Die Heterogenität der Skelettstrukturen ist ein Hindernis bei der Untersuchung der Genexpression bei der Entwicklung von Knorpel und Knochen. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur präzisen Isolierung benachbarter, aber unterschiedlicher Gewebe. Wir optimieren die Laseraufnahme-Mikrodissektion für Knorpel und Knochen mit Kresylviolettfärbung, um diese Gewebe für eine präzise Sammlung zu visualisieren, indem wir eine hohe RNA-Integrität für die nachfolgende Analyse beibehalten.
Andere Gewebe können isoliert werden, wenn Kresylviolett eine ausreichende Unterscheidung des Zielgewebes bietet und die RNA-Qualität nach unserer Verarbeitungsmethode hoch bleibt. Zu diesen Geweben gehören craniofacial Nähte und Gehirn. Cryosectioning ist die anspruchsvollste Fähigkeit in diesem Protokoll.
Stellen Sie sicher, dass das Gewebe schnell seziert und eingebettet wird, um die höchste Integrität der RNA zu erhalten. Um dieses Verfahren zu beginnen, sezieren Sie den Embryo oder das Gewebe von Interesse. Die Probe in eine Einweg-Einbettform mit optimaler Schnitttemperaturverbindung einbetten und die Ausrichtung der Probe mit einer Spitze oder Nadel anpassen.
Die Proben in einem Trockeneis- und Methyl-2-Butenbad schnell einfrieren. Als nächstes bereiten Sie einen Deckelbehälter mit Trockeneis vor, indem Sie eine Aluminiumfolie auf das Trockeneis legen, um während des Kryosektionseinebeinens vorübergehend Sezierprobenrutschen zu lagern. Das frisch gefrorene Exemplar in den Eimer trockeneis geben.
Legen Sie eine Schicht mit optimaler Schnitttemperaturverbindung auf einen Kryostat-Probenhalter und legen Sie die Probe sofort mit sanftem Druck auf die optimale Schnitttemperaturverbindung. Wenn die optimale Schnitttemperaturverbindung vollständig eingefroren ist, befestigen Sie den Halter mit der Probe in den Kryostatschneidarm. Lassen Sie die Probe 15 Minuten im Kryostat, um sie auf die Schnitttemperatur auszugrenzen.
Dann schneiden Sie das Gewebe mit einer Dicke von 12 Mikrometern und sammeln Sie die Scheiben auf PEN-Membran-Dias. Richten Sie aufeinander folgende Abschnitte auf der Membran aus. Nach Abschluss der Rutsche lassen Sie die Abschnitte für einige Minuten trocknen und übertragen Sie die Rutsche dann auf die Folie im Trockeneisbehälter, bis alle erforderlichen Rutschen gesammelt sind.
Bewahren Sie die Dias bei minus 80 Grad Celsius in einer Schiebebox auf. Zu Beginn drei beschriftete 15-Milliliter-Zentrifugenrohre zubereiten. Fügen Sie 45 Milliliter 80% Ethanol in jede Röhre.
Legen Sie drei Röhren auf Eis. Legen Sie eine Tube mit 45 Millilitern 95%Ethanol und eine Tube mit 100% Ethanol auf Eis. Als nächstes 45 Milliliter Xylol zu einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr bei Raumtemperatur hinzufügen.
Eine PEN-Membran kurz auftauen, indem Sie sie gegen eine handgeliebte Hand legen, und waschen Sie sie zweimal für 30 Sekunden in jedem der Rohre, die 80% Ethanol mit Rührung enthalten, um die optimale Schnitttemperaturverbindung zu entfernen. Legen Sie dann die Rutsche auf ein Blatt Aluminiumfolie. Pipette 8 Milliliter 1%Cresylviolett und 50% Ethanol auf die Rutsche und Fleck für 30 Sekunden.
Waschen Sie die Rutsche in der dritten Röhre mit 80% Ethanol für 30 Sekunden. Dehydrieren Sie die Rutsche, indem Sie sie 30 Sekunden lang durch das Rohr mit 95 % Ethanol, das Rohr mit 100 % Ethanol für 30 Sekunden und schließlich das Rohr, das Xylol enthält, 30 Sekunden lang passieren. Danach die Dias für fünf Minuten auf einen empfindlichen Aufgabenwischer stellen, um das Xylol abtropfen zu lassen und die Abschnitte trocknen zu lassen.
Schalten Sie zunächst das Laseraufnahmemikroskop, den Laser und den Computer ein. Melden Sie sich am Computer an und starten Sie die Software. Wenn das grüne Licht leuchtet, drücken Sie die rote Taste, um den Laser zu aktivieren.
Wenn das Licht rot wird, ist der Laser einsatzbereit. Legen Sie die Kappe eines 5 Milliliter PCR-Rohrs in den Kollektor ein. Pipette 50 Mikroliter Extraktionspuffer in die Kappe und legen Sie das Sammelgerät in das Mikroskop.
Klicken Sie im Fenster "Wechsel-Collector-Geräte" auf die Schaltfläche Zum Referenzpunkt verschieben, um den Kollektor zum Referenzpunkt zu verschieben. Passen Sie den Fokus an, um den Referenzpunkt klar anzuzeigen. Klicken Sie als Nächstes auf die linke Entladeschaltfläche in der Symbolleiste, um den Folienhalter zu senken.
Legen Sie die Folie in den Halter mit dem nach unten gerichteten Gewebeabschnitt und setzen Sie den Halter wieder in die Bühne ein. Klicken Sie im Fenster "Muster ändern" auf "Fortfahren". Um die Laserparameter einzurichten, wählen Sie die Steuerungsoption des Lasermenüs oder klicken Sie auf das Lasersymbol.
Passen Sie die folgenden Parameter wie gewünscht, Leistung, die die Leistung des Lasers ist, Blende, die die Breite des Lasers ist, und Geschwindigkeit, die die Schnittgeschwindigkeit im Zug- und Schnittmodus ist. Beginnen Sie mit einem 5X-Ziel, die Interessensgebiete zu finden, und wechseln Sie zu dem Ziel, das den Interessenbereich am besten anzeigt. Wählen Sie das Rohr für die Sammlung, indem Sie auf die Markierung am Kollektor klicken, dann wählen Sie verschieben und schneiden oder zeichnen und schneiden.
Sobald der Schnitt abgeschlossen ist, fällt das Zielgewebe mit PEN-Membran durch Schwerkraft in die Kappe des Sammelrohrs. Wiederholen Sie diesen Auswahl- und Schneidprozess, um bei Bedarf mehrere Interessenbereiche zu ziehen. Danach den Kollektor entladen und das PCR-Rohr vorsichtig schließen.
Legen Sie das mikrosezierte Gewebe auf Trockeneis. Das mikrosezierte Gewebe bei Raumtemperatur auftauen, dann kurz zentrieren und die Proben 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius bebrüten. Danach drehen Sie den Lysepuffer in das 5 Milliliter PCR-Rohr.
Führen Sie die DNase-Behandlung und die RNA-Extraktion mit einem RNA-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. In dieser Studie wird eine optimierte Lasererfassungsmikrodissektion von Knorpel und Knochen durchgeführt, die die Verwendung von Kresylviolettfärbung in einem schnellen Verfahren zur Visualisierung von Knorpel und Knochen für eine präzise Gewebesammlung unter Beibehaltung einer hohen RNA-Integrität für die nachfolgende Analyse hervorhebt. Die Beobachtung der Dias zeigt, dass alle untersuchten Knorpel Magenta gefärbt sind und alle mineralisierten Gewebe braun oder schwarz sind.
Knorpel und Knochen lassen sich an mehreren anatomischen Stellen leicht von anderen Geweben unterscheiden. Meckels Knorpel, Kondylarknorpel und die Unterkieferknochenbereiche werden durch Laseraufnahmemikrodissektion ausgewählt und isoliert. Um genügend RNA für die Sequenzierung zu erhalten, ziehen Sie 10 Regionen von Meckels Knorpel, 10 Regionen Kondylarknorpel oder vier Regionen des Unterkieferknochens in drei einzelne Sammelröhrchen.
Anschließend wird die RNA extrahiert und die gesamte RNA mit einem Bioanalyzer analysiert. Dieses Laser-Capture-Mikrodissektionsprotokoll wird an verschiedenen Geweben in verschiedenen Entwicklungsstadien verwendet, und die Messungen der RNA-Integritätsnummer zeigen eine hohe RNA-Qualität an. Anschließend wird eine Differenzgenexpressionsanalyse durchgeführt.
Zwischen dem Unterkieferknochen und Meckels Knorpel werden 4 006 Gene signifikant und unterschiedlich exprimiert. Gene, die für Osteoblasten oder Osteozyten spezifisch sind, werden im Unterkieferknochen stärker exprimiert, während chondrozytenspezifische Gene stärker in Meckels Knorpel exprimiert werden. Darüber hinaus sind Osteoklastmarker stärker im Unterkieferknochen exprimiert, was auf eine erfolgreiche Isolierung von Zielgeweben hindeutet.
Nach diesem Verfahren kann eine Genexpressionsanalyse, einschließlich qPCR und RNA-seq, durchgeführt werden. Diese Methoden können die Genexpression des Transkriptoms in bestimmten Geweben oder Regionen von Interesse innerhalb heterogener Gewebe analysieren.
