This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den kanadischen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Université Laval Tierschutzkommission genehmigt. 1. Probenvorbereitung HINWEIS: In diesem Beispiel haben wir Mäusegehirnen bei postnatalen Tag 1. <ol><li> Verwenden Hypothermie Anästhesie in zerstoßenem Eis für 3 bis 4 Minuten für Welpen, dann zerlegen Gehirn so schnell wie möglich in eiskaltem L15 Medium. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 2 min. </li><li> Über seziert Gehirn in das Einbetten (Liste von Gütern vgl.) Form und füllen mit gefrorenen Gewebeeinbettungsmedien darauf achten, dass die Probe in der gewünschten Position zu orientieren. Frieren Proben sofort in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 30 Sekunden. HINWEIS: Die Proben können einige Monate gelagert werden, ohne die RNA-Qualität. </li></ol> 2. Schnitte <ol><li> Treat Membran coated Glasobjektträger (vgl. Liste der Material) mit Oberflächen RNAse Dekontaminationslösung, um jede Spur von RNAsen zu beseitigen. Waschen Sie die Folien in DEPC-Wasser und trocknen lassen. Alternativ backen Plättchen über Nacht bei 200 ° C. </li><li> Übertragen Sie eingefrorenen Proben in einem Kryostaten zuvor mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung gereinigt. Stellen Kryostatkammer Temperatur bei -20 ° C und in Scheiben schneiden Proben bei 10 &amp; mgr; m Dicke. Sammeln Gewebeschnitte auf die Membran beschichteten Objektträgern und trocknen lassen 10 Minuten vor der Färbung. Alternativ gleitet bei -80 ° C bis zur Färbung. </li></ol> 3. Herstellung von Färbelösungen <ol><li> Bereiten alle Lösungen unmittelbar vor dem Beginn des Experiments, und mit RNAse Inhibitor in allen Färbelösungen (außer Waschlösungen), um RNA-Abbau zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie die Pufferlösung. Verwenden des gleichen Puffers in allen Lösungen (RNase-freies Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS besteht) von 1% BSA ergänzt war,0,2% Triton und 2% RNAse-Inhibitor). Für jede Folie, bereiten 400 ul Pufferlösung (200 ul für den primären und 200 ul für die Sekundärantikörper). </li><li> Bereiten Sie die Fixierungslösung: Verwenden Sie 70% Ethanol aufbewahrt bei -20 ° C. Halten der Gewebefixierung Verfahren minimal um eine drastische Verringerung der RNA Extraktionsausbeute zu vermeiden. HINWEIS: Alternativ können 95% Ethanol-Lösung von 5% Essigsäure ergänzt war, bei 20 ° C gehalten. </li><li> Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung durch Verdünnen des primären Antikörpers in der Pufferlösung. Für dopaminergen Neuronen Kennzeichnung, verwenden Sie ein Antikörper, der auf die Tyrosin-Hydroxylase (TH, geschwindigkeitsbestimmende Enzym für Dopamin-Produktion). Mit einer hohen Konzentration des Antikörpers, um für die schnelle Inkubationszeit kompensieren. Verwenden TH-Antikörper in einer Verdünnung von 1:25. HINWEIS: Im normalen Immunfluoreszenz-Protokoll, diese Antikörper gibt ein starkes Signal, wenn über Nacht bei einer Verdünnung von 1: 1000. In diesem Protokoll wird es verwendet, 40x Konzentrataufgrund der kurzen Inkubationszeit ed. Aufgrund der hohen Konzentration des Antikörpers für dieses Verfahren verwendet, führen Sie eine Standard-Immunfärbung parallel, um jede Zunahme der nicht-spezifische Markierung überprüfen. </li><li> Vorbereiten des sekundären Antikörperlösung durch Verdünnung des sekundären Antikörpers in der Pufferlösung. Verwenden eines biotinylierten sekundären Antikörpers in einer Konzentration von 1: 100. HINWEIS: In diesem Beispiel wurde ein Anti-Kaninchen-Antikörper biotinyliert. </li><li> Vorbereiten des Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Lösung zum Nachweis von biotinylierten sekundären Antikörper. Make ABC-Lösung durch Zugabe der Verbindung A und der Verbindung B in einer Konzentration von 1: 100 in DEPC PBS verdünnt, ergänzt mit 2% RNAse Inhibitor. Bereiten Sie die Avidin-Biotin-Komplex 30 Minuten, bevor Sie den Folien. </li></ol> 4. Die Färbung <ol><li> Tauen Sie ein oder zwei Folien zu der Zeit von -80 ° C nach schneller schnippte sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Surround Abschnitten mit einer hydrophobenBarriere Stift und lassen Sie für ein paar Sekunden trocknen. <ol><li> Die Objektträger in der kalten Fixierungslösung für nicht mehr als 5 min bei -20 ° C. Einmal schütteln, in der Luft, um mehr als Fixierungslösung anschließend in DEPC PBS 6-8 mal zum Waschen entfernen, schnell die Objektträger. </li><li> Streichen Sie die Folien, um überschüssige DEPC PBS zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten. </li></ol></li><li> Objektträger auf eine saubere Schale (mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt, um jede Spur von RNAsen beseitigen) und setzte 200 ul des primären Antikörperlösung auf jeder Folie (Kaninchen-Anti-TH) für 10 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und Flick die Folien einmal, um den Überschuss an DEPC PBS zu entfernen. </li><li> Setzen 200 ul des sekundären Antikörperlösung auf jedem Objektträger 6 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell 3 mal in DEPC PBS zum Waschen und Flick die Folien, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen. </li><li> Setzen Sie 200 ul der ABC Lösungention auf jedem Objektträger für 4 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal für das Waschen und die Folien blättern, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen. </li><li> Bereiten Sie die DAB (3,3 &#39;Diaminobenzidin) Lösung während der 4 min Inkubation in der ABC-Lösung. Verwenden Sie die Reagenzien im Kit (DAB Peroxidasesubstrat Kit) zur Verfügung gestellt. Mix 1 Tropfen vorgesehen Puffer, 1 Tropfen DAB-Lösung und 1 Tropfen 30% H 2 O 2 in 2,5 ml DEPC-Wasser. Mischen Sie die Lösung durch Umdrehen. </li><li> Nehmen Sie 196 ul der DAB-Lösung und fügen Sie 4 ul (2%) von RNAse Inhibitor-Lösung kurz vor Aufbringen auf Objektträger. Die Objektträger auf einer sauberen Schale (mit einer Fläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt) und legte die 200 ul der DAB-Lösung auf den Objektträgern. HINWEIS: DAB-Lösung sollte within1 oder 2 min reagieren. </li><li> Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und legte Folien für einige Sekunden in absolutem Ethanol. Trocknen Sie die Folien durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). &lt;br /&gt; Hinweis: Folien können bei -80 ° C für eine spätere Verwendung gelagert oder für LCM verarbeitet werden. </li></ol> 5. Laser Capture Mikrodissektion <ol><li> Tauen Sie gleitet schnell durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten. </li><li> Fahren Sie mit LCM. Den Objektträger unter dem Mikroskop mit Blick auf das Sammelrohr Kappe der Probenseite. Wählen die beste Vergrößerung für die Probe. Stellen Sie den Fokus, um die Zellen von Interesse zu sehen. <ol><li> Legen Sie den Schnittbereich und fang an zu schneiden mit dem Laser. Sammeln seziert Zellen oder Gewebestück in der Sammelrohrkappe mit 50 ul Lysepuffer (von RNA-Extraktions-Kits) gefüllt. Sicherzustellen, dass der Schritt des LCM ist 30 min nicht übersteigt. </li></ol></li><li> Auszug Gesamt-RNA aus Zellen isoliert unter Verwendung einer RNA-Extraktions-Kits (vgl. Liste der Materialien). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. <ol><li> Inkubieren gesammelten Zellen für 30 min bei 42 ° C zuLyse der Zellen. Voraussetzung der RNA Reinigungskolonne durch Zugabe von 250 ul der Konditionierungspuffer. Last 50 ul Ethanol zu lysierten Zellen. Laden Sie die 100 ul der lysierten Zellen auf eine vorkonditionierte Reinigungssäule. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spalte bei 16.000 g für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Zweimal Die Säule wird mit Waschpuffer. Eluieren in der minimal empfohlenen Volumen (11 ul) von RNase-freies Wasser (nicht behandelt DEPC wie es mit dem Bioanalyzer stören). Halten Sie 2 ul Testqualität. HINWEIS: Alle Lösungen und Reagenzien sind im Kit enthalten. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Synthese und Quantitative RT-PCR <ol><li> Reverse Transkription und RNA-Proben aus dem Laser eingefangen dopaminergen Zellen in komplementäre DNA mittels reverser Transkriptase und Oligo (dT). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers (vgl. Liste von Material). </li><li> Verwenden 1 ul cDNA für qRT-PCR-Amplifikation mit genspezifischen Primern. Richten PCR reactions in 20 ul Volumen mit einer einkomponentigen Heißstartreaktionsmischung für quantitative PCR, wie vom Hersteller empfohlen. Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung. <ol><li> Für die hier beschriebenen Experimente, die folgenden Primerpaare: GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); Th-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT GGG CAG ACA CAC G-3&#39;); AADC-F (5&#39;-CAT AGC GAG TTC TGC CCT TC-3 &#39;) / AADC-R (5&#39;-GGA TGT GGT CCC TGT CAG AG-3&#39;). </li></ol></li><li> Führen quantitative RT-PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Rapid Cycling-Parameter: 95 ° C für 5 min, gefolgt von 45 Zyklen von 10 sec 95 ° C, 10 sec bei 60 ° C und 10 sec bei 72 ° C. Führen Schmelzkurvenanalyse mit dem Standard-Einstellung des Instruments auf Bestimne homogene Produktbildung. </li><li> Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der integrierten Software. <ol><li> Normalisierung der Expressionswerte DA Marker Gene Th und AADC mit der Expression der beiden Referenzgenen GAPDH und Rpl13a um relative Expressionsniveaus zu erhalten, wie zuvor beschrieben 14. </li></ol></li></ol>

<ol>
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T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era:+targeting+the+genetic+basis+of+cancer.">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der kritischste Punkt dieses Verfahrens besteht darin, die Markierung von Zellen von Interesse, während verhindert RNA-Abbau. Wie RNAsen in wässrigen Lösungen aktiv sind, abnehm Inkubationszeiten verbessert RNA Erhaltung 11,15. Alle verwendeten Lösungen müssen mit DEPC, um RNasen zu inaktivieren behandelt werden. Alle Materialien und Oberflächen benötigen, um mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung zu RNAsen Kontamination zu verhindern behandelt werden. Schließlich wird in diesen Bedingung...

Das Gehirn ist von einer großen Vielfalt von verschiedenen Neuronentypen Bilden komplexer Netzwerke zusammen. Diese Neuronen sind in verschiedene Gruppen und Untergruppen nach ihrer Morphologie, Konnektivität und Genexpressionsmuster 1 organisiert. Die Entwicklung von Mikroarrays, der nächsten Generation Sequenzierung und qRT-PCR bot die Möglichkeit, Genexpressionsprofile von neuronaler Populationen in verschiedenen biologischen Kontexten 1,2 zu vergleichen. Diese empfindlichen Analysen erfordern die präzise Identifizierung und Isolierung von Zelltypen von Interesse während RNA Integrität 2-4. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik wurde allgemein verwendet, um spezifische Zelltypen, basierend auf Zelloberflächen-Marker und / oder Morphologie zu isolieren. FACS benötigt eine Zellabtrennungsschritt vor der Sortierung, die in einem vollständigen Verlust der räumlichen Auflösung 5 führt. Viele neuronalen Subpopulationen voneinander unterschieden entsprechend ihrer anatomischen Verteilung in the Gehirn. Laser Mikrodissektion auf dünnen Gehirnschnitte angewendet bietet eine geeignete Option für spezifische Isolierung von Zellen mit hoher räumlicher Auflösung 6-8. Eine Hauptbeschränkung von LCM wurde die Notwendigkeit, Zellen von Interesse, basierend auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierenden Reporterproteine ​​genetisch in Tiermodellen entwickelt identifizieren. Die Entwicklung neuer Techniken, um schnell Immunomarkierung Methoden, die RNA-Integrität bewahrt, in Kombination mit LCM durchzuführen, erlaubt nun die Isolierung von Zellpopulationen mit Gen-Profiling-Experimente fort. Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Publikationen 1,9-13 beschrieben. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren zu hochwertigen RNA von einer bestimmten Untergruppe von Zellen in einer komplexen Gewebestruktur durch Kombinieren schnellen Immunmarkierung mit LCM erhalten. Wir zeigen, wie die wichtigsten kritischen Schritte durchführen, um eine maximale RNA-Gewinnung zu erhalten und zu vermeiden RNA-Abbau wie es siglich Auswirkungen Genexpressionsanalysen. Zur Demonstration dieses Protokoll wurden dopaminergen Neuronen von einem Tag alten Maushirn abgezielt. Dopaminergen Neuronen kann mit Hilfe eines gegen Tyrosinhydroxylase (TH) gerichteten Antikörpers, des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms für Dopaminsynthese immunolabeled werden. Nach TH Immunfärbung können einzelne oder Gruppen von dopaminergen Neuronen dann mit LCM isoliert werden. Mikrodissezierten Zellen werden in Lysepuffer gesammelt und RNA wird mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit extrahiert. Qualität und Quantität der RNA extrahiert werden mit einem Bioanalyzer 5 gemessen. Die weitere Analyse der Genexpression mit: RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR kann anschließend durchgeführt 2,4,6 werden. Als ein Beispiel wird ein zweistufiger qRT-PCR von den Laser erfassten isolierten dopaminergen Domänen gezeigt. Die relative Quantifizierung der Expressionsniveaus von zwei dopaminergen Neurons Markergene zeigt die Selektivität dieses Protokolls.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ermöglicht die Isolierung von spezifischen Zellen von Gewebedünnschnitten mit hoher räumlicher Auflösung. Effektive LCM erfordert eine genaue Identifizierung von Zellen-Subpopulationen aus einer heterogenen Gewebe. Identifizierung von Zellen von Interesse hinsichtlich LCM wird normalerweise auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierendes Protein Reporter basiert. Die Kombination von LCM und schnelle Immunomarkierung bietet eine Alternative und effizientes Mittel, um spezifische Zelltypen zu visualisieren und um sie vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Hochwertige RNA kann dann von einer reinen Zellpopulation extrahiert werden und für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR weiterverarbeitet werden. Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Veröffentlichungen beschrieben. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigen, wie eine schnelle Immunmarkierung einer Zellpopulation durchzuführen und dabei RNA Integrität, und wie man diese spezifischen Zellen mit LCM isolieren. Hierin zeigen wird dieses mehrstufigen Verfahrens durch Immunmarkierung und die Erfassung dopaminergen Zellen im Hirngewebe von einem Tage alten Mäusen. Wir heben Taste kritischen Schritte, die besondere Beachtung verdienen. Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Geweben und Zellen von Interesse angepasst werden. Forscher aus verschiedenen Bereichen wird wahrscheinlich von der Demonstration dieses Ansatzes profitieren.

Diese schnelle Immunomarkierung Verfahren ermöglicht die Visualisierung von Zellen von Interesse während RNA Integrität. 1 veranschaulicht die Schritte der Gewebeaufbereitung vor RNA-Extraktion. Nach Kryoschneiden werden dopaminergen Neuronen mit einem gegen die Tyrosin-Hydroxylase gerichteten Antikörper (markierten Neuronen in braun angezeigt) gekennzeichnet. Je nach der experimentellen Frage, können einzelne Zellen oder größere Region von Interesse mit LCM isoliert werden (1D -...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Aufrufe.  Université Laval.  Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren. 

Serie: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Forschung

Biologie

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

RNA Extraktion aus Neuroprecursor Zellen unter Verwendung des Bio-Rad Total RNA Kit

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

Das Utility von Stage-spezifischen Mid-zu-spät<em&gt; Drosophila</em&gt; Follikel Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Laser Capture Microdissection von hochreinen trabekuläre Geflecht aus Maus Augen für Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Ein Laser Capture Microdissection Protocol, das hochwertige RNA aus frisch gefrorenen Mausknochen liefert

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...