Die Autoren danken George Farr und den Mitgliedern des Horwich-Labors für die hilfreichen Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom Howard Hughes Medical Institute unterstützt.

Die hier beschriebenen Verfahren für Anästhesie, Euthanasie und Herzdurchblutung von Mäusen wurden im Rahmen eines Protokolls durchgeführt, das vom Institutionellen Tierpflege- und Gebrauchsausschuss der Yale University genehmigt wurde.
1. Vorbereitung von RNase-freien Instrumenten und Lösungen
<ol><li>RNase ist eine häufige Verunreinigung aller Laboroberflächen, einschließlich Tischplatten, Mikropipetten und des Prüfers.<ol>
<li>Wechseln Sie die Handschuhe häufig oder regelmäßig mit einer RNAse-Dekontaminationslösung ab.</li>
		<li>Edelstahl-Sezierwerkzeuge und Glaswaren können Durch Erhitzen bei >200 °C für 1 Stunde oder mehr rNase-frei gemacht werden. Hinweis: Die Dampfsterilisation zerstört RNase nicht. Alternativ mit einer RNase-Dekontaminationslösung abwischen, dann mit RNase-freiem 70% Ethanol und lufttrocken.</li>
		<li>Wischen Sie Tischplatten, andere Laboroberflächen und Mikropipettoren mit RNase-Dekontaminationslösung, dann mit RNase-freiem 70% Ethanol. Legen Sie einen bestimmten Labortisch oder Arbeitsbereich für die RNA-Wiederherstellung und -Analyse fest. Hinweis: Entfernen Sie die Spitzenauswerfer, bevor Sie die Wellen der Pipettierer abwischen, und lassen Sie sie nach Möglichkeit ab.</li>
		<li>Verwenden Sie Rohre, Mikrozentrifugenrohre, Pipetten und Mikropipettenspitzen, die vom Hersteller als RNase-frei zertifiziert sind. Die Verwendung von sehr niedrigen Bindungsspitzen und Mikrorohren wird empfohlen. Verwenden Sie nach Möglichkeit frisch geöffnete Kisten oder Beutel dieser Komponenten und halten Sie sie von der allgemeinen Laborversorgung getrennt.</li>
		<li>Erhalten Sie RNase-freie Lösungen [Dulbeccos Calcium- und Magnesium-freies PBS (PBS), Ethanol, RNase-freies 70% Ethanol] aus kommerziellen Quellen. Verwenden Sie für jedes Experiment neu geöffnete Flaschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Quelle des Azure B-Farbstoffs ist entscheidend für die erfolgreiche Wiederherstellung intakter RNA. Testen Sie jede Charge Farbstoff, bevor Sie wertvolle Proben zur Färbung und Sammlung verpflichten. Sammeln Sie ein paar tausend Neuronen von einem nicht-experimentellen Tier, bereiten Sie RNA vor und bestimmen Sie die RNA-Integrität, wie unten beschrieben, um eine zu finden, die konsistent RIN-Zahlen über 8,5 produziert.<ol>
<li>Azure B-Farbstoff (1%, wt/vol) in RNase-freiem 70% Ethanol auflösen, typischerweise 0,3 g in 30 ml Ethanol in einem 50 ml Zentrifugenrohr. Mischen Sie gut auf einer Wippe bei RT über Nacht oder bis alle Partikel gelöst haben. Ein Rohr dieser Lösung kann verwendet werden, um mehrere Dias zu färben, ohne die Färbeintensität zu beeinflussen.</li>
		<li>Verwenden Sie vorsorglich für jede biologische Vermehrung ein anderes Fleckrohr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie die Kryomolde und O.C.T. zum Einbetten von Kabelabschnitten ohne weitere Behandlung.</li>
	<li>Halten Sie den Kryostat bei -20 bis -24 °C. Nach dem Schnitt die Dias in einen -80 °C-Gefrierschrank geben, bis eine ausreichende Anzahl vorbereitet ist. Beginnen Sie die RNA-Vorbereitung so schnell wie möglich, nachdem die Dias gemacht wurden. Für die Langzeitlagerung ungeschnittene oder teilweise geschnittene OCT-Blöcke statt Dias bei 80 °C aufbewahren.</li>
	<li>Machen Sie den Guanidin-Thiocyanat-Puffer für die RNA-Vorbereitung aus den sezierten motorischen Neuronen unter Verwendung der Vom Hersteller des RNA-Vorbereitungskits bereitgestellten Lösungen entsprechend seinen Anweisungen.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Rückenmarksabschnitten von Mäusen (Abbildung 1A)
<ol><li>Reinigen Sie alle Sezierwerkzeuge, Glasgletten, Rasierklingen und Sezierplattformen durch Backen oder Wischen mit RNase-Dekontaminationslösung, gefolgt von RNase-freiem 70% Ethanol. 2 min trocknen lassen. Halten Sie alles staubfrei, indem Sie es mit Labortüchern bedecken.</li>
	<li>Tierbehandlungsverfahren, einschließlich Anästhesie, Herzperfusion und Euthanasie, sollten gemäß den Anforderungen des lokalen institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung (IACUC) durchgeführt werden, mit dem Ziel, das Tier rasch an den Punkt der Rückenmarkssektion zu bringen.<ol>
<li>Anästhesisieren Sie die Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion einer tödlichen Dosis Ketamin (450 mg/kg).</li>
		<li>Sobald ein tiefes Maß an Anästhesie erreicht und durch das Fehlen einer Zehen-Pinch-Reaktion bestätigt wird, positionieren Sie die Maus-Ventralseite auf einer Sezierplattform (z. B. ein Styropor-Board), öffnen Sie die Brusthöhle, um das Herz freizulegen, und setzen Sie die 27 G Schmetterlingsnadel einer Infusion in den linken Ventrikel (die sich auf der rechten Seite des Prüfers befindet). Nick das rechte Atrium mit einer scharfen Zange, und perfuse mit PBS mit einer Rate von 5-7 ml/min für etwa 2 min mit einer peristaltischen Pumpe. Die aus dem Atrium strömende Flüssigkeit sollte an dieser Stelle weitgehend blutfrei sein.</li>
		<li>Entfernen Sie die Perfusionsnadel, enthaupten Sie die Maus, und drehen Sie sie auf der Sezierplatte um. Öffnen Sie die Haut, um die Wirbelsäule freizulegen, verwenden Sie eine kleine Schere und Zange, um die Wirbel zu entfernen, und heben Sie das Rückenmark heraus, während Sie die Nervenwurzeln mit einer scharfen Zange trennen. Schnelligkeit und Übung sind wichtig, um sich vom Beginn der Perfusion bis zur Entfernung der Schnur zu bewegen; dies sollte nicht mehr als 7 min dauern.</li>
		<li>Spülen Sie die Schnur für 10 Sek. in RNase-freiem Wasser, um Restblut abzuwaschen. Legen Sie das Rückenmark mit einer gekrümmten Zange sehr sanft, aber schnell auf eine RNase-freie Glasrutsche. Teilen Sie das Rückenmark quer mit einer sauberen Rasierklinge in 9-10 Stück.</li>
		<li>Legen Sie die Stücke mit den gleichen Zangen in ein mit O.C.T. gefülltes Kryomold und richten Sie sie vertikal mit einer sauberen Nadel aus. Legen Sie die Form in eine flache Schale mit 2-Methylbutan, das mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt ist, und legen Sie das Tablett dann in ein flüssiges Stickstoffbad, um die Rückenmarksstücke schnell einzufrieren, um einen RNA-Abbau zu vermeiden.</li>
		<li>Bewahren Sie den OCT-eingebetteten Block bis zu 6 Monate vor dem Schnitt bei -80 °C auf. Der Prozess vom Abruf der Schnur durch Einfrieren sollte innerhalb von 5 min durchgeführt werden, um die RNA-Integrität zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kryosektion des O.C.T.-eingebetteten Blocks bei -20 °C mit einem Kryostat, um 20 m Scheiben mit jeweils 9-10 Rückenmarksquerschnitten auf RNase-freien PEN-Membran-2-m-Dias zu erzeugen, die zunächst bei Raumtemperatur gehalten werden, um sicherzustellen, dass die Abschnitte am Schlitten haften. Den Abschnitt sofort auf einer -20 °C-Oberfläche im Inneren des Kryostats wieder einfrieren. Halten Sie die Dias bei -80 °C, bis sie verwendet werden.</li>
</ol>3. Färbung von Rückenmarksabschnitten (Abbildung 1A)
<ol><li>Auf einem sauberen Rack sechs 50 ml konische Schläuche anordnen. Füllen Sie sie alle mit 25-30 ml RNase-freiem 70% Ethanol, so dass die Tiefe ausreicht, um alle Abschnitte auf einem Dia abzudecken, wenn die Folie eingetaucht wird. Machen Sie 30-35 ml 1% Azure B-Lösung, wie zuvor beschrieben, und halten Sie es auf dem gleichen Rack, um die Zeit zwischen dem Wechsel von Lösungen während des Waschens oder Färbens zu minimieren. Bewahren Sie drei oder vier Labortücher vor dem Rack auf, um die zusätzliche Lösung schnell zu entleeren.</li>
	<li>Die Rutschen aus dem -80 °C-Gefrierschrank auf Trockeneis bringen. Tauen Sie eine Rutsche, indem Sie sie auf eine geliebte Handfläche legen. Entfernen Sie den größten Teil der Feuchtigkeit und Kondensation auf der Folie, indem Sie sie mit einem Laborwisch abwischen, wobei Sie darauf achten, die Abschnitte nicht zu berühren. Die Rutsche auf frischekieselige Gel-Trockenmittel in eine Petrischale für 30-40 Sek. zum vollständigen Trocknen geben. Wenn die Luftfeuchtigkeit im Labor hoch ist, kann eine kurze Behandlung in einem Vakuum-Dessikator verwendet werden, um den Schlitten schneller zu trocknen.</li>
	<li>Waschen und Färben.<ol>
<li>Tauchen Sie das getrocknete Dia in die erste Röhre von RNase-freiem 70% Ethanol. Die Folie 30 Sek. einweichen und dann das OK waschen, um es zu entfernen, indem Sie es 45-60 Sek. nach oben und unten tauchen. Nehmen Sie die Rutsche aus der Lösung und entleeren Sie die überschüssige Flüssigkeit auf Labortücher. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang, indem Sie den Schlitten in die zweite Röhre mit 70% Ethanol tauchen. Wenn das OCT um die Rückenmarksabschnitte nicht vollständig verschwunden ist, wiederholen Sie die Wäsche im dritten Rohr.</li>
		<li>Nach dem Ablassen der überschüssigen Flüssigkeit, tauchen Sie die Folie in 1% Azure B-Lösung in 70% RNase-freies Ethanol für 30-45 Sek. Entleeren Sie den überschüssigen Azure B auf einem Lab-Wischvorgang; an dieser Stelle wird die gesamte Folie blau sein.</li>
		<li>Tauchen Sie die Rutsche in der nächsten Röhre von 70% Ethanol, und tauchen Sie schnell auf und ab 3-4x, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und die spezifische motorische Neuronfärbung sichtbar zu machen. Wenn die Abschnitte sehr dunkel gefärbt aussehen, wiederholen Sie den Entsalzungsschritt in einem frischen Rohr mit 70% Ethanol. Wenn die Färbung zu leicht erscheint, kehren Sie die Folie für weitere 30 Sek. zur Azure B-Lösung zurück, und wiederholen Sie die Detainierung. Wischen Sie das überschüssige Ethanol ab und trocknen Sie den Schlitten 40 Sek. lang an der Luft, bis die gesamte Flüssigkeit weg ist. Die graue Materie wird hellblau sein, während die motorischen Neuronen tiefblau gefärbt werden, was gut sichtbar ist. Starten Sie die Sezierung sofort.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Laser Capture Microdissection (LMD) (Abbildung 1B)
<ol><li>Schalten Sie das Mikroskop ein und entladen Sie den Rohrhalter, um die Kappe eines 0,6 ml Mikrofuge-Rohrs für die Probenentnahme zu befestigen. Legen Sie 30 l Guanidinthiocyanat-Lysepuffer in die Kappe eines 0,6 ml Mikrofuge-Röhrchens. Bedecken Sie die Oberfläche der Kappe mit Flüssigkeit, indem Sie die Lösung mit einer Pipettenspitze verteilen. Auf diese Weise werden alle gesammelten Neuronen in löslicher Lösung gelöst, wie sie seziert werden. Richten Sie die Kappe mit dem Loch und das Objektiv mit der Mikroskop-Software aus. Halten Sie die Kappe in der abgedeckten Position, bis Sie mit der Laseraufnahme beginnen.</li>
	<li>Stellen Sie den luftgetrockneten Schlitten auf die Bühne des LMD-Mikroskops auf den Kopf, so dass die Membran des PEN-Dias nach unten zeigt. Die Membran mit Abschnitten sollte dem Loch gegenüberstehen, darunter das Sammelrohr.</li>
	<li>Schalten Sie den Laser 10 min ein, bevor Sie mit der Folienvorbereitung beginnen. Konzentrieren Sie sich auf einen Rückenmarksabschnitt mit dem 5X Objektiv. Wechseln Sie zum 20X-Ziel für die Zerlegung.<ol>
<li>Markieren Sie einen "dummen" Bereich mit dem Lichtstift und lassen Sie den Laser ausschneiden, ohne ihn zu sammeln. Dies entspannt die PEN-Membran und ermöglicht es, mehrere Regionen nacheinander zu markieren und zu schneiden.</li>
		<li>Neuausrichtung und Identifizierung von motorischen Neuronen im ventralen Hornbereich. Diese Neuronen sind erkennbar an ihrer Lage, ihrer pyramidenförmigen Morphologie, ihrer Größe und ihrer dunkelblauen Färbung mit Azure B (Abbildung 2).</li>
		<li>Wählen Sie mit dem Lichtstift das Zeichenwerkzeug aus und markieren Sie am Rand der Motorneuronen, um einen vollständigen Umriss zu erstellen. Versuchen Sie, die Umrisse so nah wie möglich an das motorische Neuron zu bringen, um eine Kontamination durch andere Zellen als das motorische Neuron zu vermeiden. (Testen Sie einige Abschnitte im Voraus, um zu sehen, wie breit die Laser-Cut-Line ist, und passen Sie den Abstand nach Bedarf an.) Markieren Sie mehrere Zellen vor dem Schneiden; die Software wird sich die Positionen merken.</li>
		<li>Bringen Sie die Kappe unter die Schnittposition, indem Sie auf die Kappenposition klicken. Klicken Sie auf die Starttaste, um die motorische Neuronensektion mit dem Laser zu initiieren. Sammeln Sie alle motorischen Neuronen aus allen Abschnitten auf einem Dia in die Kappe eines Mikrofugerohrs.</li>
		<li>Nach der Abholung nehmen Sie das Mikrofugenrohr aus dem Halter, indem Sie das Fach entladen und das Rohr vorsichtig auslagern. Lösen Sie die Motorneuronen im Puffer vollständig auf, indem Sie die Lösung nach oben und unten pfeifen. Bewegen Sie die Lösung in den Körper des Rohres durch Zentrifugieren bei 14.000 x g für 2 min bei 4 °C. Die Probe sofort in Trockeneis einfrieren und bei -80 °C aufbewahren. Dieser Prozess, von der Gleitfärbung bis zur motorischen Neuronensammlung, sollte innerhalb von 30 min für einen Dia durchgeführt werden, um den RNA-Abbau zu minimieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA-Vorbereitung aus Motorneuronen
Alle gesammelten Neuronen eines Tieres auftauen und bündeln sie zusammen, um RNA zu extrahieren. Die Proben können hellblau aussehen, abhängig von der Anzahl der Motorneuronen (mit Azure B) darin. Extrahieren Sie RNA mit einem geeigneten Kit nach dem Protokoll für LMD-Gewebe vorgesehen, Eluing in dem minimalen Volumen möglich. Nehmen Sie 1 l, um die Menge und Integrität der Probe zu überprüfen. Die restliche RNA auf Trockeneis schnell einfrieren und bei -80 °C lagern.
6. Bestimmung der RNA-Qualität und -Menge
Bestimmen Sie die RNA-Qualität mit der 1-l-Probe auf einem kapillaren Elektrophorese-Mikrofluidik-Chip gemäß dem Herstellerprotokoll. Für RNA-seq und qRT-PCR können insgesamt RNA-Präparate mit einer RNA-Integritätsnummer (RIN) über 8,5 verwendet werden. Die Datenausgabe umfasst in der Regel auch die ungefähre Konzentration der Stichprobe.

<ol>
	<li>Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+proteomic+profiling+of+frozen+pancreatic+CD24++adenocarcinoma+tissues+by+immuno-laser+capture+microdissection+and+nano-LC-MS/MS.">Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS.</a> J. Proteome. Res. , (2013).</li><li>Bandyopadhyay, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+profiling+of+spinal+cord+motor+neurons+from+a+presymptomatic+SOD1+ALS+mouse..">RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse..</a> PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).</li><li>Shea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+cytophotometric+estimation+of+absolute+amount+of+ribonucleic+acid+using+azure+B1.">A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1.</a> J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol. Biol. 7, (2006).</li><li>Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+RNA+in+Pick's+and+Alzheimer's+diseases.+Comparison+of+disease-susceptible+and+disease-resistant+cortical+areas.">Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas.</a> Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).</li><li>Lobsiger, C. S., Boill&#233;e, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+from+different+SOD1+mutants+dysregulates+the+complement+system+and+the+neuronal+regenerative+response+in+ALS+motor+neurons.">Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+cellular+pathways+involved+in+the+adaptation+to+and+progression+of+motor+neuron+injury+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+familial+ALS.">Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS.</a> J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).</li><li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+laser+microdissection+of+human+pancreatic+islets+from+surgical+specimens.">Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens.</a> J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).</li><li>Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+immunolabeled+astrocytes+allows+quantification+of+astrocytic+gene+expression.">Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression.</a> J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+aggregation+despite+chaperone+associations+of+a+mutant+SOD1-YFP+in+transgenic+mice+that+develop+ALS.">Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das bedeutendste Erfolgsmaß dieses Protokolls zur Herstellung von Gesamt-RNA durch Lasermikrodissektion von Rückenmarksscheiben ist der RIN-Wert5. Bei RNA-Proben aus höheren Eukaryoten liefern Werte über 8,5 regelmäßig qualitativ hochwertige Sequenzierungs- und qRT-PCR-Daten. Wenn die Ausbeute gering ist, aber die Qualität hoch ist, wiederholen Sie die Zubereitung. Wenn die Integrität niedriger ist (auch 7,5-8), ist es jedoch besser, die Ursache des Problems zu finden und es erneut zu versuchen. Es gibt viele Schritte, bei denen etwas schief gehen kann, aber wirklich nur zwei Ursachen des Problems - die endogene RNase-Kontamination oder die exogene RNase-Kontamination. Die erste kann durch die Praxis angegangen werden, so dass die Zeit vom Opfer der Maus bis zum Einfrieren der O.C.T-eingebetteten Schnur minimiert wird. Der andere Punkt im Protokoll, bei dem endogene RNase zu einem schlechten Ergebnis beitragen kann, ist die Vorbereitung der Scheiben. Jede Scheibe sollte schnell an einem PEN-Schiebeschlitten haften, aber es schmilzt (das O.C.T wird klar). Je schneller die Scheibe eingefroren werden kann, desto besser. Der Kryostat, den wir verwenden, hat flache Oberflächen in der Kammer, die bei -20 °C liegen, die wir verwenden, um die Scheibe schnell wieder einzufrieren. Finden Sie eine ähnliche Stelle in der kryostat verwendet und stellen Sie sicher, dass die Scheibe schnell wieder undurchsichtig wird.
Das Aufspüren von Quellen exogener RNase kann schwierig sein, weil es so viele Möglichkeiten gibt. Die einzigen Reagenzien, die nicht ausdrücklich RNase-frei sind, sind O.C.T. und Azure B. Wenn Azure B zuvor zufriedenstellend abgeschnitten hat, probieren Sie eine frische Flasche O.C.T. aus, obwohl dieses Reagenz nie ein Problem war. RNasefreie Reagenzien können auch von einem anderen Lieferanten ersetzt werden. Eine viel wahrscheinlichere Quelle ist der Ermittler. Neben einer gründlichen Bereinigung des Arbeitsbereichs ist es oft sinnvoll, dass ein anderes Labormitglied mitverfolgt und alle Schritte im Verfahren beobachtet. Selbst wenn dies jemand ist, der dieses Verfahren nicht routinemäßig durchführt, kann ein neuer Satz von Augen eine ansonsten unbemerkte Quelle der Kontamination aufnehmen.
Die Ausweitung dieses Protokolls auf die Wiederherstellung von RNA aus anderen Rückenmarkszellen, von Rückenmarkszellen anderer Arten oder von bestimmten Zelltypen in anderen Organen erfordert Änderungen in mehreren Bereichen, die darauf ausgerichtet sind, eine klare Identifizierung der gefährdeten Zellen zu erreichen, während die Auswirkungen der endogenen RNase verhindert oder zumindest minimiert werden. Im Protokoll hier ermöglichte das schnelle Entfernen und Einfrieren der Schnur, gekoppelt mit Azure B Färbung in 70% Ethanol, sowohl die Minimierung des RNA-Abbaus als auch die einfache Identifizierung von motorischen Neuronenkörpern. Azure B ist ein etablierter histochemischer Fleck für Neuronen, der an RNA3 zu binden scheint und zur Bewertung des RNA-Gehalts von Neuronen in Autopsieproben von Hirngewebe von Patienten mit neurodegenerativer Erkrankung6verwendet wurde. Insbesondere hat die Azure B-Färbung weder die Integrität der gereinigten RNA noch ihre Fähigkeit, umgekehrt transkribiert und analysiert zu werden, beeinträchtigt. Andere Farbstoffe, wie Cresylviolett7 und Toluidin blau8 wurden in ähnlichen LMD-Protokollen verwendet. Das Sammeln der Zellkörper direkt in Guanidin-Thiocyanat-Lösung, wie sie seziert wurden, lieferte den letzten Schritt, der in der routinemäßigen Wiederherstellung von intakter RNA führte.
Ähnliche Ansätze können für andere Zellen und Organe vorgesehen werden, wobei anerkannt wird, dass die Identifizierung der von Interesse sindden Zellen bei gleichzeitiger Minimierung oder vorzugsweise Verhinderung des RNA-Abbaus durch endogene RNasen die entscheidende Voraussetzung für eine erfolgreiche Analyse ist. In Geweben mit hohem RNase-Gehalt, wie Bauchspeicheldrüse, schnelle Handhabung und niedrige Temperatur wurden kombiniert, um die Rückgewinnung von RNA aus β-Zellen zu ermöglichen, unter Ausnutzung ihrer natürlichen Autofluoreszenz für die Visualisierung9. Verfahren mit Antikörperfärbung zur Identifizierung wurden ebenfalls10berichtet, waren aber in unseren Händen nicht vollständig erfolgreich. Schließlich stehen viele Mausmodelle zur Verfügung, die fluoreszierende Fusionsproteine(z. B. GFP, YFP, RFP) in von Interesse beauftragenden Zellen ausdrücken, die verwendet werden könnten, um sie in Gewebeabschnitten auf dem LMD-Mikroskop zu identifizieren. In der Tat, die Maus Stämme, die wir mit diesem Protokoll analysiert haben, drücken ein Fusionsprotein zwischen SOD1 und YFP11aus, und ihre Spinalmark-Motorneuronen sind hochfluoreszierend. Wir waren jedoch nicht in der Lage, eine Reihe von Ethanolspülungen und/oder Dehydrierungsbedingungen zu finden, die gleichzeitig die O.C.T. entfernen, die RNase-Aktivität hemmen und konsequent eine ausreichende YFP-Fluoreszenz beibehalten würden, um eine Visualisierung der motorischen Neuronen und ihre Erholung durch LMD zu ermöglichen. Vielleicht kann ein neues fluoreszierendes Protein oder eine Variante der verfügbaren, die die Fluoreszenz in organischen Lösungsmitteln aufrechterhält, gefunden werden, um diese Einschränkung zu überwinden.

In Säugetiergeweben, die aus mehreren verschiedenen Zelltypen bestehen, hat das Aufkommen der Lasercapture Microdissection (LMD)-Instrumentierung die Möglichkeit, einen bestimmten Zelltyp für die Analyse auf RNA- oder Proteinebene auszuwählen. Derzeit ermöglichen Amplifikations- und Next-Gen-Sequenzierungstechniken die Verwendung eines Pools von RNA insgesamt aus einigen tausend Zellen, um eine relativ gründliche Bestandsaufnahme des Transkriptoms zu erhalten, einschließlich der Bewertung der relativen Konzentrationen von RNAs und der Identifizierung verschiedener gespleißter Formen. Bis heute werden Proteomik-Analysen von ein paar tausend Zellen nur durch mehr reichliche Arten reichen. Zum Beispiel haben wir <1.000 der am häufigsten vorkommenden Proteine aus 3.000-4.000 motorischen Neuronenkörpern identifiziert (nicht gezeigt), und Zhu und Kollegen haben kürzlich berichtet, dass sie 2.665 Proteine aus 15.000 Tumorzellen1identifiziert haben. Mit der weiteren Entwicklung der Massenspektrometrie ist es jedoch wahrscheinlich, dass sich solche Analysen bis weit in die Tiefe ausdehnen werden.
Hier stellen wir ein spezifisches Protokoll für LMD von motorischen Neuronenzellkörpern aus dem Rückenmark von Mäusen vor, gefolgt von der Vorbereitung von RNA. Dieses Protokoll wurde im Zusammenhang mit dem Vergleich von RNAs aus motorischen Neuronen präsymptomatischer transgener mutagener Superoxiddismutase (SOD)1 amyotrophe Lateralsklerose (ALS)-Mäuse mit RNAs verwendet, die aus einem wildtypen SOD1-Transgenstamm sowohl durch RNA-seq- als auch durch qRT-PCR-Validierung2hergestellt wurden. Insbesondere machen motorische Neuronen im vorderen Horn der grauen Substanz im Rückenmark <10% der gesamten Zellpopulation aus, umgeben von einem Meer von Astrozyten, und als solches lässt sich ihr Transkriptionsprofil nicht ohne weiteres aus Studien der gesamten Schnur entkrüsten. Ein Laser-Capture-Ansatz ist daher ideal für die Analyse der RNA-Expression in diesen Zellen, wobei die Physiologie durch schnelles Aus- und Einfrieren der Schnur nach kurzer intrakardialer Saline-Perfusion erhalten bleibt. Motorneuron somata sind groß und sind daher leicht nachweisbar, hier mit einem Farbstoff, der eine starke Affinität zu Neuronenhat 3. Darüber hinaus bieten diese Zellen bei einer solchen Größe eine relativ große Menge an RNA pro erfasster Zelle. Das verfahren, wie unten beschrieben, könnte leicht angepasst werden, um andere neuronale Zelltypen sowie potenziell andere Zelltypen zu erhalten, die speziell entweder durch Farbstofffärbungstechniken oder durch Antikörperfärbung identifiziert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Ketamine</td>
			<td style="width:195px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:155px;">26637041101</td>
			<td style="width:339px;">Any source approved by the institutional veterinary service</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Dissection tools (scissors, forceps,&#160;etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Any convenient source of high-quality dissection instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryostat&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:339px;">Other cryostats should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">LMD6000 B</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Other LMD systems have not been tested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase-free PEN-membrane 2 &#956;m slides&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>11505189</td>
			<td style="width:339px;">Other slide types have been tested and do not perform well</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:268px;">RNeasy Micro kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td style="width:339px;">Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Agilent 2100 BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Azure B Certified&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190520</td>
			<td style="width:339px;">Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">PBS</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>D8537</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source of RNase-free PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB04010-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02128-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase AWAY</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10328-011</td>
			<td style="width:339px;">Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">2-Methylbutane&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td style="width:339px;">Any source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen&#160;</td>
			<td>311-03-051 &#38; 311-09-051</td>
			<td style="width:339px;">Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer&#39;s products before using</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">O.C.T. Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryomold Intermediate Size</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Lab wipes (Kimwipes)</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection

Die Herstellung hochwertiger RNA aus von Interesse entosteilen Zellen ist entscheidend für eine präzise und aussagekräftige Analyse der Transkriptionsunterschiede zwischen Zelltypen oder zwischen demselben Zelltyp in Gesundheit und Krankheit oder nach pharmakologischen Behandlungen. Im Rückenmark wird eine solche Vorbereitung aus motorischen Neuronen, dem Ziel von Interesse an vielen neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen, durch die Tatsache erschwert, dass motorische Neuronen <10% der gesamten Zellpopulation ausmachen. Lasercapture Microdissection (LMD) wurde entwickelt, um dieses Problem zu lösen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Wiederherstellung, Einfrierung und Schnittmaus Rückenmarks, um RNA-Schäden durch endogene und exogene RNasen zu vermeiden, gefolgt von Färbung mit Azure B in 70% Ethanol, um die motorischen Neuronen zu identifizieren, während endogene RNase gehemmt. LMD wird dann verwendet, um die gefärbten Neuronen direkt in Guanidin-Thiocyanat-Lyse-Puffer zu erfassen, die Integrität der RNA zu erhalten. Standardtechniken werden verwendet, um die gesamte RNA zurückzugewinnen und ihre Integrität zu messen. Dieses Material kann dann für die nachgelagerte Analyse der Transkripte durch RNA-seq und qRT-PCR verwendet werden.

Das oben und in Abbildung 1 beschriebene Protokoll sollte 50 ng oder mehr der gesamten RNA mit einer RIN von >8,5 von 3.000-4.000 Spinalmarkmotor-Neuronenkörpern erzeugen, die aus den 9-10 20-m-Scheiben auf etwa 20 PEN-Dias seziert werden. Da diese Anzahl von Dias weniger als 10% eines O.C.T.-eingebetteten Blocks eines Mausrückenmarks darstellt, ist es möglich, zum Block zurückzukehren, der bei -80 °C gespeichert wurde, und mehr Scheiben zu schneiden, um eine weitere Runde der RNA-Vorbereitung zu durchlaufen. Wenn größere Mengen rna für eine Analyse benötigt werden, ist es besser, nur die Anzahl der Dias(z.B. 20) gleichzeitig zu machen, die durch Sezieren und RNA-Vorbereitung in wenigen Tagen verarbeitet werden können, dann mehr Dias für eine zweite Runde zu machen und die Produkte zu kombinieren. Achten Sie darauf, die RIN jeder Zubereitung zuerst zu überprüfen, um zu vermeiden, dass eine gute mit einer schlechten kombiniert wird. RNA-seq-Methoden werden immer empfindlicher und neue PCR-Technologien versprechen eine höhere Empfindlichkeit als aktuelle. Daher wird weniger RNA aus weniger Neuronenkörpern benötigt, was eine höhere Sequenzierungstiefe und eine umfassendere Validierung interessanter Treffer ermöglicht. Andererseits kann die vollständige Einhaltung der MIQE-Empfehlungen für die qRT-PCR-Analyse und Validierung4 größere Mengen erfordern, um die notwendigen Kontrollreaktionen für RNAs mit geringer Häufigkeit zu ermöglichen.
Abbildung 2 zeigt eine typische Serie von Bildern eines Teils eines Spinalband-Ventralhornabschnitts nach Azure B-Färbung und -Sektion. In Panel A sind die großen, dunkel gefärbten Zellkörper motorische Neuronen, die durch Anti-Chat-Antikörperfärbung2bestätigt werden und leicht von kleineren benachbarten Zellen unterschieden werden können. Panel B zeigt den gleichen Bereich mit einzelnen Zellkörpern, die mit dem Lichtstift umrissen und von der Mikroskopsoftware nummeriert werden. Die Umrisse folgen genau den Rändern der Zellkörper, mit einer kleinen Zugabe für die Schnittbreite des Lasers. Dieser Abstand muss für jede Laserleistungseinstellung festgelegt werden, um die Aufnahme von Fremdmaterial zu minimieren und gleichzeitig den Verlust des motorischen Neuronzytosols zu vermeiden. Die Panels C und D zeigen den Abschnitt nach dem Laserschnitt und die einzelnen Zellkörper sind in die Sammelkappe gefallen. Beachten Sie, dass die Schnittmarge nicht genau der Lichtstiftumrisslinie in Panel C folgt, sondern weitgehend außerhalb davon bleibt. Diese Unregelmäßigkeit zeigt sich in Panel D ebenso wie der abgedunkelte Bereich um jeden Schnitt, der die durch den Laser verursachten Wärmeschäden am Gewebe widerspiegelt. Aus diesem Grund, wenn zwei Zellkörper sehr nah beieinander sind, ist es besser, sie für einen einzigen Schnitt zu skizzieren, anstatt zu versuchen, sie getrennt zu schneiden und etwas RNA zu verlieren, um Schäden an ihrer Region des Nahkontakts zu verursachen.
Abbildung 3 zeigt typische Ergebnisse einer elektrophoretischen Analyse der RNA-Integrität einer RNA-Probe, die aus 4.000 Mausmotor-Neuronenkörpern hergestellt wurde, die von LMD gesammelt wurden. Das obere Panel ist das Elektropherogramm, das von 1 l der gesamten RNA erzeugt wird; der Einset auf der rechten Seite ist ein Bild des Gels. Beachten Sie in beiden die markanten ribosomalen RNA-Spitzen. Die untere Platte ist das Elektropherogramm der Spur, die RNA-Größenstandards enthält. Die Analysesoftware berechnete für diese Probe eine RIN von 9,8 mit einer Konzentration von 4,9 ng/l. Nach der Analyse standen insgesamt 13 l dieser Lösung zur Verfügung, die 64 ng RNA für die nachgeschaltete qRT-PCR-Validierung von Transkriptsmengen bereitstellte. Für eine typische qRT-PCR-Analyse von mäßig reichlich Entrunter Transkripten reicht 0,15-0,20 ng der gesamten RNA aus, um eine genaue Quantifizierung2zu erzeugen, so dass die Menge an RNA, die aus dieser Zubereitung zur Verfügung steht, ausreicht, um eine Reihe von Transkripten mit mehreren Primersätzen zu validieren, wieempfohlen 4. Natürlich können größere Mengen an Input-RNA verwendet werden, um die Validierung seltener Transkripte zu ermöglichen. Dieser Betrag ist auch mehr als ausreichend, um die Bibliotheksvorbereitung und die RNA-Seq der nächsten Generation zu ermöglichen.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1.jpg"> Abbildung 1. Überblick über die Herstellung von Rückenmarksscheiben und die Lasererfassungsmikrodissektion von Spinalmarkmotor-Neuronenkörpern. A) Wichtige Schritte in der Scheibenproduktion und Färbung. B) Cartoon-Ansicht des Rückenmarksabschnitts und der Lasersektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2.jpg"> Abbildung 2. Vorher-Nachher-Bilder einer Lasersektion von Azure B-gefärbten motorischen Neuronenkörpern. A) Ein Teil des ventralen Horns eines gebeizten Abschnitts. Beachten Sie die vier großen, dunkel gefärbten Zellen. Es gibt auch ein paar leicht gefärbte und etwas kleinere Zellen, die keine motorischen Neuronen sind (bestätigt durch Anti-Chat-Antikörperfärbung; nicht gezeigt, aber siehe Bandyopadhyay2) und die nicht für die Zerlegung ausgewählt werden. Die vielen kleinen, dunklen Flecken sind wahrscheinlich neuronale Prozesse (Dendriten und Axone), aber dies wurde nicht bestätigt. B) Die vier Zellkörper, die mit dem Lichtstift umrissen sind. Beachten Sie, dass die Umrisse den Rändern der Zellen mit einem Mindestabstand zwischen ihnen genau folgen. Dieser Abstand sollte empirisch für jedes Mikroskop und jeden Laser festgelegt werden. Die Software nummeriert die einzelnen Neuronen, was das Nachverfolgen der gesammelten Mengen vereinfacht. C und D) Nachdem der Laser geschnitten hat und die Stücke, die die Zellkörper enthalten, in die Sammelkappe gefallen sind. Beachten Sie, dass das zurückgelassene Loch etwas größer als die Umrisse ist und unregelmäßig ist. Dies spiegelt die Breite des Laserstrahls und seine leicht variable Schnitteffizienz in Abhängigkeit von der lokalen Zusammensetzung des Gewebes wider. Offensichtlich ist auch der Rand des abgedunkelten Gewebes, das jedes Loch aufgrund lokaler Heizschäden durch den Laser umgibt. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3.jpg"> Abbildung 3. Elektrophoretische Analyse der Integrität von RNA, die aus LMD-Proben hergestellt wird. A) Ein 1-l-Aliquot der RNA, die aus 4.000 motorischen Neuronenkörpern nach dem obigen Protokoll hergestellt wurde, wurde durch mikrokapillare Elektrophorese auf einem mikrofluidischen Chip analysiert. Das Elektropherogramm wird mit markanten ribosomalen RNA-Spitzen gezeigt. Auf der rechten Seite ist ein Bild des Gels selbst. B) Das Elektropherogramm der Größennormen wird mit der entsprechenden Gelspur rechts angezeigt. Die Instrumentensoftware berechnete für diese Probe eine RIN von 9,8 und eine Konzentration von 4,9 ng/l. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

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Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Hochwertige Gesamt-RNA wurde aus Zellkörpern von Maus-Spinalmark-Motorneuronen mittels Lasercapture-Mikrodissektion hergestellt, nachdem Rückenmarksabschnitte mit Azure B in 70% Ethanol gefärbt wurden. Ausreichende RNA (ca. 40-60 ng) wird aus 3.000-4.000 motorischen Neuronen zurückgewonnen, um eine nachgeschaltete RNA-Analyse durch RNA-seq und qRT-PCR zu ermöglichen.

Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Aufrufe.  Yale School of Medicine. Hochwertige Gesamt-RNA wurde aus Zellkörpern von Maus-Spinalmark-Motorneuronen mittels Lasercapture-Mikrodissektion hergestellt, nachdem Rückenmarksabschnitte mit Azure B in 70% Ethanol gefärbt wurden. Ausreichende RNA (ca. 40-60 ng) wird aus 3.000-4.000 motorischen Neuronen zurückgewonnen, um eine nachgeschaltete RNA-Analyse durch RNA-seq und qRT-PCR zu ermöglichen.

Serie: Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Die Reaktionen von Motoneuronen auf die Stimulation des Rückenmarks verstehen

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

Author Spotlight: Advancing Spinal Cord Stimulation - Erforschung der zellulären Reaktionen von Motoneuronen durch Patch-Clamp-Elektrophysiologie 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

Die Ex vivo Präparation eines Rückenmarksschnitts für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in Motoneuronen während der Rückenmarkstimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...