Diese Arbeit wurde durch das Australian Research Council Federation Discovery Project Grant #1096623 finanziert.

1. Erstellen des Rekombinationsvektors
<ol><li>Identifizieren Sie 150 bp lange flankierende Bereiche der Homologie (als linke und rechte Arme bezeichnet), die erforderlich sind, um entweder N- oder C-terminal zu kennzeichnen, das virusische Gen von Interesse zu kennzeichnen (siehe Abbildung 1b).</li>
	<li>Entwerfen Sie eine Oligonukleotid-Sequenz, die die 150 bp linken und rechten Arme umfasst, die durch ein Paar von Restriktionsstellen ihrer Wahl getrennt sind. Diese gesamte Sequenz muss auch durch ein zweites Paar von Restriktionsstellen (anders als das erste Paar) flankiert werden, um die Aufnahme in den TDS-Vektor nach der Synthese zu ermöglichen. Achten Sie beim Entwerfen des Oligonukleotids mit Restriktionsstellen darauf, dass die Sequenzen im Rahmen mit der gewünschten Einfügestelle sind.</li>
	<li>Integrieren Sie Bei der Gestaltung des Oligonukleotids für die Synthese Restriktionsstellen zwischen dem linken und dem rechten Arm,die denen entsprechen müssen, die den offenen Leserahmen des fluoreszierenden Tags der Wahl flankieren (siehe Abbildung 1b). Es ist möglich, eine NotI-Einschränkungsstelle als drei Aminosäure-Linker zwischen dem linken Arm und dem Beginn des Fluoreszenz-Tags zu verwenden.</li>
	<li>Integrieren Sie dieselben Restriktionssites auf beiden Seiten des Fluoreszenz-Tags durch PCR (siehe Abbildung 1c).</li>
	<li>Klonen Sie das synthetisierte Fragment in den TDS-Vektor.</li>
	<li>Klonen Sie das fluoreszierende Tag in den resultierenden Rekombinationsvektor mithilfe der Einschränkungsstellen zwischen dem linken und rechten Armder der Homologie (siehe Abbildung 1d).</li>
</ol>2. Rekombinante Virusgenerierung
<ol><li>Gemäß Abbildung 2infizieren Sie eine Monoschicht von BS-C-1-Zellen mit dem Impfvirus in serumfreien Medien bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) > 1.</li>
	<li>1 Std. nach der Infektion, Rettungszellen mit Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) und transfekt mit einer Mischung aus Rekombinationsvektorplasmid und Transfektionsreagenz im Verhältnis 3:1 in serumfreien Medien.</li>
	<li>Nach 24 Stunden, kratzen und erholen Zellen in DMEM enthält kein fetales Rinderserum (FBS) und führen Drei Frost-Tau-Zyklen, um aufgebrochene Zellen zu brechen und Viruspartikel freizusetzen.</li>
	<li>Führen Sie einen Plaque-Assay mit einem flüssigen Overlay von 10% FBS DMEM und GPT-Auswahlreagenzien Mycophenolsäure (25 g/ml) und Xanthin (250 g/ml) wie folgt durch:<ol>
<li>Säen Sie eine 6-Well-Platte mit einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen.</li>
		<li>Infizieren Sie 100% konfluente Zellmonolayer mit seriellen Verdünnungen der gefriergetauten Zellen, die Viruspartikel enthalten, um eine angemessene Trennung einzelner Plaques zu gewährleisten.</li>
		<li>Overlay mit flüssigen 10% FBS enthaltende DMEM enthält die GPT-Auswahlreagenzien - Mycophenolsäure und Xanthin bei Endkonzentrationen von 25 g/ml bzw. 250 g/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach einer 24-stündigen Inkubation entfernen Sie die Flüssigkeitsüberlagerung und suchen mit einem Fluoreszenzmikroskop nach Plaques, die eine diffuse rote Fluoreszenz aufweisen, die der Einbeziehung von mCherry aus dem TDS-Vektor in das Virus entspricht. Je nach Zielgen und gewähltem Fluoreszenz-Tag kann die lokalisierte Fluoreszenz des markierten Gens auch in derselben roten Plaque beobachtet werden.</li>
	<li>Wählen Sie mehrere Plaques für jedes rekombinante Virus durch lokalisiertes Abkratzen mit einer Pipettenspitze und 100 l 5% FBS, das DMEM enthält, um Zellen in ein Eppendorf-Rohr zu übertragen, gefolgt von drei Runden Gefriertau von abgekratzten Zellen, um rekombinante Viren freizusetzen.</li>
	<li>Fügen Sie das DMEM enthaltende gefriertaute Virus zu einer Monoschicht von Zellen in einer 12-Well-Platte hinzu, um rekombinante Viren mit GPT-Selektionsreagenzien in den Wachstumsmedien zu verstärken. Kratze erfolgreiche Verstärkungen 24 Stunden nach der Infektion.</li>
	<li>Führen Sie einen Plaque-Test von erfolgreich verstärkten Plaques mit roter Fluoreszenz durch, diesmal mit einer Agarose-Overlay- und GPT-Auswahl, wie folgt:<ol>
<li>Säen Sie eine 6-Well-Platte mit einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen.</li>
		<li>Führen Sie eine serielle Verdünnung der rekombinanten Viren durch und infizieren Sie Brunnen mit einer zunehmenden Verdünnung von Viren in FBS-freiem DMEM.</li>
		<li>1 Std. nach der Infektion, entfernen Sie die flüssigen Medien und überlagern Sie jeden Brunnen mit 0,5% Agarose in minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 2,5% FBS, 292 g/ml L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin, zusammen mit den GPT-Auswahlreagenzien.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 Tage nach der Infektion, Wählen Sie Plaques mit Fluoreszenz, die sowohl rot ist und die Farbe der gewählten Fluoreszenz-Tag wieder zu verstärken, diesmal ohne GPT-Auswahl.</li>
	<li>Führen Sie den nächsten Plaque-Assay mit einem Agarose-Overlay ohne Auswahl durch.</li>
	<li>Wählen Sie Plaques, die ihre diffuse rote Fluoreszenz verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem Tag der Wahl entspricht.</li>
	<li>Setzen Sie die Plaquereinigung ohne Auswahl fort, um einen reinen Vorrat an rekombinanten Viren zu erhalten, die die mCherry- und gpt-Selektionsgene verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem gewählten Tag entspricht. Check Stocks sind rein durch Plaque Assay, alle Plaques sollten einen ähnlichen Plaque-Phänotyp haben.</li>
	<li>Verwenden Sie das PCR-Screening genomischer DNA, um sicherzustellen, dass virale Bestände rein sind.<ol>
<li>Designprimer, die die fluoreszierende Gen-Einfügungsstelle flankieren, und Primer, die das eingefügte fluoreszierende Gen selbst verstärken. Verschiedene Kombinationen dieser Primer erzeugen PCR-Amplicons, die die Geneinfügung erkennen und reinheit anzeigen.</li>
		<li>Verstärken Sie virale Bestände, um PCR in einem Brunnen einer 12-Well-Plattenmonolayer von BS-C-1-Zellen gescreent werden.</li>
		<li>24 Stunden nach der Infektion, kratzen infizierte Zellen in 250 l DMEM.</li>
		<li>Zentrifugen-infizierte Zellen (18.000 x g für 10 min, 4 °C), Überstand entfernen und Zellpellet in 500 l TE (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8) mit 0,1% (v/v) SDS wieder aufsetzen. Wirbel zu Lyse-Zellen.</li>
		<li>500 l Phenol-Chloroform-Isoamyl-Akohol hinzufügen, invertieren, um zu mischen. Zentrifuge (18.000 x g für 4 min, 4 °C). Nehmen Sie den Überstand und wiederholen Sie ihn.</li>
		<li>Führen Sie eine Ethanolfällung auf den Überstand durch Zugabe von 1 ml 100% Ethanol (gekühlt) und 50 l Natriumacetat, invertieren zu mischen.</li>
		<li>Bei -20 °C über Nacht oder -80 °C für 1 Stunde lassen. Zentrifuge (18.000 x g für 30 min, 4 °C), entfernen Sie alle Flüssigkeiten und lassen gefällte DNA lufttrocknen. Resuspend in 50 l TE.</li>
		<li>Verwenden Sie dies als Vorlage für das genomische DNA-PCR-Screening.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Generierung von rekombinanten Viren, die mehr als ein Tag tragen
<ol><li>Koinfizieren Sie dieselbe Zellmonoschicht mit fluoreszierenden rekombinanten Viren, um doppel- oder dreifach markierte Viren oder Wiederholungsprozeduren aus Protokoll 1) mit einem anderen Tag zu erzeugen.</li>
	<li>Reinigen Sie Viren auf der Grundlage von Plaque-Phänotyp oder PCR-Screening von Virusisolat genomische DNA.</li>
</ol>

<ol>
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Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Diese Technik beschreibt ein effizientes und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Viren, die fluoreszierend markierte virale Proteine ausdrücken. Die Methode stellt sicher, dass die einzige Änderung am viralen Genom die Hinzufügung eines Tags oder Markers ist, sodass keine Auswahlmarker zurückbleiben. Die kurze Armlänge, die für die homologe Rekombination erforderlich ist, ermöglicht seine direkte Synthese, wodurch mehrere zeitaufwändige Runden pcR und Klonen eliminiert werden, während die Fluoreszenz von mCherry und metabolische GPT-Auswahl verwendet werden, um virale Rekombinationszwischenprodukte zu isolieren. Diese Zwischenprodukte können nach der Entfernung der Selektion zu einem Virus mit einem markierten Gen oder zurück zum elterlichen Typ aufgelöst werden. Eine ähnliche Methode, bei der sowohl fluoreszierende als auch metabolische Selektion verwendet wird, wurde zuvor27 beschrieben, obwohl die in dieser Studie verwendete Methode kürzere, synthetisierte Homologiebereiche nutzt, die die Identifizierung des gewünschten rekombinanten Virus ermöglichen, indem die Fluoreszenz des markierten Gens von Interesse geschildert wird. Diese sekundäre Auswahl ist nur für die Kennzeichnung hochexprimierter viraler Gene anwendbar, die in einem Plaque-Assay eine ausreichende Fluoreszenz erzeugen. Alternativ könnte man sich vorstellen, eine vollständige Expressionskassette einzufügen, zum Beispiel ein fluoreszierendes Protein unter einem starken viralen Promotor. In diesem Fall würden die linken und rechten Arme den Einfügepunkt definieren und nicht das virale Gen, das markiert werden soll.
Es gibt einige wichtige Schritte, die sich während des experimentellen Verfahrens als hilfreich erwiesen haben. Die oben beschriebene Flüssigkeitsüberlagerung in Schritt 2.3.3 erwies sich als entscheidend für den Nachweis und die Isolierung von rot-grünen Fluoreszenz-Plaques. Wir glauben, dass die Kombination der GPT-Auswahlreagenzien und Agarose-Overlay das Wachstum rekombinanter Viren abschreckte und daher für den ersten Schritt der Verstärkung von Viren nach der Transfektion auf ein flüssiges Overlay umgestellt wurde. Es ist auch wichtig, fluoreszierende Plaques zu wählen, die lokalisierte Tag-Farbfluoreszenz zur Anreicherung und Reinigung zeigen, da Zwischenprodukte, die durch die Rekombination des linken Arms entstehen, zu einer diffusen Fluoreszenz führen können, die in Plaques beobachtet wird, wenn der linke Arm auch eine Promotorsequenz enthält. Das mCherry-Markergen im TDS-Vektor kann beispielsweise auch durch gfpersetzt werden, um die einfache Einbindung und Auswahl von mCherry als fluoreszierendes Tag zu ermöglichen.
Einige oben beschriebene Techniken unterscheiden sich geringfügig von etablierten Methoden zur Entstehung des rekombinanten Impfvirus. Zum Beispiel ist die MOI des Virus verwendet, um Rekombinanten zu erstellen ist in der Regel weniger als 128, aber die Verwendung von höheren MOIs war ausreichend für die Schaffung von rekombinanten Vaknienvirus mit dieser Methode. Die Verwendung von GPT-Selektionsreagenzien erfordert in der Regel eine Vorinkubation der Zellen mit Selektionsreagenzien18, allerdings bietet die Zugabe während der Rettungsphase nach der Infektion noch eine ausreichende Auswahl an gewünschten Rekombinanten, insbesondere aufgrund des Vorhandenseins eines fluoreszierenden Selektionsmarkers.
Wie bereits erwähnt, ist eine der Einschränkungen dieser Technik, dass der sekundäre Fluoreszenzauswahlschritt davon abhängt, dass das markierte Protein von Interesse stark exprimiert wird, auf einem Niveau, das seine Erkennung durch Das Auge in einem Plaque-Assay ermöglicht. Ohne dies wäre es möglich, Viren zu reinigen, die nur mCherry-Fluoreszenz aufweisen, von denen mindestens 50% die gewünschten rekombinanten Viren enthalten würden, die durch molekulare Strategien wie PCR, wie in Schritt 2.12 beschrieben, identifiziert werden könnten. Eine weitere Einschränkung könnte die Inaktivierung bestimmter Proteine als Folge ihrer Kennzeichnung sein. Das fluoreszierende Tag kann Mutationen durchmachen oder durch das rekombinante Virus mit Passaging im Laufe der Zeit ausgeschnitten werden. Daher wird eine regelmäßige Probenahme von rekombinanten Virusbeständen durch Mikroskopie und PCR empfohlen. Schließlich kann die Anzahl der fluoreszierend markierten Proteine begrenzt werden, die in ein einzelnes Virus eingearbeitet werden können. Ein Aspekt davon ist die Fähigkeit, sie alle gleichzeitig zu visualisieren; Angesichts der Überlappung der Emissionsspektren verfügbarer Fluoreszenz-Tags ist es wichtig, sie sorgfältig auszuwählen, um eine minimale spektrale Durchblutung zu gewährleisten. Darüber hinaus eröffnet die Verwendung eng verwandter Tags wie GFP und Cerulean die Möglichkeit einer Rekombination zwischen den beiden, abhängig von ihren Positionen im rekombinanten Genom.
Der modulare Charakter dieser Technik ermöglicht die einfache Substitution von Fluoreszenz-Tags basierend auf kompatibilität mit anderen Färbungs- und/oder Tag-Optionen. Durch die Ausscheidung wählbarer Marker ermöglicht die TDS-Methode die serielle Zugabe verschiedener fluoreszierender Proteine oder die Kombination von TDS-basiertem Tagging mit TDS-basierten Genlöschungen für phänotypische Analysen29. Als Beispiel für den Nutzen dieses Ansatzes wurde ein doppelt markiertes fluoreszierendes Virus erzeugt, das Viruskerne und die WV-Membran kennzeichnet. Bildgebende Studien mit diesem Virus könnten verwendet werden, um Bewegung, Morphogenese und Das Umhüllung von Viren während der Virusreplikation zu untersuchen. Noch nicht charakterisierte Impfungviralproteine können auch mit dieser Technik markiert und untersucht werden.
Das Vaccinia-Virus wurde in bildgebenden Studien aufgrund vieler Merkmale des Virus, die für die Live-Zellmikroskopie günstig sind, ausgiebig eingesetzt. Fluoreszierende Tags werden aus dem viralen Genom exprimiert, wodurch die Transfektion überflüssig wird, sodass Primärzellen, die von infizierten Tieren oder nicht transfizierbaren Zellen gewonnen wurden, leicht analysiert werden können. Anfänglich wurden fluoreszierende VACVs für die einfache subzelluläre Verfolgung der Virusbewegung30verwendet, aber neuere Ansätze haben ihren Nutzen erweitert, um FRET-Studien31, FRAP an einzelnen Viruspartikeln32, Promoter-Reporter33, intravitale Bildgebung34und Strukturstudien35-37. Alle diese Techniken könnten in der Nähe von einfacher und näherer Reichweite mit dieser Methode der Schaffung rekombinanter fluoreszierender Viren sein.

Das Vaccinia-Virus (VACV) ist das prototypische Poxvirus und steht in entham mit dem Variolavirus, dem Erreger der Pocken, in Verbindung. Beide Viren sind Mitglieder der Gattung orthopox, die andere bemerkenswerte Krankheitserreger wie Affenpocken und Ektomienvirus (Mauspocken)1umfasst. Orthopoxviren haben große doppelsträngige DNA-Genome (180-220 kb), die mehr als 200 vorhergesagte offene Leserahmen2,3kodieren. Die Replikation dieser Viren beinhaltet die Bildung einer perinuclearvirus-Fabrik, in der ausgereifte Viren (MV) hergestellt werden, und das Trans-Golgi-Netzwerk, in dem eine Teilmenge von MV zwei zusätzliche Membranen anschafft, um verpackte Viren (WV) zu erzeugen (überprüft von Roberts und Smith4). Orthopox-Genome sind aufgrund des hohen Grades an genetischer Rekombination, der ein Merkmal der VACV-Genomreplikation ist und durch die virale DNA-Polymerase5vermittelt wird, sehr gut für genetische Manipulationen geeignet. Die Generierung rekombinanter Viren beruht auf homologen Rekombinationen und linearen DNA-Molekülen, wobei Homologien von nur 12 bp ausreichen, um eine Rekombination in impfvirusinfizierten Zellen zu vermitteln6. Die fluoreszierende Kennzeichnung von Impfstoffviren kann aufgrund der großen Größe von Orthopoxpartikeln extrem helle Viruspartikel hervorigen, was die Aufnahme vieler fluoreszierender Proteine pro Virion7ermöglicht. Vaccinia hat die Fähigkeit, große Fragmente fremder DNA8 zu tragen, und darüber hinaus kann das Fehlen einer starren Kapsidsymmetrie ein gewisses Maß an Flexibilität beim Ausdruck viraler Proteingenfusionen aus ihrem endogene loci9ermöglichen. Fluoreszierende Kennzeichnung von VACV-Proteinen hat sich als unschätzbar erwiesen für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen auf subzellulärer Ebene, insbesondere im Bereich des Viruseintrags10, Transport11-13und Morphogenese, insbesondere von verpackten Virionen7.
Rekombinante Viren können durch Rettung eines abgeschwächten Wachstumsphäpnotyps14,15, metabolische Selektion16-18oder durch Expression eines Markergens(z.B. X-gal19 oder fluoreszierendes Protein13,20) ausgewählt werden. Hier beschreiben wir die Auswahl fluoreszierender Viren mit einer leistungsstarken Kombination aus fluoreszierender und metabolischer Selektion. Transient dominante Selektionsvektoren (TDS), entwickelt von Faulkner und Moss (1990)21, ermöglichen die Integration von Markern zusammen mit dem gewünschten fluoreszierend gekennzeichneten Gen von Interesse. Wenn die metabolische Selektion entfernt wird, kann ein sekundäres Rekombinationsereignis auftreten, das die Selektionsgene ausklammert, aber das fluoreszierend markierte Virusprotein intakt lässt. Abbildung 2 gibt einen Überblick über das experimentelle Verfahren. Die in dieser Studie verwendeten Selektionsgene sind mCherry und das Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase (gpt) Gen, beide aus einem synthetischen frühen/späten viralen Promotor exprimiert und zuvor von Cordeiro et al. verwendet. 22 Darüber hinaus gibt es fluoreszenz des markierten Fusionsproteins von Interesse. Wenn die metabolische Auswahl entfernt wird, werden die wählbaren Marker (mCherry und gpt) ausgeschnitten, sodass nur die Fluoreszenz des markierten Gens übrig bleibt, was die Identifizierung der richtigen rekombinanten Viren ermöglicht. Die Exzision der Selektionsmarker bietet die Möglichkeit, mehrere fluoreszierende Tags zu kombinieren, so dass wir Viren mit der Fähigkeit erzeugen können, mehrere virale Proteine gleichzeitig fluoreszierend zu kennzeichnen. Frühere Studien haben die minimalen Homologieanforderungen für die Vaknien-Rekombination von linearen und kreisförmigen DNA-Molekülen bestimmt, die in mit Dematratien infizierte Zellen transfiziert wurden6. Wir wollten die Rekombinationseffizienzen unterschiedlicher Homologielängen flankierender Arme im gpt-mCherry TDS-Vektor durch seine Aufnahme in das vaccinia virale Genom bestimmen. Es wurde festgestellt, dass homologe Regionen von 100 bp im TDS-Vektor ausreichen, um die Einfügung rekombinanter DNA in das VACV-Genom durch homologe Rekombination zu zielen und zu vermitteln (Abbildung 4). Während kleinere Homologielängen auch eine Rekombination ermöglichen würden, boten 100 bp Homologielängen genügend rekombinante Viren, die leicht mit metabolischer und fluoreszierender Selektion identifiziert werden konnten. DNA-Fragmente dieser Größe können zu relativ niedrigen Kosten kommerziell synthetisiert werden und erleichtern die Produktion mehrerer Vektoren für die Bildung rekombinanter Viren erheblich. Wir haben uns entschieden, die Homologielänge auf 150 bp zu erhöhen, um eine höhere Rekombinationshäufigkeit zu bieten und gleichzeitig die Kosten für die Synthese der Oligonukleotidsequenz flankierender Regionen niedrig zu halten.

<table><tbody><tr><td>Mycophenolic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>Dissolve in 0.1 N NaOH</td></tr><tr><td>Xanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X0626-5G</td><td>Dissolve in 0.1 N NaoH</td></tr><tr><td>FuGENE HD transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td><td>Olympus, Chroma</td><td>BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

Die Kennzeichnung viraler Proteine mit fluoreszierenden Proteinen hat sich als unverzichtbarer Ansatz erwiesen, um unser Verständnis von Virus-Host-Wechselwirkungen zu fördern. Das Vaccinia-Virus (VACV), der Lebendimpfstoff, der bei der Ausrottung von Pocken eingesetzt wird, ist aufgrund seiner großen Virionsgröße und der Leichtigkeit, mit der er auf Genomebene entwickelt werden kann, besonders für die fluoreszierende Lebendzellmikroskopie geeignet. Wir berichten hier über ein optimiertes Protokoll zur Generierung rekombinanter Viren. Es wurden die minimalen Anforderungen an eine gezielte homologe Rekombination während der Vaccinia-Replikation ermittelt, was eine Vereinfachung der Konstrukterzeugung ermöglicht. Dies ermöglichte die Allianz der transienten dominanten Selektion (TDS) mit einem fluoreszierenden Reporter und einer metabolischen Selektion, um einen schnellen und modularen Ansatz zur fluoreszierenden Kennzeichnung viraler Proteine zu bieten. Durch die Rationalisierung der Erzeugung fluoreszierender rekombinanter Viren sind wir in der Lage, nachgelagerte Anwendungen wie die erweiterte bildgebende Analyse vieler Aspekte des Virus-Host-Zusammenspiels, die während der Virusreplikation auftreten, zu erleichtern.

Abbildung 1 listet die verschiedenen Konstrukte auf, die für dieses Verfahren erforderlich sind, die entweder synthetisiert (Abbildungen 1b und 1c) oder durch Klonschritte erstellt werden (Abbildung 1d). Abbildung 2 gibt einen Überblick über das experimentelle Verfahren mit repräsentativen fluoreszierenden Plaquebildern eines A3-GFP-rekombinanten VACV, das für jeden Schritt des Auswahlprozesses dargestellt wird. In Abbildung 3werden rekombinante Impfviren gezeigt, die Proteine exmittierten, die mit fluoreszierenden Markern markiert sind, die auf virale Strukturproteine A3 und F13 abzielen, die Teil des inneren Viruskerns23 bzw. der äußeren Hülle24sind. Beobachtungen von Virusplaques und infizierten Zellen für jedes der erzeugten rekombinanten Viren werden dargestellt. Die Effizienz der homologen Rekombination von Vektoren mit dem VACV-Genom, das so wenig wie 70 bp Homologiebereiche enthält, wurde getestet und die Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. Der relative Erfolg der Identifizierung viraler Plaques, die aus der Rekombination mit Vektoren mit 100 bp Homologie hergestellt wurden, war der Grund für die Entscheidung, 150 bp Länge links und rechts der Homologie zum Zielgen zu synthetisieren.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Abbildung 1. Transient Dominant Selection (TDS) Rekombinationsvektor. (a) TDS-Vektor mit gpt- und mCherry-Auswahlmarkern. (b) Die linken und rechten Arme der Homologie sind mit spezifischen Restriktionsstellen dazwischen und flankierend auf die Arme der Homologie ausgelegt. Restriktionsstellen zwischen dem linken und rechten Arm, die bei dieser Methode verwendet wurden, waren NotI und BamHI, wobei die NotI-Site auch als Bindeglied zwischen dem Gen und dem fluoreszierenden Tag verwendet wurde. (c) Fluoreszierende Tags, die mit dieser Methode kompatibel sind, werden von entsprechenden Einschränkungsstellen flankiert. Einige Tags sind GFP (grünes fluoreszierendes Protein), RFP (rotes fluoreszierendes Protein), Cerulean (eine Verbesserung gegenüber ECFP, einem Cyan-Fluoreszenzprotein, durch standortgesteuerte Mutagenese25) und Mini-SOG, ein fluoreszierendes Protein aus GFP, das ein Produkt erzeugt, das von EM auf Beleuchtung aufbereitet wird26. (d) Klonschritte bei der Erzeugung des endgültigen TDS-Rekombinationsvektors. Das synthetisierte Oligonukleotid, das die linken und rechten Flankenarme enthält, wird zuerst in den TDS-Vektor geklont. Dies bietet einen Rekombinationsvektor, in den jedes Tag ihrer Wahl durch Klonen in die Zwischenhalteflächen zwischen dem linken und rechten Arm ein- und ausgegliedert werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Abbildung 2. Gliederung des experimentellen Verfahrens zur Erstellung eines rekombinanten Impfungsvirus. Ereignisse, die auf genetischer und zellulärer Ebene auftreten, werden dargestellt, zusammen mit repräsentativen Plaque-Bildern, die die Schritte nach der Entstehung eines A3-GFP-markierten fluoreszierenden Impfvirus skizzieren. (A) Zellen, die mit dem Impfvirus infiziert sind, werden mit dem TDS-Rekombinationsvektor transfiziert. (B) In dieser Abbildung wird nur das Ergebnis der Linksrekombination dargestellt, und das Beispiel verwendet GFP als fluoreszierendes Tag der Wahl. Eine Rechtsrekombination würde dazu führen, dass das gesamte TDS-Plasmid in ähnlicher Weise in das Genom integriert wird, außer dass das Tag im Zwischenschritt, d. h. Schritt C, mit dem gesamten Zielgen verschmolzen würde. Ein Plaque-Assay wird auf einer Zellmonolayer mit dem Rekombinationsmix durchgeführt und der GPT-Auswahl unterzogen. (C) Plaques mit roter und grüner Fluoreszenz, die dem mCherry- bzw. GFP-Ausdruck entsprechen, werden gepflückt und verstärkt. Sobald die Selektion entfernt ist, wird es einen Verlust der roten Fluoreszenz geben, der dem Verlust der gpt- und mCherry-Gene (D) entspricht, und Plaques, die ausschließlich grüne Fluoreszenz aufweisen, werden gepflückt und verstärkt (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse des TDS-Rekombinationssystems. Die Bilder zeigen ganze Plaques rekombinanter VACV-Infektionszellen nach 48 Stunden(a, c, e; Scale bar 100 m), begleitet von einem Bild einer einzelnen Zelle, die nach 8 Stunden mit dem entsprechenden rekombinanten Virus infiziert ist (b, d, f; Scale bar 10 m). Gene, die Virionen-lokalisierten Proteinen entsprechen, wurden ausgewählt, um Viruspartikel zu visualisieren. A3 ist ein Kernprotein der Vaknia virion (a, b) und F13 (c, d) ist ein virales Umschlagprotein. Ein doppelt markiertes Virus mit fluoreszierend a3 und F13 (e, f) wird ebenfalls gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Abbildung 4. Quantitative Analyse der Rekombinationseffizienz zwischen rekombinanten Vektoren und dem VACV-Genom. BS-C-1-Monolayer wurden mit VACV infiziert und transfizierten 1 Stunde nach der Infektion mit drei Rekombinationsvektoren, die Homologiebereiche von entweder 500 bp, 100 bp oder 70 bp zum VACV-Genom enthielten. Jeder Vektor enthielt auch die TDS-Kassette, die gpt- und mCherry-Selektionsgene enthielt. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Infektion geborgen und lysiert, um die gebildeten rekombinanten Viren freizusetzen. Plaque-Assays wurden an Zelllysaten mit GPT-Auswahlmedien durchgeführt und Plaques, die mCherry Fluoreszenz zeigten, wurden als erfolgreiche Rekombinanten gezählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Abbildung 5. Karte des gpt-mCherry TDS-Vektors, der die Multiple-Klon-Site anzeigt. Der Vektor wurde zuvor22 beschrieben und die Vektorkarte wurde mit Hilfe von EZ Plasmid Map v1.9 von der Zhang Lab Group (SCU) erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

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Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Hier wird ein schnelles und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Impfstoffviren beschrieben, die fluoreszierend markierte Proteine gleichzeitig mit der Methode der transienten dominanten Selektion exezieren.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Aufrufe.  University of Sydney. Hier wird ein schnelles und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Impfstoffviren beschrieben, die fluoreszierend markierte Proteine gleichzeitig mit der Methode der transienten dominanten Selektion exezieren.

Serie: Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Forschung

Medizin

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Immunologie und Infektion

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Neurowissenschaften

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.

Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased biosafety and stability over use of live pathogens. Non-infectious and self-assembling, VLPs are used to present structural proteins as immunogens, bypassing the need for live pathogens or recombinant viral vectors for antigen delivery. In this article, we demonstrate the different stages of VLP design and development for future applications in preclinical animal testing. The procedure includes the following stages: selection of antigen, expression of antigen in cell line of choice, purification of VLPs/SVPs, and quantification for antigen dosing. We demonstrate use of both mammalian and insect cell lines for expression of our antigens and demonstrate how methodologies differ in yield. The methodology presented may apply to a variety of pathogens and can be achieved by substituting the antigens with immunogenic structural proteins of the user&#39;s microorganism of interest. VLPs and SVPs assist with antigen characterization and selection of the best vaccine candidates.

Here, we present a protocol for synthesizing virus-like particles using either baculovirus or mammalian expression systems, and ultracentrifugation purification. This highly customizable approach is used to identify viral antigens as vaccine targets in a safe and flexible manner.

Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Biologie

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Vereinfachte und effiziente AAV-Produktion mit HEK293-Suspensionskultur

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, demonstrate extensive transduction of the CNS by intravenous injection in mice. To achieve comparable transduction, a 100-fold higher titer (minimally 1 x 1011 genome copies/mouse) is needed compared to direct injection in the CNS parenchyma. In our group, AAV production, including AAV.PHP.eB relies on adherent HEK293T cells and the triple transfection method. Achieving high yields of AAV with adherent cells entails a labor- and material-intensive process. This constraint prompted the development of a protocol for suspension-based cell culture in conical tubes. AAVs generated in adherent cells were compared to the suspension production method. Culture in suspension using transfection reagents Polyethylenimine or TransIt were compared. AAV vectors were purified by iodixanol gradient ultracentrifugation followed by buffer exchange and concentration using a centrifugal filter. With the adherent method, we achieved an average of 2.6 x 1012 genome copies (GC) total, whereas the suspension method and Polyethylenimine yielded 7.7 x 1012 GC in total, and TransIt yielded 2.4 x 1013 GC in total. There is no difference in in vivo transduction efficiency between vectors produced with adherent compared to the suspension cell system. In summary, a suspension HEK293 cell based AAV production protocol is introduced, resulting in a reduced amount of time and labor needed for vector production while achieving 3 to 9 times higher yields using components available from commercial vendors for research purposes.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Gentherapie mit AAV-Vektoren mit hoher Ausbeute durch HEK293-Suspensionszellkultivierung

Here, a suspension HEK293 cell-based AAV production protocol is presented, resulting in reduced time and labor needed for vector production using components that are available for research purposes from commercial vendors.

Herstellung von Adeno-assoziierten Vektorchargen mit hoher Ausbeute unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...