이방성의 디 분포, 그리고 마지막 탄도 여진 광자, 신호 대 잡음비의 손실이 예에서 발생 된 신호의 총 손실이다. bioscientific 의치 깊은 조직 애플리케이션의 관점에서, 이는 신호 대 잡음비의 감소가 시스템을 간과하는 결과가 발생하는 반면 해상 불량 거짓 양성 상호 작용을 초래할 것이기 때문에 현재의 기술이 명백하게 셀룰러 통신을 공개 할 수없는 것을 의미 희미한 구조 사이의 상호 작용. 명백하게 동적 방식으로 셀룰러 상호 작용을 검출하기 위해, 높은 공간 해상도 향상 깊은 조직 내에서 필요하다. 예 특수 수치 알고리즘 제 여기 상태의 고갈에 예를 들면 구조 조명 접근법에 기초하여 현재 도입 강력한 nanoscopy 기법 </em&gt; STED, RESOLFT, 또는 분자 현지화에, 예를 들면 dSTORM, PALM은 고정 된 세포뿐만 아니라 라이브 세포 배양 7에서 여러 응용 프로그램을 발견했다. 그러나, 조직 섹션, 생체 조직과 유기체에 이러한 응용 프로그램을 확장하기 위해 우리는 여전히 심각​​한 기술적 인 어려움을 극복해야합니다. 이광자 여기에서는 서로 다른 파장으로뿐만 아니라 여기에 대한 단일 파장 (sw2PE-STED)로 STED 및 배출 동일에서 각각 매립 셀 09과 뇌 조각 8 또는 인공 매트릭스에서 측 방향 해상도를 향상시키기 위해 적용된 자극 표준 TPLSM으로 축 해상도. 하나의 광자 STED를 사용하여, 돌기 쪽의 역학은 67 내지 10 nm의 해상도에서 생활 Thy1 EGFP 마우스의 뇌 피질 (최대 15 μm의 깊이)의 표면에 이미지가 될 수있다. 발달 생물학을위한 다양한 도구를 두 배 향상 차원을 제공하는 다 초점 구조화 조명 현미경에 의해 제공됩니다해상도. 그러나,이 기술은 단지 이러한 제브라 피쉬 배아 (11)로서 광 산란 낮은 성향 유기체에서 사용될 수있다. 그러나 이러한 기술 중 어느 것도 출산 후 증상과 질병의 생물 의학 및 임상 연구에 중요한 모델입니다 마이크로 미터의 수백에서 성인 동물의 높은 산란 조직에 적용 할 수 없습니다. 점 분포 함수 (PSF), 즉 회절 한정 파면 형상을 계산하는 데 사용되는 근사 독립, 렌즈를 포커싱 한 후, 광축 (축선 방향 해상도)을 따라 PSF의 폭보다 적어도 세 배 더 크다 광축 (측 방향 해상도) (12)에 수직 인 PSF 폭. 상당히, 특히 눈을 따라 훨씬 더 큰 PSFS, 선도 깊은 조직 이미징에 초점을 맞춘 전자파의 파면 형상을 수정 니케 계수에 의해 정량화 다른 순서의 앞에 왜곡 웨이브알은 13 ~ 15 축. 따라서, 회절 법 및 파면 왜곡 효과 모두는 깊은 조직 이미징 제한 요소로서, 광축을 따라 해상도를 가리. nanoscopy 기술이 회절 한계를 반작용 초점 반면 만, 축 방향 해상도 및 회절 파면 왜곡 효과를 모두 반작용에 의해 콘트라스트를 향상시키는 기술은 고해상도의 intravital 이미징을 위해 필요하다. 이상적으로,이 기술은 충분히 빨리 세포 역학의 모니터링을 허용 할 수도 있어야한다. PSF의 수차 및 TPLSM에 적응 광학을 사용하여 대비 손실의 실시간 보정이 광범위하게 연구 및 지난 십 13,14,16-18 개선하고 따라서 탄도 여기의 더 나은 관리에 이르는 최선의 현재의 선택을 한 14 광자. 아직도 인해 대부분의 전면 수정이 적응 광학에 사용되는 접근법 파도는 사실을 반복하고 그들이 하 것이있다인해 조직의 굴절률의 높은 이질성으로 작은 면적 (거의 없음 10 × 10 ㎛ 2)을 반복 할 적이, 수집 속도는 촬상 세포 운동성 및 통신을 위해 필요한 것보다 훨씬 낮다. 또한, 적응 광학의 물리적 한계는 TPLSM 여전히 회절에 의해 결정됩니다 향상. 조명 (SPIN) 및 검출 측 (SPADE)의 시간적 공간적으로 변조 된 변조 이론적 해상도를 향상시키기 위해 레이저 주사 현미경에 적용하는 것이 제안되어왔다. 의 intravital 영상에서의 실용적인 응용 프로그램은 여전히 19을 입증 할 수 남아 있습니다. 이와 함께, 성인 살아있는 동물의 깊은 조직 영상의 해상도 향상 기술의 개발에 대한 높은 수요가있다. 본 연구에서, 우리는 멀티 빔 스트라이프 - 조명 다중 광자 레이저들에서 스캐닝 과정을 제어함으로써, 여기 패턴의 공간 변조를 달성통조림 현미경 (MB-SI-MPLSM) 20. 여기 빔 단면이 공간적으로 변조 된 구조화 된 조명 방식, 반대로, 우리는 여기의 공간 변조를 달성하기 위해 단지 스캐닝 과정을 사용한다. 긴 파장으로 여기를 확장하여, 우리는 독립적으로 광 중에서, 높은 조직 (예, 림프절, 자유 산란 경로 47 μM 6) 비산 깊은 조직에서의 공간적 해상도 및 신호대 잡음비를 모두 향상시킬 수있다 우리가 감지 비선형 신호, 예를 들어, 형광, 두 번째 고조파 발생 또는 다른 주파수 현상을 혼합. 900 nm의 최대 여기 파장에서이 방법을 사용하여 우리는 마우스 림프절의 싹 센터에서 몇 분자의 규모에 동적으로 이미지 세포 단백질 구조 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 더 나은 항 프로빙 프로세스에 모낭 수지상 세포 및 B 세포의 표면에서 항원 운반 유닛 간의 상호 작용을 시각화 할차 림프 기관의 면역 반응 중에 세대.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">ATTO590 &#8211; NSH for coupling</td>
			<td style="width:99px;">ATTO Tec, Germany</td>
			<td style="width:119px;">AD-590-35</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">CD21/35 &#8211; Fab fragment &#8211; ATTO590</td>
			<td style="width:99px;">DRFZ, Berlin</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">B1-8 Jk-/- EGFP+</td>
			<td style="width:99px;">Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment&#160;</td>
			<td style="width:99px;">StemmCell Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">19854</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Polystyren beads (605), 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:99px;">Life Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">F8803</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">TriMScope I</td>
			<td style="width:99px;">LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OPO (manual version)</td>
			<td style="width:99px;">APE, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td style="width:99px;">Coherent, Duisburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm</td>
			<td style="width:99px;">Olympus Germany, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly resolved intravital striped-illumination microscopy of germinal centers

의 intravital 깊은 조직 다 광자 현미경으로 세포 통신을 모니터링하는 것은 건강과 질병에있는 두꺼운 조직 샘플 및 기관 내에서 면역 세포의 운명을 이해하기위한 열쇠입니다. 다 광자 현미경의 주사 패턴을 제어하고 적절한 수치 알고리즘을 적용하여, 우리는 더 나은 축 해상도 및보다 향상된 신호대 잡음비, 즉 콘트라스트를 3 배 달성 저희 활성화하는 스트라이프 - 조명 방식을 개발 표준 다 광자 현미경에 비해 높은 림프 기관의 조직을 산란 내에서 100 μm의 조직 깊이. 촬상 깊이 인해 전계 감지기의 사용에 약간 낮았다 반면 수집 속도뿐만 아니라 광표백 광 손상 및 효과는 표준 광 곱셈기 기반의 기술과 유사했다. 스트라이프 - 조명 방식을 사용함으로써, 우리는 보조 모낭 수지상 세포에 면역 복합체 침착의 역학을 관찰 할 수있다 ̵1; 본원 센터에서 몇 가지 단백질 분자의 수준에서.

림프절의 공간 해상도 효과적인 점 확산 함수 (EPSF)의 치수는 현미경 (12)의 공간 해상도에 대응한다. 우리는 (CCD 카메라에 의한) 설립이 광자 레이저 스캐닝 현미경 기술, 즉, 전계 검출 TPLSM에 비해 트립 MB-SI-TPLSM 의해 림프절에서 콜라겐 섬유의 제 고조파 발생 신호를 획득하여이 삼차원 함수를 측정하고, 포인트 검출 TPLSM (PMT의에 의해). 이?...

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Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

highly-resolved-intravital-striped-illumination-microscopy-germinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K 조회수.  Leibniz Institute.  성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다. 