Wir danken Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder in JCT und LM-S Laboratorien für die Entwicklung und Verbesserung der Arenavirus reversen Genetik Techniken und Plasmide. Wir danken auch Snezhana Dimitrova für technische Unterstützung. Der monoklonale Antikörper, der gegen JUNV NP (SA02-BG12) wurde von BEI Resources (NIAID Biodefense and Emerging Infektionen Research Resources Repository) erhalten. BYHC wurde von Grant Number GM068411 von Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award unterstützt. EO-R ist ein Fulbright-Conicyt (BIO 2008) und eine Rochester Vaccine Fellowship (2012) Empfänger. EO-R aktuellen Unterstützung wird durch ein Postdoc-Fellowship für Diversity &amp; Academic Excellence-vom Amt für Faculty Development &amp; Diversity an der Universität von Rochester zur Verfügung gestellt. Research in LM-S Labor wird durch die NIH Zuschüsse RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, die NIAID Centers of Excellence für Forschung und Influenza Surveillance (HHSN266200700008C) finanziert undDie University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C). Forschung an JCT Labor wurde durch Zuschüsse RO1 AI047140, RO1 AI077719 und RO1 AI079665 von NIH unterstützt.

1. Arenavirus Rettung Transfektion Unsere Rettungssystem auf der Verwendung beider Polymerase II-Protein-Expressionsplasmide Codieren des Nucleoprotein (NP) und RNA-abhängige RNA-Polymerase-(L), die viralen trans-wirkende Faktoren für die RNA-Replikation und Genexpression des Arenavirus Genoms erforderlich basierend 7, 19, und in der Lage, Plasmide intrazellulären Synthese über die zelluläre RNA-Polymerase I (Pol-I), der S-und L-Antigenom RNA-Spezies 7 leiten. In unseren Untersuchungen verwenden wir die pCAGGS Proteinexpression Plasmid, das das Huhn β-Actin-Promotor und polyadenylanation (pA) Signalsequenzen verwendet, und die menschliche pol-I-Plasmid, die den menschlichen Polymerase I verwendet Promotor und Terminator-Sequenzen der Maus (Abbildung 2) . Die S-und L-RNA-Segmente in das HPOL-I-Plasmid in einer antigenomische Orientierung für die Erzeugung von genomischer RNA-Segmente bei der Transkription von HPOL-I lassen kloniert. Für die Rettung von Wildtyp-type rekombinanten LCMV (rLCMV) und offenen # 1 (rCandid # 1) der pCAGGS NP und L von jedem Virus zusammen mit ihren jeweiligen menschlichen Pol-I S und L RNA-Segmente (3) co-transfiziert. Erzeugung von rekombinantem trisegmented LCMV (r3LCMV) und Candid # 1 (r3Candid # 1) folgte ein ähnliches Protokoll, aber die S-Segment wurde in zwei verschiedenen pol-I S Plasmide, die jeweils für ein unverwechselbares Reportergen aufgeteilt: in eine, die NP open reading Frame (ORF) wurde mit dem Green Fluorescent Protein (GFP)-Reportergen (HPOL-I S GFP / GP) und in der anderen, die virale Glycoprotein Vorstufe (GPC) ORF mit dem Gaussia Luciferase (Gluc) Reporter-Gen ersetzt ist (HPOL-I S NP / Gluc). Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 4 dargestellt. Die folgende Transfektion und Infektion Protokoll wurde für 6-well-Platten aufgebaut. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) Mischung: Bereiten Sie 250 ul OptiMEM Medien und jeauf das Virus zu retten, 10 - 12 ug LPF2000 (1 ug / ul) pro Transfektion (Tabelle 1). Ein Verhältnis von 2,5 ug LPF2000 pro ug DNA wird empfohlen. Inkubation für 5 - 10 min bei RT. Unterdessen bereiten die Plasmidtransfektion Mischung in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchens (Schritt 1.2). </li><li> Plasmid-DNA Transfektion Mischung: Bereiten Sie die Plasmidtransfektion Cocktail in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit den empfohlenen Mengen für jeden Virus Rettung (siehe Tabelle 1). Bringen Sie das Endvolumen auf 50 ul mit OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid Mischung: In 250 ul der OptiMEM-LPF2000 Mischung (Schritt 1.1) in das Plasmid DNA Transfektion Mischung (Schritt 1.2). Inkubieren dieser Mischung für 20 - 30 min bei RT. Unterdessen bereiten und zählen 1 x 10 6 Zellen pro Vero Transfektionsreaktion. Vero-Zellen in Suspension transfiziert werden. </li><li> Vorbereitung von Vero-Zellen: Vero cells werden in 100 mm Schalen kultiviert. Vor dem Start bringen 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS Medien und Trypsin-EDTA Gemisch auf 37 ° C. <ol><li> Waschen der Zellen zweimal mit 5 ml 1x PBS. </li><li> Trypsinize Zellen mit 1 ml Trypsin-EDTA und warten, bis die Zellen getrennt werden (ca. 5 min). Antippen vielleicht erforderlich, um vollständig lösen die Zellen von den Gerichten. </li><li> Vorsichtig die Zellen in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugation der Zellen 5 min bei 1000 rpm in einer Zentrifuge. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml DMEM-10% FBS 1% PS und Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und stellen Konzentration auf 1 x 10 6 Zellen / ml. Es wurde festgestellt, daß 0,5 - 1 x 10 6 Vero Zellen pro Transfektion wurden die besten Ergebnisse erzielt. </li></ol></li><li> Mix LPF2000/DNA und Zellen: Nach 20 - 30 min Inkubation bei Raumtemperatur (Schritt 1.3), 1 ml von Vero-Zellen (1 x 10 6) (Schritt 1.4) zudie OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid Mischung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Seed LPF2000/DNA-cell Mischung in 6-well-Platten: Fügen Sie die DNA-LPF2000-Vero Mischung (Schritt 1.5) in die Vertiefungen der 6-Well-Platte. Schütteln Sie die 6-well-Platte und lassen Sie die Transfektion Inkubation über Nacht im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern Transfektionsmedium: Etwa 16 - 24 h nach der Transfektion, entfernen Sie die Transfektion Medien, 2 ml Infektion Medien und Inkubation transfizierter Zellen für eine zusätzliche 48 Stunden. </li><li> Zellpassage: Nach 48 Stunden Inkubation in Medien Infektion, entfernen Sie die Gewebekulturüberstand (TCS) und passieren die transfizierten Zellen in einer 100 mm-Schale. Der TCS selten enthält infektiösen Virus, weil die transfizierten Zellen zusätzliche Inkubation müssen Viruspartikel zu generieren. Für die Zellpassage: <ol><li> Waschen der Zellen zweimal mit 2 ml 1x PBS. </li><li> Trypsinize Zellen w<html> it 0,5 ml Trypsin-EDTA und warten, bis die Zellen lösen. </li><li> Die Zellen in 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifugation der Zellen 5 min bei 5000 rpm, 4 ° C in einer Mikrozentrifuge. </li><li> Vorsichtig werden die Zellen in 1 ml einer Infektion Medien und die Übertragung der Zellen in einer 100 mm-Schale. Um das Gesamtvolumen in der Platte, mit infektiösen Medien bis 8 ml, ein ausreichendes Volumen, um die Trocknung der Zellen, sowie zum Konzentrieren des Virus zu verhindern. </li></ol></li><li> Schütteln Sie die 100 mm-Schale und setzen die Inkubation von Vero-Zellen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für 72 Stunden. </li><li> Sammlung von TCS: Nach 72-stündiger Inkubation, sammeln die TCS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation für 5 min bei 2500 rpm in einer Zentrifuge. Infektiöse Arenavirus im TCS gefunden wird, so von der Zelltrümmer Pellet Entfernung und Speicherung des TCS bei -80 ° C. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Bestätigung von rekombinanten Arenavirus Rettung Nachweis einer erfolgreichen Rettung von rLCMV und rCandid # 1 ist über dem Schwerpunkt bildende Einheit (FFU) Immunofluoreszenz-Assay (IFA) erreicht. Für Wildtyp-Virus Rettung verwenden wir spezifische Antikörper gegen das virale NP. Die r3LCMV und r3Candid Nr. 1 kodieren zwei Reportergene (GFP und Gluc), so dass virale Detektion und Titration ohne die Notwendigkeit von Antikörpern durch Fluoreszenzmikroskopie (GFP) und / oder Lumineszenz (Gluc). <ol><li> Bestätigen Wildtyp rekombinanten Arenavirus Rettung: Der Tag vor der Titration, waschen Vero-Zellen zweimal mit PBS, trypsinize und bereiten 96-Well-Platten bis 80 zu erreichen - 90% Zusammenfluss nächsten Tag (4 x 10 4 Zellen / well). Schütteln Sie die Platten von Hand auf einen uniformierten Verteilung der Zellen zu erhalten. Kultur die Zellen über Nacht in der 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht zu bestätigen, bevor mit der Infektion: <ol><li> Serienmäßig verdünnen (10 fache Verdünnungen) das Virus enthaltenden TCS erholte sich von den transfizierten Zellen in der 100-mm-Schale (Schritt 1.10) in OptiMEM. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus den gesäten Vero-Zellen, zweimal waschen mit 50 ul 1x PBS und infizieren Zellen mit 50 ul der seriell verdünnten Virus (Schritt 2.1). Infect Zellen für 1,5 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der Infektion, entfernen Sie die Virusinokulum, fügen Sie 100 ul Infektion Medien / well und Inkubation der Zellen für 16 - 18 Stunden. Viral Re-Infektion kann nach 18-stündiger Inkubation führen, was in Überschätzung der viralen Titer führen. </li><li> Bei 16 - 18 Stunden nach der Infektion, entfernen Sie den TCS aus jeder Vertiefung und fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd in 1x PBS verdünnt, für 15 min bei RT. </li><li> Dann entfernen Sie den Fixierungslösung und permeabilisieren die Zellen mit 0,1% Triton X-100 verdünnt in 1x PBS, für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie die Permeabilisierung Lösung, dann waschen Sie die Zellen 3 mal with 1x PBS. </li><li> Blockieren der Zellen mit 2,5% Rinderserum Albumin (BSA) in 1x PBS (Blockierungslösung) für 1 h bei RT. Alternativ können die Zellen über Nacht bei 4 ° C blockiert und weiterhin mit Antikörper-Inkubation des folgenden Tages. </li><li> Inzwischen bereitet die primären Antikörper. Verdünnen Sie die LCMV-und Candid # 1-spezifischen primären Antikörper in Blocking-Lösung und dann zentrifugiert den Antikörper / Blocking-Lösung für 15 min bei 3.500 Umdrehungen pro Minute. Der monoklonale anti-LCMV NP Antikörperklon 1.1.3 (1:30 Verdünnung) 16 und der monoklonale anti-NP JUNV Antikörper SA02-BG12 von BEI Ressourcen (1:500 Verdünnung) können für den Nachweis von rLCMV und rCandid Nr. 1 verwendet werden sind. </li><li> Nach einer 1-stündigen Inkubation absaugen Blocking-Lösung und 50 ul des primären Antikörpers an die Zellen und Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt verdünnen sekundären Antikörper in Blocking-Lösung, und dann zentrifugiert, die den Antikörper / Blockieren Lösung für 15 min bei 3.500 UpM. Das Polyklonalen Kaninchen-anti-Maus-IgG-FITC sekundären Antikörper für den Nachweis von primären monoklonalen Antikörper wurde verwendet, um Bilder in 5 beobachtet erhalten. </li><li> Nach 1 Stunde Inkubation absaugen primärer Antikörper, 3 x waschen mit 1x PBS, und fügen Sie die sekundären Antikörper für 30 min bei 37 ° C </li><li> Nach 30 min Inkubation absaugen sekundären Antikörper und waschen 3 mal mit 1x PBS. Die Zellen sind nun bereit, beobachtet werden mittels Fluoreszenzmikroskopie sowohl bestimmen den Erfolg von viralen Rettung und Titration durch Zählen der Schwerpunkt bildende Einheiten pro ml (FFU / ml). </li></ol></li><li> r3LCMV und r3Candid Nr. 1 virale Rettung: Da diese Viren zwei Reporter Gene exprimieren, rettet ihr kann durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden, um die GFP-Expression oder Gluc Ausdruck in TCS erkennen. Rettung kann auch durch die Expression von Gluc werden in TCS bestätigt. Um die trisegmented Viren titrieren, wir Schritte 2.1 bis 2.1.4 folgen, jedoch Zellen nicht zu b brauchene befestigt, um eine erfolgreiche virale Rettung, weil der GFP-Expression zu bestimmen. Die Titration des Virus wird durch Zählen der FFU / ml bestimmt werden. Um eine erfolgreiche virale Rettung durch Gluc Ausdruck, Gluc Ausdruck von TCS bestimmen kann unter Verwendung eines Gluc Assay-Kit (Biolux Gaussia Luciferase Assay Kit, New England Biolabs) werden. Zu diesem Zweck: <ol><li> Je 100 ul TCS in eine 96-Well-Platte, weiß (Flat Mikrotiterplatten, Fisher Scientific). </li><li> Richten Sie das Luminometer (LumiCount, Packard Biosciences). </li><li> In 50 - 100 ul Gluc Assay-Lösung (wie vom Hersteller empfohlen) zu jeder Probe und messen Sie die Gluc Reporter Genexpression mit dem Luminometer. Als Negativ-Kontrolle wurde Gluc Ausdruck des TCS von den Wildtyp-Viren infizierten Zellen gemessen. </li></ol></li></ol> 3. Passage von Gewebekulturüberstände Viral Rettung hängt Transfektionseffizienzen. Vero-Zellen wurde gezeigt,zu niedrigeren Transfektionseffizienzen als andere Zelllinien 14 haben. Wenn Virustiter in der TCS niedrig sind, infizieren frisch Vero-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 (LCMV) bzw. 0,1 (Candid # 1) für 72 Stunden, um das Virus zu verstärken.

<ol>
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Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken hat sich zu einem weit verbreiteten Ansatz zur Untersuchung der vielen verschiedenen Facetten der Arenavirus Biologie. Hier dokumentieren wir eine entscheidende Verbesserung des derzeitigen Systems durch Ausführen Arenavirus rettet in Vero-Zellen, so dass für das Potenzial Generation von FDA-zugelassenen Impfstoff-Kandidaten gegen Arenaviren und Vakzinvektoren gegen andere Infektionskrankheiten. <p class="jove_content"...

Arenaviren sind umhüllte Viren mit einem bisegmented negative RNA-Genom, dass 3 der Arenaviridae Familie gehören. Die Arenavirus Genom kodiert vier Proteine ​​in einer AmbiSense Mode aus zwei getrennten viralen Segmente 3. Der große (L)-Segment kodiert für das RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L) und die kleine RING (Really Interesting New Gene) finger protein (Z), die als die wichtigste treibende Kraft der Virusknospung dient. Die kleinen (S)-Segment kodiert für das virale nucleoprotein (NP) und die Oberflächen-Glykoprotein (GP) (Abbildung 1). Mehrere Mitglieder der Familie Arenaviridae sind verantwortlich für die tödlichen hämorrhagischen Fieber (HF) in Menschen 3. Grundsätzlich Bedenken sind Lassa-Virus (LASV) und Junín Virus (JUNV), die bekanntlich hohe Mortalität bei hospitalisierten Patienten 8, 9 verursachen. Obwohl diese Viren sind endemisch in Westafrika und ländlichen Argentinien, bzw.mehren sich die Bedenken der Einfuhr von LASV und JUNV zu nicht-endemischen Gebieten aufgrund der erhöhten Reise 10. Dazu kommt, obwohl in der Regel nicht mit einer schweren Krankheit in den Menschen verbunden sind, wird die prototypische Arenavirus lymphatischer Choriomeningitisvirus (LCMV) einen vernachlässigten Erreger gilt als es Fälle von tödlichen Infektionen bei immungeschwächten Patienten 6, 15 und ist verantwortlich für angeborene Missbildungen und Fehlgeburten bei schwangeren Frauen 2, 13. Derzeit gibt es keine FDA-zugelassenen Impfstoffe gegen Arenaviren und Behandlung der Nukleosid-Analogon Ribavirin, die nur teilweise wirksam ist und oft mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden ist, begrenzt. Die Einführung von Plasmid-basierte reverse genetics 4 und Erzeugung rekombinanter Arenaviren 7, 19 haben stark auf dem Gebiet der Forschung Arenavirus fortgeschritten. Derzeit werden Nagerzellen (wie BHK-21) für die Gener verwendetation von rekombinanten Arenaviren aufgrund der artspezifischen murine RNA-Polymerase I (pol-I) Promotor, der die anfängliche Transkription der S-und L-Segmente. Allerdings Virus Rettung in BHK-21-Zellen sind keine anerkannte Methode zur Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine Saatgut Kandidaten. Hier dokumentieren wir die Verwendung des menschlichen pol-I-Promotor für eine effiziente Rettung des prototypischen Alten Welt (OW) LCMV und der Neuen Welt (NW) JUNV Candid # 1-Stamm in Vero-Zellen. Mit einer ähnlichen Methode erzielten wir rekombinantes trisegmented LCMV (r3LCMV) und Candid # 1 (r3Candid # 1) Arenaviren, die zwei zusätzliche fremde Gene in zwei verschiedene S RNA Segmente 5 codiert enthalten. Dieses neue System nicht nur folgt eine hohe Reproduzierbarkeit und einfache Protokoll, sondern sofort in der Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine oder Impfvektor Samen eingeführt werden.

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 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material and methods</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
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 Cell lines 
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 &deg;C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). 
 
Plasmids 
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 &deg;C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 &deg;C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 &deg;C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. 
 
Viruses 
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. 
 
Tissue culture media and solutions 
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 &deg;C. This media will be used for maintenance of Vero cells. 
 
Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 &deg;C. This media will be used during viral infections. 
 
10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 &deg;C. This is used as a blocking solution for IFA.
</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

generation of recombinant arenavirus for vaccine development in fda-approved vero cells

Die Entwicklung und Umsetzung von Arenavirus reversen Genetik stellt einen bedeutenden Durchbruch in der Arenavirus Feld 4. Die Verwendung von zellbasierten Arenavirus Minigenom Systeme zusammen mit der Fähigkeit, rekombinante infektiöse Arenaviren mit vorgegebenen Mutationen in ihrem Genom erzeugen hat die Untersuchung der Beteiligung von viralen Faktoren zu den verschiedenen Stufen des Lebenszyklus Arenavirus sowie Virus-Wirt erleichtert Wechselwirkungen und Mechanismen der Pathogenese Arenavirus 1, 3, 11. Darüber hinaus hat die Entwicklung von trisegmented Arenaviren die Verwendung der Arenavirus Genom zusätzliche fremde Gene von Interesse exprimieren gestattet und eröffnet damit die Möglichkeit, Arenavirus basierender Impfstoff Vektor Anwendungen 5. Ebenso bietet die Entwicklung von Single-Cycle-infektiösen Arenaviren auszudrücken vermag Reportergene ein neues experimentelles Werkzeug, um die Sicherheit der Forschung mit highl verbesserny pathogenen menschlichen Arenaviren 16. Die Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken bislang auf die Verwendung von Nagetier-Zelllinien 7,19, die einige Hindernisse für die Entwicklung der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Impfstoff-oder Vakzinvektoren Posen verlassen. Um dieses Hindernis zu überwinden, beschreiben wir hier die effiziente Erzeugung von rekombinanten Arenaviren in FDA-zugelassenen Vero-Zellen.

Erfolgreiche Rettung eines rekombinanten Wildtyp Arenavirus wird durch das Vorhandensein von viralen Antigenen mit IFA (Fig. 5) bestätigt werden. Im Falle von rekombinanten Viren trisegmented können erfolgreiche virale Rettung durch Beobachtung GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie (6A) beurteilt werden. Erfolgreiche Rettung wird weiter durch die Beurteilung Gluc Ausdruck (6B) bestätigt werden. Repräsentative Ergebnisse, welche die erfolgreiche Rettung von W...

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Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe zur Bekämpfung von humanpathogenen Arenaviren.

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Aufrufe.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erze...

Serie: Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Hochempfindliches Verfahren zur Messung von Arenavirus-Zell-Anlage

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard manufacturing. To achieve an effective protein-based subunit vaccine, the protein antigen often needs to adopt a native-like conformation. This is particularly important for pathogen-surface antigens that are membrane-bound proteins. Cell-free methods have been successfully used to produce correctly folded functional membrane protein through the co-translation of nanolipoprotein particles (NLPs), commonly known as nanodiscs. 
This strategy can be used to produce subunit vaccines consisting of membrane proteins in a lipid-bound environment. However, cell-free protein production is often limited to small scale (&lt;1 mL). The amount of protein produced in small-scale production runs is usually sufficient for biochemical and biophysical studies. However, the cell-free process needs to be scaled up, optimized, and carefully tested to obtain enough protein for vaccine studies in animal models. Other processes involved in vaccine production, such as purification, adjuvant addition, and lyophilization, need to be optimized in parallel. This paper reports the development of a scaled-up protocol to express, purify, and formulate a membrane-bound protein subunit vaccine. 
Scaled-up cell-free reactions require optimization of plasmid concentrations and ratios when using multiple plasmid expression vectors, lipid selection, and adjuvant addition for high-level production of formulated nanolipoprotein particles. The method is demonstrated here with the expression of a chlamydial major outer membrane protein (MOMP) but may be widely applied to other membrane protein antigens. Antigen effectiveness can be evaluated in vivo through immunization studies to measure antibody production, as demonstrated here.

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

This protocol describes using commercial, cell-free protein expression kits to produce membrane proteins supported in nanodisc that can be used as antigens in subunit vaccines.

Zellfreie skalierte Produktion und adjuvante Zugabe zu einem rekombinanten Haupt-Außenmembranprotein aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung