Wir danken Drs. Yuh-Nung Jan und Wes Grueber für die Bereitstellung von fly Aktien in dieser Studie verwendet wird, und Virginia Espina, Dr. Emanuel Petricoin und Dr. Lance Liotta für die Unterstützung bei LCM. Die Autoren danken Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust für die Unterstützung dieser Forschung (DNC) und der George Mason University Provost s Office (EPRI).

Allgemeine Bemerkungen zum LCM von Drosophila peripheren Neuronen Allow from 6 Stunden, bis zu einer Woche oder länger für LCM je nach Gewebetyp und die Anzahl der Zellen erforderlich. Alle Verfahren sind in streng RNase-freien Bedingungen gemäß Standardverfahren durchgeführt. Larven, die entweder 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP oder ppk-GAL4, UAS-mCD8:: GFP transgenen Reporter Linien wurden für diese Experimente verwendet. 1. Vorbereitung der Larven <ol><li> Sammeln 30-40 gleichaltrigen dritten Larvenstadium und waschen Sie sie in ddH 2 O, gefolgt von kurzen Spülen in RNAse Away (Sigma-Aldrich) und einem letzten Waschen in ddH 2 O auf RNase AWAY entfernen. Wick das überschüssige ddH 2 O vollständig mit einem sauberen Kimwipe vor dem Einbetten die Larven in Oktober </li><li> Nehmen Sie ein sauberes Gewebe Einbettform und Schicht mit einer dünnen (1,5-2mm) Schicht von OCT, gerade genug, um eine einzige Schicht von Larven zu decken. </li><li> Vor Einbettung der Larven, wenn nötig, kühle der OCT auf 0 ° C in das Gewebe Einbettformen. Tun Sie dies, indem Sie die Form mit ÜLG auf einem Eisblock. Dies wird dazu beitragen, Larven Bewegung während der Einbettung. </li><li> Legen Sie die sauberen Larven auf die vorgekühlte OCT und ordnen sie in parallel zueinander. Sobald die Larven haben angeordnet worden, langsam füllt die Form mit OCT, ohne die Larven Anordnung. Snap Einfrieren der Form, indem sie auf einem Trockeneis-Block. [Critical Schritt:. Snap-freeze die Larven sofort an Bewegung zu reduzieren] Diese Methode erlaubt die Larven in einer Ebene sein, die Maximierung der Anzahl von Zellen zur Verfügung pro Abschnitt für die Erfassung. Wenn es notwendig ist, um das Gewebe Morphologie für die Identifizierung der Zellen von Interesse zu wahren, oder wenn die erwartete Anzahl von Zellen pro Abschnitt ist als zufriedenstellend befunden dann gehen Sie direkt zu Schritt 11 fort. Alternativ, wenn die Zellen, die spezifisch und gekennzeichnet sind, können mit einer leicht erkennbaren Marker, wie GFP oder RFP identifiziert werden, aber die Anzahl der Zellen pro Abschnitt gefunden wird gering sein, dann die Schritte 5-10 kann hilfreich sein für die Erhöhung der Anzahl von Zellen zur Verfügung für die Erfassung pro Abschnitt. Dies sind optionale Schritte und sollte, falls erforderlich, als eine Methode zur Erhöhung der Zahl der Neuronen da für LCM pro Abschnitt, wenn die andere Methode versagt, um günstige Ergebnisse zu liefern. [Achtung: Diese Methode kann stören die gesamte Gewebemorphologie und machen Gewebe Identifikation auf bestimmte räumliche Lage der Grundlage sehr schwierig.] </li><li> Wash 50-70 dritten Larvenstadium wie in Schritt 1 beschrieben. Legen Sie die Larven in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 ul RNAse freien 1X PBS. </li><li> Dounce die Larven mit einem Polypropylen-Stößel (USA Scientific), mit 6-7 langsamen kräftigen Griffen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Lösung bei 16.000 (x) g für 5-10 Sekunden (bis die Larven Nagelhaut nieder auf den Boden der Mikrozentrifugenröhrchen]. Überstand verwerfen. Das Pellet sollte in erster Linie von Larvencuticula bestehen, auf die die PNS, einschließlich da Neuronen ist dicht verklebt. </li><li> Waschen Sie die Nagelhaut Pellet 2-3 mal in 1X PBS und das Pellet in 500 ul 1X PBS. Drehen Sie die Lösung bei 16.000 (x) g für 1 Minute zu einer kompakten Form von Pellets. Saugen Sie den Überstand vollständig mit einer feinen Pasteurpipette. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Pellet aus der Mikrozentrifugenröhrchen mit einem sauberen Spatel, und Docht das überschüssige PBS mit einem sauberen Kimwipe Gewebe. [Anmerkung: Es ist wichtig, um das Pellet so kompakt wie möglich zu halten, um die Zelle Ertragssteigerung]. Platzieren Sie den kompakten Nagelhaut Pellets auf einer Kunststoff-Form mit einer dünnen Schicht von OCT (1mm ca.). </li><li> Vorsichtig aus dem Pellet in einer dünnen, kreisförmigen Fläche verteilt. Füllen Sie die Form mit OCT, und frieren das Gewebe wie in Schritt 4 beschrieben. </li><li> Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten Gefrierschnitten bei 5-8 mu m Dicke auf Normalpapier, etikettiert, ungeladen, RNAse freie Objektträger aus Glas. [Critical Schritt: Positionieren Sie den Gewebeschnitten in der Nähe der Mitte der Folie.] </li><li> Bewahren Sie die Folien entweder direkt auf Trockeneis oder bei -80 ° C in einen sauberen Objektträger-Box, bis sie zur Mikrodissektion. Führen LCM vorzugsweise innerhalb einer Woche nach Schneiden des Gewebes. </li></ol> PAUSE POINT 2. Dehydration und Nagelhaut entfernen von Frozen Larven Sections [Critical Schritt: Alle Lösungen zur Entwässerung müssen bereit sein, vor jeder Sitzung LCM frisch. Vollständige Dehydratisierung von gefrorenen Larven Gewebeschnitten für die Erreichung optimaler Mikrodissektion Effizienz Essenziell] <ol><li> Entfernen Sie die Folien mit den gefrorenen Larven Gewebeschnitten aus der -80 ° C Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis. </li><li> Entfernen Sie eine einzelne Folie aus Trockeneis und sofort legen Sie es direkt in eine 50 ml konische tumit 70% Ethanol Fixativ, durch ein kurzes Spülen in RNAse freien ddH 2 O entsprechend der empfohlenen Zeiten in Tabelle 1 dargestellt, gefolgt gefüllt werden. </li><li> Die Anwesenheit von Larvencuticula in den Gefrierschnitten kann die Effizienz des Fanges durch die Verhinderung effizienter LCM cap-Zell-Kontakt, die unspezifische Aufnahme führen kann beeinträchtigt werden. Wenn nötig, führen Sie die folgenden Schritte (4-5), um die Schuppenschicht aus Gewebeschnitten klar. </li><li> Gently Pipette 50 ul 2,5% Trypsin direkt auf den Gewebeschnitten und inkubieren für 5-30 Sekunden bei Raumtemperatur. [Critical Schritt: Dieser Schritt kann optimiert werden müssen. Die Inkubationszeit hängt von der Gewebe mikrodissezierten und Schnittdicke. Längere Inkubation kann klar alles, einschließlich der Zellen von Interesse, während einer kurzen Inkubationszeit kann nicht ausreichen, um die Nagelhaut entfernen] </li><li> Spülen Sie die Teile kurz in einer 50 ml konische Röhrchen mit RNAse-freie ddH 2 O, um Trypsin zu entfernen, und locker eingehalten Nagelhaut Fragmente. </li><li> Tauchen Sie die Folien der Reihe nach in jedem der verbleibenden Ethanol und Xylol-Lösungen für die empfohlenen Zeiten (Tabelle 1), um die Entwässerung zu vervollständigen. </li><li> Nach der Entwässerung Gradienten werden die Objektträger kurz unter einer milden Luftstrom für 60-120 Sekunden bei Raumtemperatur getrocknet vor der Durchführung LCM. [Achtung: Dry das Xylol vollständig von der Gewebeschnitte vor der Durchführung LCM. Xylol ist bekannt, die LCM Kappe resultierende Polymer in Mikrodissektion Fehler] auflösen. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 70% Ethanol (Fixativ) </td><td> 3-10 Sekunden </td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 5-10 Sekunden </td></tr><tr><td> 2,5% Trypsin Incubation </td><td> 5-30 Sekunden </td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 5-10 Sekunden </td></tr><tr><td> 70% Ethanol </td><td> 60 Seconds </td></tr><tr><td> 95% Ethanol </td><td> 60 Seconds </td></tr><tr><td> 100% Ethanol </td><td> 120 Sekunden </td></tr><tr><td> 100% Ethanol </td><td> 120 Sekunden </td></tr><tr><td> 100% Xylol </td><td> 120 Sekunden </td></tr><tr><td> 100% Xylol </td><td> 120 Sekunden </td></tr><tr><td> Der Luft trocknen in einem milden Luftstrom </td><td> 60-120 Sekunden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Empfohlene Verfahren für die LCM Dehydrierung von gefrorenen Larven Gewebeschnitten. 3. Laser Capture Mikrodissektion PixCell IIe LCM Instrument mit Fluor 300 Epifluoreszenz-Optik für EGFP optimiert ausgestattet war für die Durchführung der LCM verwendet. [Critical Schritt: Wenn möglich, führen Sie die Mikrodissektion in einer Feuchte-kontrollierten Raum zu einer Minderung Mikrodissektion Effizienz aufgrund der erhöhten Feuchtigkeit zu verhindern. Raumfeuchte ist ein kritischer Faktor für die Mikrodissektion Effizienz. Niedrige Raumfeuchte kann eine erhöhte statische klammern sich in unspezifischen erfassen, während hohe Raumfeuchte in niedrigen Mikrodissektion Effizienz führen kann. Wir erzielten eine optimale LCM Effizienz zwischen 25-50% relative Luftfeuchtigkeit.] <ol><li> Schalten Sie die Stromversorgung für das Mikroskop und Laser-Schaltkasten. </li><li> Laden Sie die CapSure Kappe Halter Montage mit HS LCM caps (Molecular Devices): Zwei Patronen von LCM Kappen können auf einmal geladen werden. </li><li> Öffnen Sie das Molecular Devices Software und geben Sie das Experiment Details einschließlich Foliennummer und Cap Losnummer. </li><li> Legen Sie eine neue HS LCM Kappe von der Patrone auf die PixCell IIe LCM Instrument und positionieren Sie es korrekt in Bezug auf den Joystick, um die richtige Positionierung der Kappe in Bezug auf die Capture-Bereich zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie den Objektträger mit frisch entwässertem Larvengewebe Abschnitte auf dem Mikroskoptisch für die Mikrodissektion. </li><li> Suchen Sie die fluoreszenzmarkierten Zellen mit den Okularen oder dem Computer-Bildschirm. Aufgrund der hohen Spezifität der PPK-GAL4, UAS-mCD8:: GFP transgenen Reporter Linie, kann die Klasse IV da Neuronen leicht von GFP-Fluoreszenz identifiziert werden. </li><li> Betreff des Gewebes zu LCM mit CapSure HS LCM Kapseln [für eine detaillierte Anweisungen für die Einstellung des Gerätes, Fokussierung des Laserstrahls und Durchführung LCM siehe Referenz 22]. </li><li> Stellen Sie die &quot;Power&quot; und &quot;Dauer&quot;-Laserpuls Parameter, um eine präzise geschmolzene Polymer vor Ort, dessen Größe entspricht dem gewählten Messfleck zu erreichen. Passen Sie die Einstellungen für die Größe der geschmolzene Polymer-Bereich anpassen. Die folgenden Parameter wurden für microdissecting einzigen Klasse IV da Neuronen verwendet: Spot Durchmesser 7,5 um, Laser-Stärke 30-50 mW, Laser-Zeit und 2-4 Ms und 1-2 Schüsse pro Zelle verwendet wurden. [Critical Schritt: die Laser-Parameter für einen richtigen Stelle erforderlich kann mit Gewebedicke und Raumfeuchte Bedingungen variieren. Stellen Sie die &quot;Power&quot; und &quot;Dauer&quot;-Einstellungen, um die erforderliche geschmolzene Polymer Spotgröße für microdissecting einzelne oder mehrere Zellen zu erreichen.] </li><li> Zur Maximierung der Spezifität, microdissect Zellen mit minimaler Überlappung und eine starke Fluoreszenz. Jede Kappe ist für den Fang zahlreicher Zellkörper. [Critical Schritt: Zur Vermeidung von RNA-Abbau, schränken die gesamte Messzeit einschließlich Entwässerung und Mikrodissektion zu weniger als 45 Minuten] </li><li> Sobald alle Zellen von Interesse aufgenommen wurden, heben Sie den HS LCM Kappe mit dem mikrodissezierten Zellen und legte es auf einen sauberen Objektträger um die Präsenz der eingefangenen Zellen zu bestätigen und eine Sichtprüfung der Kappe auf das Vorhandensein von unerwünschten Zellen oder Schmutz. </li></ol> 4. RNA-Isolierung aus LCM abgeleiteten Zellen <ol><li> Bringen Sie die Kappe mit dem mikrodissezierten Zellen zu einem ExtracSure (Molecular Devices) Gerät. Fügen Sie 12μl der RNA-Extraktionspuffer (PicoPure, Molecular Devices) auf die Kappe Oberfläche mit den Zellen und verbinden ein umgekehrtes dünnwandigen Reaktionsrohr (GeneAmp, Applied Biosystems), um die ExtracSure Gerät. Legen Sie die Montage auf eine Ausrichtung Fach (Molecular Devices) und decken Sie es mit einer Inkubationszeit Block (Molecular Devices) vorgewärmt auf 42 ° C innerhalb eines Inkubators. </li><li> Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten, Zentrifuge die Röhrchen mit den Extrakten bei 800 (x) g für 2 Minuten. Schließen Sie die Rohre und speichern Sie die Zellextrakte bei -80 ° C bis sie für RNA Aufreinigung. </li></ol> PAUSE POINT <ol start="3"><li> Extrahieren und Spalte reinigen die RNA nach dem PicoPure (Molecular Devices) RNA-Extraktion Kit Anweisungen. DNAse Behandlung ist optional und kann auf der Säule während der RNA-Reinigung nach Bedarf durchgeführt werden. Falls erforderlich, können mehrere LCM-Proben zusammen während der Reinigung in einer einzigen Spalte zur endgültigen RNA-Ausbeute zu erhöhen gebündelt werden und kann in einem kleinen Volumen (11-30 ul) Elutionspuffer (PicoPure, Molecular Devices) eluiert und bei -80 ° C bis zur Verwendung. Auf Wunsch eine 1 ul-Aliquot verwendet werden, um Gesamt-RNA Qualität auf einem Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.) zu beurteilen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Laser Mikrodissektion (LCM) wurde verwendet, um einzelne, klassenspezifische oder mehrere Drosophila da Neuronen aus dritten Larvenstadium (Abb. 1) zu isolieren. LCM ermöglicht eine hohe Präzision und Spezifität bei der Isolierung von Drosophila da Neuron Zellkörper (Abbildung 2a-c). Darüber hinaus wurde die Gesamt-RNA aus diesen isoliert da Neuronen gereinigt gefunden von ausgezeichneter Qualität sein, wie durch das Vorhandensein von scharfen 5.8S, 18S und 28S ribosomalen RNA Spitzen angezeigt, wenn auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) (Abbildung analysiert 2d). Zur Beurteilung der neuronal-spezifische Anreicherung unserer isolierten Zellen führten wir real-time quantitative reverse Transkription PCR (qRT-PCR) mit Hilfe der neuronalen Gen-spezifischer Marker, Elav. Für die qRT-PCR-Analysen berechneten wir die relativen Pegel der Elav Ausdruck in der LCM mikrodissezierten da Neuronen und normalisiert diesen Ausdruck, dass der endogene Kontrolle (rp49) und bezogen auf Gesamt-RNA aus ganzen Larven mit dem ΔΔCt Methode 23 isoliert. Diese Analysen zeigten, über 2,5 fache Anreicherung in den relativen Pegel der Elav in LCM Mikro-seziert da Neuron Proben, ganze Tiere (Abbildung 3) verglichen. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: LCM von Drosophila peripheren Neuronen. (A) Alter abgestimmt dritten Larvenstadium ausgewählt, gewaschen und (b) in einer cryomold mit OCT eingebettet und bei -80 ° C, (c) 8μm serielle Gewebeschnitte werden mit einer Standard-Kryostaten und (d) platziert gleichmäßig auf sauberen Glasobjektträger. Die Glasträger mit den angebrachten Gewebeschnitte werden bei -80 ° C vor dem LCM Verarbeitung. (E, f) Unmittelbar vor LCM, die Gewebeschnitte werden aufgetaut und kurz fixiert in 70% igem Ethanol durch kurze in ddH 2 O. spülen gefolgt (g) Die Folien werden im Folgenden kurz mit Trypsin inkubiert und gespült mit ddH 2 O auf Nagelhaut (schwarz) aus dem larvalen Abschnitte. (h, i) Gewebeschnitte ohne Larvencuticula entfernen werden dann weiter dehydriert in ein Ethanol-Gradienten und schließlich gelöscht in Xylol . (j) Die LCM Kappe mit einem thermolabile Polymer ist auf dem Gewebeschnitt platziert und der Laser wird auf den ausgewählten fluoreszierende Zellkörper gepulst. Der Laserpuls schmilzt das Polymer und verschlingt die markierte Zelle Körper. Das Polymer Kappe, zusammen mit den erfassten Zellkörper angehoben wird, und (k) RNA-Extraktionspuffer wird in die Zelle aufgenommen. Die aufgenommenen Zelle, zusammen mit der RNA-Extraktionspuffer ist bei 42 ° C für 30 Minuten inkubiert und kann entweder bei -80 ° C gelagert werden, oder direkt für die RNA-Reinigung weiterverarbeitet. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: LCM ermöglicht eine hohe Präzision einfangen von da Neuronen. (A) Repräsentative Bild eines dehydriert und Trypsin behandelt 8 Mikron Gewebeschnitt vor der Durchführung LCM, mit zwei Klasse-IV da Neuronen mit GFP durch die PPK-GAL4 gekennzeichnet, UASmCD8:: GFP-Reporter-Stamm. Beachten Sie, dass eine der Neuronen markiert (Pfeilspitze) für die Erfassung. (B) Zellkörper der Neuronen markiert (Pfeilspitze) sauber ist mit hoher Spezifität aus dem Gewebeschnitt Mikro-seziert. (C) End-on Ansicht einer einzelnen Klasse -IV da Neuron auf der LCM cap erfasst. (d) Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Elektropherogramm Gesamt-RNA aus LCM-derived da Neuronen isoliert, die eine hervorragende RNA-Qualität als durch das Vorhandensein von scharfen 5.8S, 18S angegeben und 28S rRNA Peaks. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3:. QRT-PCR zeigt wesentliche Bereicherung der neuronalen Marker Genexpression in LCM eingefangen da Neuronen relativ zu ganzen Tier qRT-PCR-Analysen von Neuronen-spezifische Marker Genexpression (Elav) in LCM eingefangen da Neuronen (21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP) und ganze Tiere im Alter abgestimmt dritten Larvenstadium wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt. Relative Ebenen Elav Ausdruck in LCM eingefangen da Neuronen wurden die endogenen Kontrolle (rp49) und relativ zum gesamten Larven mit dem ΔΔCt Methode 23 normalisiert. Ein 2,5-fache Anreicherung in den relativen Pegel der Elav in LCM eingefangen da Neuron Proben relativ zu ganzen Tieren beobachtet wurde. Fehlerbehebung Problem: RNA abgebaut, oder von geringer Qualität. Stellen Sie sicher, RNAse freien Bedingungen im gesamten Experiment. Verringern Sie viel Zeit auf LCM pro Objektträger verbracht bis 30 Minuten. Halten Sie die Folien und die Proben auf Trockeneis, außer bei der Durchführung von LCM. Vermeiden Sie Auftauen der Gewebeschnitte, wenn sie geschnitten werden. Problem: Die meisten Zellen sind aus der Folie während Trypsin-Behandlung (Schritt 17-18) verloren. Reduzieren Sie die Zeit der Trypsin-Behandlung. Reduzieren Sie die Trypsin-Konzentration. Problem: Präsenz der Kutikula und anderen unspezifischen Gewebereste auf der Kappe Polymer. Versuchen Sie, die Gewebereste, indem man die Polymer-Oberfläche mit der klebrigen Seite eines Klebers beachten 22. Problem: Geringe LCM Effizienz. Erhöhen Sie die Inkubationszeit in 100% Ethanol und Xylol. Reduzieren Raumfeuchte mit Entfeuchter.

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Das Protokoll hier vorgestellte beschreibt unsere optimierte Methode zur Isolierung von Drosophila peripheren Neuronen über LCM. Während dieser LCM-Protokoll für die spezifische Isolierung von Einzel-, Klassen-spezifischen oder mehrere Drosophila da Neuronen ab dem dritten Larvenstadium Larvenstadium der Entwicklung konzipiert wurde, konnte geringfügige Änderungen des Protokolls ohne weiteres für den Fang von anderen Drosophila Zelltypen aus allen Entwicklungs angepasst werden Phasen mit...

Ausstattung: <ul><li> Kryostat </li><li> 50 ml konischen Rohr für Dia-Fixierung, Spülen, Trypsin-Behandlung und Ethanol / Xylol Dehydration </li><li> -80 ° C Gefrierschrank </li><li> Inkubator </li><li> PixCell IIe LCM Instrument mit Fluor 300 Epifluoreszenz-Optik für EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices) optimiert </li></ul>

laser capture microdissection of drosophila peripheral neurons

Die dendritischen Verzweigung (da) Neuronen des Drosophila peripheren Nervensystem (PNS) liefern ein hervorragendes Modell, in dem die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen klassenspezifischen Dendriten Morphogenese 1,2 untersuchen. Zur Erleichterung der molekularen Analyse von klassenspezifischen da Neuron Entwicklung ist es wichtig, diese Zellen in eine reine Population zu erhalten. Obwohl eine Reihe von verschiedenen Zell-und Gewebe-spezifische RNA-Isolierung Techniken existieren für Drosophila-Zellen, einschließlich Magnetic-Bead-basierten Zellreinigung 3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) 5-8, und RNA bindenden Proteins Strategien 9, keine Diese Methoden können leicht zur Isolierung von einzelnen oder mehreren Klassen-spezifischen Drosophila da Neuronen mit einem hohen Grad an räumlicher Präzision eingesetzt werden. Laser Capture Mikrodissektion (LCM) wurde als ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug, das benutzt, um bestimmte Zelltypen aus Gewebeschnitten isoliert mit einem hohen Grad an räumlicher Auflösung und Genauigkeit kann entstanden. RNA aus isolierten Zellen erhalten kann dann für Analysen einschließlich qRT-PCR und Microarray-Expression Profiling innerhalb einer bestimmten Zelltyp 10-16 verwendet werden. Bis heute hat LCM nicht umfassend in die Analyse von Drosophila Gewebe und Zellen 17,18, einschließlich da Neuronen an der dritten Larvenstadium Larvenstadium der Entwicklung eingesetzt. Hier präsentieren wir unsere optimiertes Protokoll für die Isolierung von Drosophila da Neuronen mit der Infrarot-(IR)-Klasse von LCM. Diese Methode ermöglicht die Erfassung von Einzel-, Klassen-spezifischen oder mehrere da Neuronen mit hoher Spezifität und räumlicher Auflösung. Alter abgestimmten dritten Larvenstadium Ausdruck eines UAS-mCD8:: GFP 19 Transgen unter der Kontrolle von entweder der Klasse IV da Neuron spezifischen ppk-GAL4 20 Treiber oder in den gesamteuropäischen da Neuron spezifischen 21-7-GAL4 21 Treiber wurden für diese verwendet Experimente. RNA aus den isolierten da Neuronen erhalten ist von sehr hoher Qualität und kann direkt für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich qRT-PCR oder Microarray-Analysen verwendet werden. Darüber hinaus kann diese LCM-Protokoll leicht angepasst werden, zu erfassen anderen Drosophila Zelltypen eine verschiedene Stadien der Entwicklung abhängig vom Zelltyp spezifisch, GAL4-driven Expressionsmuster von GFP.

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In diesem Video-Artikel präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von einzelnen oder mehreren<em&gt; Drosophila</em&gt; Da Neuronen aus dritten Larvenstadium mit der Infrarot-Aufnahme (IR)-Klasse von Laser Capture Mikrodissektion (LCM). RNA aus den isolierten Neuronen erhalten können leicht für nachgelagerte Anwendungen wie qRT-PCR oder Microarray-Analysen verwendet werden.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

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Research

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Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

13.4K Aufrufe.  George Mason University. In diesem Video-Artikel präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von einzelnen oder mehreren Drosophila Da Neuronen aus dritten Larvenstadium mit der Infrarot-Aufnahme (IR)-Klasse von Laser Capture Mikrodissektion (LCM). RNA aus den isolierten Neuronen erhalten können leicht für nachgelagerte Anwendungen wie qRT-PCR oder Microarray-Analysen verwendet werden.

Serie: Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Forschung

Neurowissenschaften

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Riechzellen durch nasale Biopsie Combined Erhalten mit Laser-Mikrodissektion: Ein möglicher Ansatz zum Behandlungserfolg bei Mental Disorders Studieren

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, microvascular proliferation, mesenchymal transformation and necrosis characterize the histological heterogeneity of high-grade gliomas. Our laboratory has demonstrated that the presence of high densities of mesenchymal cells, named oncostreams, correlate with tumor malignancy. We have developed a unique approach to understand the mechanisms that underlie glioma&#39;s growth and invasion. Here, we describe a comprehensive protocol that utilizes laser capture microdissection (LMD) and RNA sequencing to analyze differential mRNA expression of intra-tumoral heterogeneous multicellular structures (i.e., mesenchymal areas or areas of tumor invasion). This method maintains good tissue histology and RNA integrity. Perfusion, freezing, embedding, sectioning, and staining were optimized to preserve morphology and obtain high-quality laser microdissection samples. The results indicate that perfusion of glioma bearing mice using 30% sucrose provides good morphology and RNA quality. In addition, staining tumor sections with 4% Cresyl violet and 0.5% eosin results in good nuclear and cellular staining, while preserving RNA integrity. The method described is sensitive and highly reproducible and it can be utilized to study tumor morphology in various tumor models. In summary, we describe a complete method to perform LMD that preserves morphology and RNA quality for sequencing to study the molecular features of heterogeneous multicellular structures within solid tumors.

Laser microdissection (LMD) is a sensitive and highly reproducible technique that can be used to uncover pathways that mediate glioma heterogeneity and invasion. Here, we describe an optimized protocol to isolate discrete areas from glioma tissue using laser LMD followed by transcriptomic analysis.

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion