Diese Arbeit wurde durch das Australian Research Council Federation Discovery Project Grant #1096623 finanziert.

1. Erstellen des Rekombinationsvektors
<ol><li>Identifizieren Sie 150 bp lange flankierende Bereiche der Homologie (als linke und rechte Arme bezeichnet), die erforderlich sind, um entweder N- oder C-terminal zu kennzeichnen, das virusische Gen von Interesse zu kennzeichnen (siehe Abbildung 1b).</li>
	<li>Entwerfen Sie eine Oligonukleotid-Sequenz, die die 150 bp linken und rechten Arme umfasst, die durch ein Paar von Restriktionsstellen ihrer Wahl getrennt sind. Diese gesamte Sequenz muss auch durch ein zweites Paar von Restriktionsstellen (anders als das erste Paar) flankiert werden, um die Aufnahme in den TDS-Vektor nach der Synthese zu ermöglichen. Achten Sie beim Entwerfen des Oligonukleotids mit Restriktionsstellen darauf, dass die Sequenzen im Rahmen mit der gewünschten Einfügestelle sind.</li>
	<li>Integrieren Sie Bei der Gestaltung des Oligonukleotids für die Synthese Restriktionsstellen zwischen dem linken und dem rechten Arm,die denen entsprechen müssen, die den offenen Leserahmen des fluoreszierenden Tags der Wahl flankieren (siehe Abbildung 1b). Es ist möglich, eine NotI-Einschränkungsstelle als drei Aminosäure-Linker zwischen dem linken Arm und dem Beginn des Fluoreszenz-Tags zu verwenden.</li>
	<li>Integrieren Sie dieselben Restriktionssites auf beiden Seiten des Fluoreszenz-Tags durch PCR (siehe Abbildung 1c).</li>
	<li>Klonen Sie das synthetisierte Fragment in den TDS-Vektor.</li>
	<li>Klonen Sie das fluoreszierende Tag in den resultierenden Rekombinationsvektor mithilfe der Einschränkungsstellen zwischen dem linken und rechten Armder der Homologie (siehe Abbildung 1d).</li>
</ol>2. Rekombinante Virusgenerierung
<ol><li>Gemäß Abbildung 2infizieren Sie eine Monoschicht von BS-C-1-Zellen mit dem Impfvirus in serumfreien Medien bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) > 1.</li>
	<li>1 Std. nach der Infektion, Rettungszellen mit Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) und transfekt mit einer Mischung aus Rekombinationsvektorplasmid und Transfektionsreagenz im Verhältnis 3:1 in serumfreien Medien.</li>
	<li>Nach 24 Stunden, kratzen und erholen Zellen in DMEM enthält kein fetales Rinderserum (FBS) und führen Drei Frost-Tau-Zyklen, um aufgebrochene Zellen zu brechen und Viruspartikel freizusetzen.</li>
	<li>Führen Sie einen Plaque-Assay mit einem flüssigen Overlay von 10% FBS DMEM und GPT-Auswahlreagenzien Mycophenolsäure (25 g/ml) und Xanthin (250 g/ml) wie folgt durch:<ol>
<li>Säen Sie eine 6-Well-Platte mit einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen.</li>
		<li>Infizieren Sie 100% konfluente Zellmonolayer mit seriellen Verdünnungen der gefriergetauten Zellen, die Viruspartikel enthalten, um eine angemessene Trennung einzelner Plaques zu gewährleisten.</li>
		<li>Overlay mit flüssigen 10% FBS enthaltende DMEM enthält die GPT-Auswahlreagenzien - Mycophenolsäure und Xanthin bei Endkonzentrationen von 25 g/ml bzw. 250 g/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach einer 24-stündigen Inkubation entfernen Sie die Flüssigkeitsüberlagerung und suchen mit einem Fluoreszenzmikroskop nach Plaques, die eine diffuse rote Fluoreszenz aufweisen, die der Einbeziehung von mCherry aus dem TDS-Vektor in das Virus entspricht. Je nach Zielgen und gewähltem Fluoreszenz-Tag kann die lokalisierte Fluoreszenz des markierten Gens auch in derselben roten Plaque beobachtet werden.</li>
	<li>Wählen Sie mehrere Plaques für jedes rekombinante Virus durch lokalisiertes Abkratzen mit einer Pipettenspitze und 100 l 5% FBS, das DMEM enthält, um Zellen in ein Eppendorf-Rohr zu übertragen, gefolgt von drei Runden Gefriertau von abgekratzten Zellen, um rekombinante Viren freizusetzen.</li>
	<li>Fügen Sie das DMEM enthaltende gefriertaute Virus zu einer Monoschicht von Zellen in einer 12-Well-Platte hinzu, um rekombinante Viren mit GPT-Selektionsreagenzien in den Wachstumsmedien zu verstärken. Kratze erfolgreiche Verstärkungen 24 Stunden nach der Infektion.</li>
	<li>Führen Sie einen Plaque-Test von erfolgreich verstärkten Plaques mit roter Fluoreszenz durch, diesmal mit einer Agarose-Overlay- und GPT-Auswahl, wie folgt:<ol>
<li>Säen Sie eine 6-Well-Platte mit einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen.</li>
		<li>Führen Sie eine serielle Verdünnung der rekombinanten Viren durch und infizieren Sie Brunnen mit einer zunehmenden Verdünnung von Viren in FBS-freiem DMEM.</li>
		<li>1 Std. nach der Infektion, entfernen Sie die flüssigen Medien und überlagern Sie jeden Brunnen mit 0,5% Agarose in minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 2,5% FBS, 292 g/ml L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin, zusammen mit den GPT-Auswahlreagenzien.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 Tage nach der Infektion, Wählen Sie Plaques mit Fluoreszenz, die sowohl rot ist und die Farbe der gewählten Fluoreszenz-Tag wieder zu verstärken, diesmal ohne GPT-Auswahl.</li>
	<li>Führen Sie den nächsten Plaque-Assay mit einem Agarose-Overlay ohne Auswahl durch.</li>
	<li>Wählen Sie Plaques, die ihre diffuse rote Fluoreszenz verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem Tag der Wahl entspricht.</li>
	<li>Setzen Sie die Plaquereinigung ohne Auswahl fort, um einen reinen Vorrat an rekombinanten Viren zu erhalten, die die mCherry- und gpt-Selektionsgene verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem gewählten Tag entspricht. Check Stocks sind rein durch Plaque Assay, alle Plaques sollten einen ähnlichen Plaque-Phänotyp haben.</li>
	<li>Verwenden Sie das PCR-Screening genomischer DNA, um sicherzustellen, dass virale Bestände rein sind.<ol>
<li>Designprimer, die die fluoreszierende Gen-Einfügungsstelle flankieren, und Primer, die das eingefügte fluoreszierende Gen selbst verstärken. Verschiedene Kombinationen dieser Primer erzeugen PCR-Amplicons, die die Geneinfügung erkennen und reinheit anzeigen.</li>
		<li>Verstärken Sie virale Bestände, um PCR in einem Brunnen einer 12-Well-Plattenmonolayer von BS-C-1-Zellen gescreent werden.</li>
		<li>24 Stunden nach der Infektion, kratzen infizierte Zellen in 250 l DMEM.</li>
		<li>Zentrifugen-infizierte Zellen (18.000 x g für 10 min, 4 °C), Überstand entfernen und Zellpellet in 500 l TE (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8) mit 0,1% (v/v) SDS wieder aufsetzen. Wirbel zu Lyse-Zellen.</li>
		<li>500 l Phenol-Chloroform-Isoamyl-Akohol hinzufügen, invertieren, um zu mischen. Zentrifuge (18.000 x g für 4 min, 4 °C). Nehmen Sie den Überstand und wiederholen Sie ihn.</li>
		<li>Führen Sie eine Ethanolfällung auf den Überstand durch Zugabe von 1 ml 100% Ethanol (gekühlt) und 50 l Natriumacetat, invertieren zu mischen.</li>
		<li>Bei -20 °C über Nacht oder -80 °C für 1 Stunde lassen. Zentrifuge (18.000 x g für 30 min, 4 °C), entfernen Sie alle Flüssigkeiten und lassen gefällte DNA lufttrocknen. Resuspend in 50 l TE.</li>
		<li>Verwenden Sie dies als Vorlage für das genomische DNA-PCR-Screening.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Generierung von rekombinanten Viren, die mehr als ein Tag tragen
<ol><li>Koinfizieren Sie dieselbe Zellmonoschicht mit fluoreszierenden rekombinanten Viren, um doppel- oder dreifach markierte Viren oder Wiederholungsprozeduren aus Protokoll 1) mit einem anderen Tag zu erzeugen.</li>
	<li>Reinigen Sie Viren auf der Grundlage von Plaque-Phänotyp oder PCR-Screening von Virusisolat genomische DNA.</li>
</ol>

<ol>
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Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Diese Technik beschreibt ein effizientes und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Viren, die fluoreszierend markierte virale Proteine ausdrücken. Die Methode stellt sicher, dass die einzige Änderung am viralen Genom die Hinzufügung eines Tags oder Markers ist, sodass keine Auswahlmarker zurückbleiben. Die kurze Armlänge, die für die homologe Rekombination erforderlich ist, ermöglicht seine direkte Synthese, wodurch mehrere zeitaufwändige Runden pcR und Klonen eliminiert werden, während die Fluoreszenz von mCherry und metabolische GPT-Auswahl verwendet werden, um virale Rekombinationszwischenprodukte zu isolieren. Diese Zwischenprodukte können nach der Entfernung der Selektion zu einem Virus mit einem markierten Gen oder zurück zum elterlichen Typ aufgelöst werden. Eine ähnliche Methode, bei der sowohl fluoreszierende als auch metabolische Selektion verwendet wird, wurde zuvor27 beschrieben, obwohl die in dieser Studie verwendete Methode kürzere, synthetisierte Homologiebereiche nutzt, die die Identifizierung des gewünschten rekombinanten Virus ermöglichen, indem die Fluoreszenz des markierten Gens von Interesse geschildert wird. Diese sekundäre Auswahl ist nur für die Kennzeichnung hochexprimierter viraler Gene anwendbar, die in einem Plaque-Assay eine ausreichende Fluoreszenz erzeugen. Alternativ könnte man sich vorstellen, eine vollständige Expressionskassette einzufügen, zum Beispiel ein fluoreszierendes Protein unter einem starken viralen Promotor. In diesem Fall würden die linken und rechten Arme den Einfügepunkt definieren und nicht das virale Gen, das markiert werden soll.
Es gibt einige wichtige Schritte, die sich während des experimentellen Verfahrens als hilfreich erwiesen haben. Die oben beschriebene Flüssigkeitsüberlagerung in Schritt 2.3.3 erwies sich als entscheidend für den Nachweis und die Isolierung von rot-grünen Fluoreszenz-Plaques. Wir glauben, dass die Kombination der GPT-Auswahlreagenzien und Agarose-Overlay das Wachstum rekombinanter Viren abschreckte und daher für den ersten Schritt der Verstärkung von Viren nach der Transfektion auf ein flüssiges Overlay umgestellt wurde. Es ist auch wichtig, fluoreszierende Plaques zu wählen, die lokalisierte Tag-Farbfluoreszenz zur Anreicherung und Reinigung zeigen, da Zwischenprodukte, die durch die Rekombination des linken Arms entstehen, zu einer diffusen Fluoreszenz führen können, die in Plaques beobachtet wird, wenn der linke Arm auch eine Promotorsequenz enthält. Das mCherry-Markergen im TDS-Vektor kann beispielsweise auch durch gfpersetzt werden, um die einfache Einbindung und Auswahl von mCherry als fluoreszierendes Tag zu ermöglichen.
Einige oben beschriebene Techniken unterscheiden sich geringfügig von etablierten Methoden zur Entstehung des rekombinanten Impfvirus. Zum Beispiel ist die MOI des Virus verwendet, um Rekombinanten zu erstellen ist in der Regel weniger als 128, aber die Verwendung von höheren MOIs war ausreichend für die Schaffung von rekombinanten Vaknienvirus mit dieser Methode. Die Verwendung von GPT-Selektionsreagenzien erfordert in der Regel eine Vorinkubation der Zellen mit Selektionsreagenzien18, allerdings bietet die Zugabe während der Rettungsphase nach der Infektion noch eine ausreichende Auswahl an gewünschten Rekombinanten, insbesondere aufgrund des Vorhandenseins eines fluoreszierenden Selektionsmarkers.
Wie bereits erwähnt, ist eine der Einschränkungen dieser Technik, dass der sekundäre Fluoreszenzauswahlschritt davon abhängt, dass das markierte Protein von Interesse stark exprimiert wird, auf einem Niveau, das seine Erkennung durch Das Auge in einem Plaque-Assay ermöglicht. Ohne dies wäre es möglich, Viren zu reinigen, die nur mCherry-Fluoreszenz aufweisen, von denen mindestens 50% die gewünschten rekombinanten Viren enthalten würden, die durch molekulare Strategien wie PCR, wie in Schritt 2.12 beschrieben, identifiziert werden könnten. Eine weitere Einschränkung könnte die Inaktivierung bestimmter Proteine als Folge ihrer Kennzeichnung sein. Das fluoreszierende Tag kann Mutationen durchmachen oder durch das rekombinante Virus mit Passaging im Laufe der Zeit ausgeschnitten werden. Daher wird eine regelmäßige Probenahme von rekombinanten Virusbeständen durch Mikroskopie und PCR empfohlen. Schließlich kann die Anzahl der fluoreszierend markierten Proteine begrenzt werden, die in ein einzelnes Virus eingearbeitet werden können. Ein Aspekt davon ist die Fähigkeit, sie alle gleichzeitig zu visualisieren; Angesichts der Überlappung der Emissionsspektren verfügbarer Fluoreszenz-Tags ist es wichtig, sie sorgfältig auszuwählen, um eine minimale spektrale Durchblutung zu gewährleisten. Darüber hinaus eröffnet die Verwendung eng verwandter Tags wie GFP und Cerulean die Möglichkeit einer Rekombination zwischen den beiden, abhängig von ihren Positionen im rekombinanten Genom.
Der modulare Charakter dieser Technik ermöglicht die einfache Substitution von Fluoreszenz-Tags basierend auf kompatibilität mit anderen Färbungs- und/oder Tag-Optionen. Durch die Ausscheidung wählbarer Marker ermöglicht die TDS-Methode die serielle Zugabe verschiedener fluoreszierender Proteine oder die Kombination von TDS-basiertem Tagging mit TDS-basierten Genlöschungen für phänotypische Analysen29. Als Beispiel für den Nutzen dieses Ansatzes wurde ein doppelt markiertes fluoreszierendes Virus erzeugt, das Viruskerne und die WV-Membran kennzeichnet. Bildgebende Studien mit diesem Virus könnten verwendet werden, um Bewegung, Morphogenese und Das Umhüllung von Viren während der Virusreplikation zu untersuchen. Noch nicht charakterisierte Impfungviralproteine können auch mit dieser Technik markiert und untersucht werden.
Das Vaccinia-Virus wurde in bildgebenden Studien aufgrund vieler Merkmale des Virus, die für die Live-Zellmikroskopie günstig sind, ausgiebig eingesetzt. Fluoreszierende Tags werden aus dem viralen Genom exprimiert, wodurch die Transfektion überflüssig wird, sodass Primärzellen, die von infizierten Tieren oder nicht transfizierbaren Zellen gewonnen wurden, leicht analysiert werden können. Anfänglich wurden fluoreszierende VACVs für die einfache subzelluläre Verfolgung der Virusbewegung30verwendet, aber neuere Ansätze haben ihren Nutzen erweitert, um FRET-Studien31, FRAP an einzelnen Viruspartikeln32, Promoter-Reporter33, intravitale Bildgebung34und Strukturstudien35-37. Alle diese Techniken könnten in der Nähe von einfacher und näherer Reichweite mit dieser Methode der Schaffung rekombinanter fluoreszierender Viren sein.

Das Vaccinia-Virus (VACV) ist das prototypische Poxvirus und steht in entham mit dem Variolavirus, dem Erreger der Pocken, in Verbindung. Beide Viren sind Mitglieder der Gattung orthopox, die andere bemerkenswerte Krankheitserreger wie Affenpocken und Ektomienvirus (Mauspocken)1umfasst. Orthopoxviren haben große doppelsträngige DNA-Genome (180-220 kb), die mehr als 200 vorhergesagte offene Leserahmen2,3kodieren. Die Replikation dieser Viren beinhaltet die Bildung einer perinuclearvirus-Fabrik, in der ausgereifte Viren (MV) hergestellt werden, und das Trans-Golgi-Netzwerk, in dem eine Teilmenge von MV zwei zusätzliche Membranen anschafft, um verpackte Viren (WV) zu erzeugen (überprüft von Roberts und Smith4). Orthopox-Genome sind aufgrund des hohen Grades an genetischer Rekombination, der ein Merkmal der VACV-Genomreplikation ist und durch die virale DNA-Polymerase5vermittelt wird, sehr gut für genetische Manipulationen geeignet. Die Generierung rekombinanter Viren beruht auf homologen Rekombinationen und linearen DNA-Molekülen, wobei Homologien von nur 12 bp ausreichen, um eine Rekombination in impfvirusinfizierten Zellen zu vermitteln6. Die fluoreszierende Kennzeichnung von Impfstoffviren kann aufgrund der großen Größe von Orthopoxpartikeln extrem helle Viruspartikel hervorigen, was die Aufnahme vieler fluoreszierender Proteine pro Virion7ermöglicht. Vaccinia hat die Fähigkeit, große Fragmente fremder DNA8 zu tragen, und darüber hinaus kann das Fehlen einer starren Kapsidsymmetrie ein gewisses Maß an Flexibilität beim Ausdruck viraler Proteingenfusionen aus ihrem endogene loci9ermöglichen. Fluoreszierende Kennzeichnung von VACV-Proteinen hat sich als unschätzbar erwiesen für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen auf subzellulärer Ebene, insbesondere im Bereich des Viruseintrags10, Transport11-13und Morphogenese, insbesondere von verpackten Virionen7.
Rekombinante Viren können durch Rettung eines abgeschwächten Wachstumsphäpnotyps14,15, metabolische Selektion16-18oder durch Expression eines Markergens(z.B. X-gal19 oder fluoreszierendes Protein13,20) ausgewählt werden. Hier beschreiben wir die Auswahl fluoreszierender Viren mit einer leistungsstarken Kombination aus fluoreszierender und metabolischer Selektion. Transient dominante Selektionsvektoren (TDS), entwickelt von Faulkner und Moss (1990)21, ermöglichen die Integration von Markern zusammen mit dem gewünschten fluoreszierend gekennzeichneten Gen von Interesse. Wenn die metabolische Selektion entfernt wird, kann ein sekundäres Rekombinationsereignis auftreten, das die Selektionsgene ausklammert, aber das fluoreszierend markierte Virusprotein intakt lässt. Abbildung 2 gibt einen Überblick über das experimentelle Verfahren. Die in dieser Studie verwendeten Selektionsgene sind mCherry und das Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase (gpt) Gen, beide aus einem synthetischen frühen/späten viralen Promotor exprimiert und zuvor von Cordeiro et al. verwendet. 22 Darüber hinaus gibt es fluoreszenz des markierten Fusionsproteins von Interesse. Wenn die metabolische Auswahl entfernt wird, werden die wählbaren Marker (mCherry und gpt) ausgeschnitten, sodass nur die Fluoreszenz des markierten Gens übrig bleibt, was die Identifizierung der richtigen rekombinanten Viren ermöglicht. Die Exzision der Selektionsmarker bietet die Möglichkeit, mehrere fluoreszierende Tags zu kombinieren, so dass wir Viren mit der Fähigkeit erzeugen können, mehrere virale Proteine gleichzeitig fluoreszierend zu kennzeichnen. Frühere Studien haben die minimalen Homologieanforderungen für die Vaknien-Rekombination von linearen und kreisförmigen DNA-Molekülen bestimmt, die in mit Dematratien infizierte Zellen transfiziert wurden6. Wir wollten die Rekombinationseffizienzen unterschiedlicher Homologielängen flankierender Arme im gpt-mCherry TDS-Vektor durch seine Aufnahme in das vaccinia virale Genom bestimmen. Es wurde festgestellt, dass homologe Regionen von 100 bp im TDS-Vektor ausreichen, um die Einfügung rekombinanter DNA in das VACV-Genom durch homologe Rekombination zu zielen und zu vermitteln (Abbildung 4). Während kleinere Homologielängen auch eine Rekombination ermöglichen würden, boten 100 bp Homologielängen genügend rekombinante Viren, die leicht mit metabolischer und fluoreszierender Selektion identifiziert werden konnten. DNA-Fragmente dieser Größe können zu relativ niedrigen Kosten kommerziell synthetisiert werden und erleichtern die Produktion mehrerer Vektoren für die Bildung rekombinanter Viren erheblich. Wir haben uns entschieden, die Homologielänge auf 150 bp zu erhöhen, um eine höhere Rekombinationshäufigkeit zu bieten und gleichzeitig die Kosten für die Synthese der Oligonukleotidsequenz flankierender Regionen niedrig zu halten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mycophenolic acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3536-50MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 0.1N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xanthine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X0626-5G</td>
			<td>Dissolve in 0.1N NaoH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE HD transfection reagent</td>
			<td style="width:95px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td>
			<td style="width:95px;">Olympus, Chroma</td>
			<td style="width:119px;">BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

Die Kennzeichnung viraler Proteine mit fluoreszierenden Proteinen hat sich als unverzichtbarer Ansatz erwiesen, um unser Verständnis von Virus-Host-Wechselwirkungen zu fördern. Das Vaccinia-Virus (VACV), der Lebendimpfstoff, der bei der Ausrottung von Pocken eingesetzt wird, ist aufgrund seiner großen Virionsgröße und der Leichtigkeit, mit der er auf Genomebene entwickelt werden kann, besonders für die fluoreszierende Lebendzellmikroskopie geeignet. Wir berichten hier über ein optimiertes Protokoll zur Generierung rekombinanter Viren. Es wurden die minimalen Anforderungen an eine gezielte homologe Rekombination während der Vaccinia-Replikation ermittelt, was eine Vereinfachung der Konstrukterzeugung ermöglicht. Dies ermöglichte die Allianz der transienten dominanten Selektion (TDS) mit einem fluoreszierenden Reporter und einer metabolischen Selektion, um einen schnellen und modularen Ansatz zur fluoreszierenden Kennzeichnung viraler Proteine zu bieten. Durch die Rationalisierung der Erzeugung fluoreszierender rekombinanter Viren sind wir in der Lage, nachgelagerte Anwendungen wie die erweiterte bildgebende Analyse vieler Aspekte des Virus-Host-Zusammenspiels, die während der Virusreplikation auftreten, zu erleichtern.

Abbildung 1 listet die verschiedenen Konstrukte auf, die für dieses Verfahren erforderlich sind, die entweder synthetisiert (Abbildungen 1b und 1c) oder durch Klonschritte erstellt werden (Abbildung 1d). Abbildung 2 gibt einen Überblick über das experimentelle Verfahren mit repräsentativen fluoreszierenden Plaquebildern eines A3-GFP-rekombinanten VACV, das für jeden Schritt des Auswahlprozesses dargestellt wird. In Abbildung 3werden rekombinante Impfviren gezeigt, die Proteine exmittierten, die mit fluoreszierenden Markern markiert sind, die auf virale Strukturproteine A3 und F13 abzielen, die Teil des inneren Viruskerns23 bzw. der äußeren Hülle24sind. Beobachtungen von Virusplaques und infizierten Zellen für jedes der erzeugten rekombinanten Viren werden dargestellt. Die Effizienz der homologen Rekombination von Vektoren mit dem VACV-Genom, das so wenig wie 70 bp Homologiebereiche enthält, wurde getestet und die Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. Der relative Erfolg der Identifizierung viraler Plaques, die aus der Rekombination mit Vektoren mit 100 bp Homologie hergestellt wurden, war der Grund für die Entscheidung, 150 bp Länge links und rechts der Homologie zum Zielgen zu synthetisieren.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Abbildung 1. Transient Dominant Selection (TDS) Rekombinationsvektor. (a) TDS-Vektor mit gpt- und mCherry-Auswahlmarkern. (b) Die linken und rechten Arme der Homologie sind mit spezifischen Restriktionsstellen dazwischen und flankierend auf die Arme der Homologie ausgelegt. Restriktionsstellen zwischen dem linken und rechten Arm, die bei dieser Methode verwendet wurden, waren NotI und BamHI, wobei die NotI-Site auch als Bindeglied zwischen dem Gen und dem fluoreszierenden Tag verwendet wurde. (c) Fluoreszierende Tags, die mit dieser Methode kompatibel sind, werden von entsprechenden Einschränkungsstellen flankiert. Einige Tags sind GFP (grünes fluoreszierendes Protein), RFP (rotes fluoreszierendes Protein), Cerulean (eine Verbesserung gegenüber ECFP, einem Cyan-Fluoreszenzprotein, durch standortgesteuerte Mutagenese25) und Mini-SOG, ein fluoreszierendes Protein aus GFP, das ein Produkt erzeugt, das von EM auf Beleuchtung aufbereitet wird26. (d) Klonschritte bei der Erzeugung des endgültigen TDS-Rekombinationsvektors. Das synthetisierte Oligonukleotid, das die linken und rechten Flankenarme enthält, wird zuerst in den TDS-Vektor geklont. Dies bietet einen Rekombinationsvektor, in den jedes Tag ihrer Wahl durch Klonen in die Zwischenhalteflächen zwischen dem linken und rechten Arm ein- und ausgegliedert werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Abbildung 2. Gliederung des experimentellen Verfahrens zur Erstellung eines rekombinanten Impfungsvirus. Ereignisse, die auf genetischer und zellulärer Ebene auftreten, werden dargestellt, zusammen mit repräsentativen Plaque-Bildern, die die Schritte nach der Entstehung eines A3-GFP-markierten fluoreszierenden Impfvirus skizzieren. (A) Zellen, die mit dem Impfvirus infiziert sind, werden mit dem TDS-Rekombinationsvektor transfiziert. (B) In dieser Abbildung wird nur das Ergebnis der Linksrekombination dargestellt, und das Beispiel verwendet GFP als fluoreszierendes Tag der Wahl. Eine Rechtsrekombination würde dazu führen, dass das gesamte TDS-Plasmid in ähnlicher Weise in das Genom integriert wird, außer dass das Tag im Zwischenschritt, d. h. Schritt C, mit dem gesamten Zielgen verschmolzen würde. Ein Plaque-Assay wird auf einer Zellmonolayer mit dem Rekombinationsmix durchgeführt und der GPT-Auswahl unterzogen. (C) Plaques mit roter und grüner Fluoreszenz, die dem mCherry- bzw. GFP-Ausdruck entsprechen, werden gepflückt und verstärkt. Sobald die Selektion entfernt ist, wird es einen Verlust der roten Fluoreszenz geben, der dem Verlust der gpt- und mCherry-Gene (D) entspricht, und Plaques, die ausschließlich grüne Fluoreszenz aufweisen, werden gepflückt und verstärkt (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse des TDS-Rekombinationssystems. Die Bilder zeigen ganze Plaques rekombinanter VACV-Infektionszellen nach 48 Stunden(a, c, e; Scale bar 100 m), begleitet von einem Bild einer einzelnen Zelle, die nach 8 Stunden mit dem entsprechenden rekombinanten Virus infiziert ist (b, d, f; Scale bar 10 m). Gene, die Virionen-lokalisierten Proteinen entsprechen, wurden ausgewählt, um Viruspartikel zu visualisieren. A3 ist ein Kernprotein der Vaknia virion (a, b) und F13 (c, d) ist ein virales Umschlagprotein. Ein doppelt markiertes Virus mit fluoreszierend a3 und F13 (e, f) wird ebenfalls gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Abbildung 4. Quantitative Analyse der Rekombinationseffizienz zwischen rekombinanten Vektoren und dem VACV-Genom. BS-C-1-Monolayer wurden mit VACV infiziert und transfizierten 1 Stunde nach der Infektion mit drei Rekombinationsvektoren, die Homologiebereiche von entweder 500 bp, 100 bp oder 70 bp zum VACV-Genom enthielten. Jeder Vektor enthielt auch die TDS-Kassette, die gpt- und mCherry-Selektionsgene enthielt. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Infektion geborgen und lysiert, um die gebildeten rekombinanten Viren freizusetzen. Plaque-Assays wurden an Zelllysaten mit GPT-Auswahlmedien durchgeführt und Plaques, die mCherry Fluoreszenz zeigten, wurden als erfolgreiche Rekombinanten gezählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Abbildung 5. Karte des gpt-mCherry TDS-Vektors, der die Multiple-Klon-Site anzeigt. Der Vektor wurde zuvor22 beschrieben und die Vektorkarte wurde mit Hilfe von EZ Plasmid Map v1.9 von der Zhang Lab Group (SCU) erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

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Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Hier wird ein schnelles und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Impfstoffviren beschrieben, die fluoreszierend markierte Proteine gleichzeitig mit der Methode der transienten dominanten Selektion exezieren.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Aufrufe.  University of Sydney. Hier wird ein schnelles und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Impfstoffviren beschrieben, die fluoreszierend markierte Proteine gleichzeitig mit der Methode der transienten dominanten Selektion exezieren.

Serie: Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Finger-Stick Blutprobenentnahme Methodik zur Bestimmung der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...