Diese Arbeit wird durch R01 NS052532 (um HLH), der Moody-Stiftung und der Abteilung für Anästhesiologie finanziert. Wir danken Laurie Bolding, Christine Courteau Butler und Christy Perry für ihre redaktionelle Hilfe und Christy Perry für Layout und ausgezeichnete Produktion aller Abbildungen, Tabellen und Grafiken.

Ein. Chirurgische Verfahren und Fluid Percussion TBI <ol><li> Alle Tierexperimente werden zunächst vom Institutional Animal Care und Use Committee der University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas und die National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Auflage, National Research Council) genehmigt. </li><li> Rats (erwachsenen männlichen Sprague-Dawley Ratten, 400-500 g von Anbieter Charles Rivers, Portland erhalten, Maine) sind zwei pro Käfig untergebracht und sofern Futter und Wasser ad libitum in einem Vivarium mit diesen konstanten Bedingungen: Licht-Zyklus (600 h bis 1.800 h), die Temperatur (21 ° C bis 23 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40% bis 50%) eine Woche vor der Verwendung. </li><li> Anesthetize Ratten mit 4% Isofluran, intubieren und mechanisch lüften (NEMI Scientific; New England Medical Instruments, Medway, MA) die Ratten mit 1,5-2,0% Isofluran in Sauerstoff: Luft (70:30) und bereiten sie für parasagittal Fluid-Perkussions Verletzungen wie zuvor beschrieben. 8, 10 </li><li> Opfern Ratten im geeigneten Zeitpunkt nach der Verletzung je nach Versuchsanordnung. Schnelles Entfernen Gehirn, frieren sofort auf Trockeneis, und bei -80 ° C in einer 50 ml Tube oder gehen Sie sofort in Oktober für gefrorene Schnitte einbinden. </li></ol> 2. Schneiden und Färben von Rattenhirn <ol><li> Hirngewebe, die nicht sofort benutzt werden können bei -80 ° C für bis zu einen Monat gehalten, wenn bei einer konstanten Temperatur gehalten wird. Brains, die bei -80 ° C sind, dann auf -20 ° C zum Schneiden aufgetaut und dann wieder eingefroren nicht Ertragsqualität RNA nach dem zweiten Auftauen. Sobald das Gehirn wird aufgetaut, montiert in OCT und geschnittene Folien sollte innerhalb von 24 Stunden angefärbt werden und für LCM innerhalb von 30 min bis eine Stunde der Anfärbung. Dadurch wird sichergestellt, gute Qualität RNA. Nach LCM, können erfasst Zellen auf LCM Kappen in Lysepuffer bei -80 ° C werden für bis zu einer Woche gespeichert, sondern RNA sollte in einer angemessenen Weise isoliert werden, um die höchste Qualität zu gewährleisten. &lt;/ Li&gt; <li> Vor dem Schneiden das Gehirn, wischen Sie den Kryostaten mit RNase-Zap und reinigen Sie die Bürsten mit ETOH (ersetzen Sie den Einwegklingenhalter zwischen den einzelnen Gehirn). </li><li> Rufen Sie das Gehirn in der 50 ml Tube aus dem -80 ° C Gefrierschrank; legen Sie es in den Kryostaten bei einer Temperatur von -22 ° C und Tauwetter im Rohr ca. 10 min. Entfernen Sie das Gehirn aus der Tube und Ort auf die Bühne auf Gaze, Bauchseite auf. </li><li> Mit einer Rasierklinge schneiden das Gehirn zu den hinteren Teil des Gehirns nur rostral des Kleinhirns und des vorderen Teils am Chiasma entfernen. Füllen Sie eine cryomold mit Oktober Eindeckmedium (Tissue Tek) und legen das Gehirn in der Form mit der Vorderseite nach unten. Lassen Sie das Hirngewebe in der Eindeckmedium einzufrieren, bis es weiß wird (ca. 10 min). </li><li> Frieren Sie den Probenteller (Tissue Tek) auf das Gehirn mit Oktober Entfernen Sie das Gehirn aus der Form. Legen Sie das Gehirn in der Probe Kopf und die Schrauben festziehen. </li><li> Legen Sie eine Disposalich, low profile Klinge (Fisher Scientific) in den Messerhalter und ziehen Sie die Hebel nach unten. </li><li> Beginnen Aufschneiden des Gehirns auf 20 um, um die äußere Schicht von OCT entfernen. Sobald die Hippocampus-Region erreicht ist, setzen Sie den micron Rad 10. Collect koronalen Schnittserien indem ein Glasträger oder plus-Glasobjektträger auf den Gewebeabschnitt (Fisher Scientific). Objektträger werden bei -20 ° C in einem RNase-free Färbebank erhalten, bis sectioning abgeschlossen ist. </li><li> Um alle RNasen von Glaswaren, wo Gewebeschnitten verarbeitet entfernen, wischen Sie alle Färbung Container und Messzylinder mit Eliminase (Fisher Scientific) und spülen in Milli Q Wasser. Bereiten Sie alle Lösungen mit RNase-freiem Wasser und filtern die Cresylviolett (Sigma-Aldrich) und Fluoro-Jade (Histo-chem) Fleck mit einem 0,2 um Filter vor dem Gebrauch. </li><li> Auftauen Gehirnschnitte bei RT für 30 sec und fixieren in 75% EtOH (1 min). </li><li> Für LCM einzelner verletzten Neuronen nach der Fixierung, spülen Folien in RNase-freiem Wasser (1 min), Mit 1% Cresylviolett (15-20 sec) Gegenfärbung, in RNase-freiem Wasser (2 × 30 sec) Spülen mit Fluoro-Jade (4 min) Fleck, in RNase-freiem Wasser (3 × 1 min) spülen, dehydratisieren mit 95% ETOH von RNase-freies Wasser (30 sec), 100% EtOH (30 sec) und Xylol (2 x 3 min) hergestellt. </li><li> Für LCM von Schwaden von Neuronen nach der Fixierung, spülen Folien in RNase-freiem Wasser (1 min), mit 1% Cresylviolett (1 min) Fleck, in RNase-freiem Wasser spülen (3 × 1 min), mit 95% entwässert EtOH (2 × 30 s), 100% EtOH (2 × 30 s) und Xylol (2 x 3 min). </li><li> Luft trocknen alle Abschnitte in einem Abzug für 15 min vor dem LCM. Slides können gespeichert, Abschnitt Seiten eingerichtet werden, in eine Folie Box mit Trockenmittel gefüttert, wenn sie von Raum zu Raum übertragen werden müssen. Allerdings sind optimale Ergebnisse erzielt werden, wenn LCM wird unmittelbar nach Abschnitten trocken sind durchgeführt. LCM sollte von 30 min bis 1 h begrenzt. Im nächsten Abschnitt beschreiben wir zunächst, wie die kontinuierliche Schwaden von Zellen, die ea ist zu erfassenSiest für diejenigen, die das Erlernen dieser Technik sind zu meistern. Dann werden wir beschreiben, wie genau erfassen einzelnen Neuronen. In unserem Verfahren identifizieren wir sterben Neuronen durch ihre Affinität für Fluoro-Jade-Marker zu verkommen Neuronen. Fluoro-Jade-negativen Zellen vermutet werden überlebenden Neuronen. </li></ol> 3. Laser Capture Mikrodissektion (LCM) LCM von Schwaden von bereichert Populationen von Neuronen im Hippocampus <ol><li> LCM wird unter Verwendung eines Mikroskops PixCell IIe mit einem Infrarot-Diodenlasers (Life Technologies). </li><li> Passen Sie die Mitte des Joysticks, um die vertikale Position. Drehen und verriegeln Sie die 4X Ziel in Position. </li><li> Platzieren einer Folie in der Mitte der dem Mikroskoptisch und manuell einzustellen, bis die Region des Hippocampus in Sicht. Verwenden Grob-und Feintrieb Anpassungen, um das Bild in den Mittelpunkt rücken. </li><li> Aktivieren Sie die Vakuumplatte durch Drücken der Vakuum-Taste auf dem Controller. Drehen und verriegeln Sie die 10X-Objektiv in place. Konzentrieren Sie sich wieder mit Grob-und Feineinstellungen. </li><li> Laden das CapSure Makro LCM Kappen (Life Technologies) in die CapSure Kassettenmodul und Position eine Kappe an der Lastleitung Position. Drehen Sie den Cap Placement Arm und Position um die Kappe. Heben Sie den Cap Placement Arm, um die CapSure Kappe von der Kassette Modul zu entfernen. </li><li> Drehen Sie den Cap Placement Arm über die Rutsche und senken den Arm nach unten über den Objektträger, dies wird die Kappe auf der Folie platzieren. Stellen Sie die Fokussierung und bewegen Sie den Joystick, um zu überprüfen, wenn die Zellen im Inneren des schwarzen Kreises befinden sich auf der Kappe. Alle Zellen erfasst sollte in diesem schwarzen Kreises befinden. </li><li> Stellen Sie die Laserparameter. Drücken Sie zunächst den Laser zu aktivieren Taste auf dem Controller. Der Laser Zielpunkt sichtbar als rosa Punkt im Sichtfeld auf dem Computer-Monitor. </li><li> Gesetzt den Fokusdurchmesser um kleine (7,5 um), um den Laser scharf zu stellen, die Leistung und Dauer auf 65 - 75 mW, für 1,0 bis 2,0 msec für die optimale Zelleinfang benötigt. </li><li> Um test des Lasers, verwenden Sie den Joystick, um den Laserpunkt zu einem Bereich bewegen, wo es keine Zellen zu holen sind. Feuer den Laser mit dem Daumen-Schalter. Verwenden Sie den Joystick, um den Laserpunkt vom geschmolzene Polymer Ort bewegen und prüfen, ob ein sichtbarer dunkler Ring umgibt eine freie Fläche, wo der Laser abgefeuert wurde. </li><li> Um Zellen zu erfassen, verwenden Sie den Joystick, um den Laserpunkt über den Bereich von Zellen zu erfassen bewegen. Feuer den Laser mit dem Daumen-Schalter. Bewegen Sie den Joystick während des Schießens den Laser auf einen großen Bereich von Zellen zu erfassen. Wenn der Laser gezündet wird es schmilzt das thermoplastische Polymerfilm auf der Kappe auf der Oberfläche der Zielzellen. Das Polymer absorbiert die Laserstrahlung, also nicht Verändern der RNA, DNA oder Proteinen Gewährleistung der Integrität der Probe für zukünftige molekulare Anwendungen. </li><li> Nach dem Brennen alle Zellen von Interesse, heben Sie den Cap Placement Arm. Die aufgenommenen Zellen aus dem Gewebe Abschnitt zu trennen und sich an die CapSure Kappe. Die restlichen Gewebe und fehlende Zellen wird visIVK im Sichtfeld. Die Zellen an der Kappe kann auch durch Anordnen der Kappe auf einem leeren Abschnitt des Schlittens betrachtet werden. </li><li> Heben Sie den Cap Placement Arm und drehen Sie es um das Cap Unload Station. Senken Sie den Deckel in die Station und drehen Sie das Cap Placement Arm wieder in seine vorherige Position. </li><li> Schieben Sie die CapSure Einsetzwerkzeug den Bahnsteig entlang und auf der Kappe. Heben Sie das Werkzeug aus der Plattform. Die Kappe bleibt angebracht. Leicht berühren die Kappe auf dem CapSure sauber Pad zu reinigen entfernt unerwünschte Gewebe. </li><li> Setzen Sie die Kappe in eine 0,5 ml RNase-freier Schlauch mit 100 ul Lysepuffer aus dem RNAqueous Micro-Isolation Kit erhalten gefüllt. Unmittelbar Vortex die Kappe für 30 Sek., um die Zellen zu lysieren. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 30 min und Einfrieren bei -80 ° C bis zur RNA-Isolierung. </li></ol> LCM einzelner FJ + Neuronen im Hippocampus <ol start="15"><li> Um einzelne Zellen zu erfassen, laden CapSure HS LCM Mützen in die CapSure Kassettenmodul und positian einer Kappe an der Lastleitung Position. Drehen Sie den Cap Placement arm und positionieren Sie es um die Kappe. Heben Sie den Cap Placement Arm, um die CapSure Kappe von der Kassette Modul zu entfernen. </li><li> Stellen Sie den Laserpunkt zu kleinen (7,5 um), um den Laser scharf zu stellen, die Laserleistung und die Dauer auf 65 -75 mW für 0,45 bis 0,50 ms für eine optimale Zelleinfangbereich von einzelnen Zellen. </li><li> Drehen Sie den Cap Placement Arm über die Rutsche und senken Sie den Arm nach unten in Richtung der Folie. Dadurch wird die Kappe auf dem Objektträger zu platzieren. Die CAPSURE HS cap Oberfläche sitzt der Probe während der LCM erhöht. </li><li> Verwenden Sie den Joystick, um den Laser über einzelne FJ + Zellen zu verschieben. Alle Zellen gefangen müssen in dem kleinen schwarzen Ring auf der Kappe zu sein. Feuer den Laser mit dem Daumen-Schalter. </li><li> Wenn alle Zellen innerhalb des schwarzen Kreises mit dem Laser gebrannt wurden, heben Sie den Cap Placement Arm. Die aufgenommenen Zellen aus dem Gewebe Abschnitt zu trennen und sich an die CapSure HS Kappe. </li><li> Legen Sie eine andere Folie auf dem microsbewältigen Bühne und sammeln FJ +-Zellen, bis der HS cap voll ist. Setzen Sie die Kappe in eine 0,5 ml RNase-freier Schlauch mit 40-50 ul Lysepuffer gefüllt. Unmittelbar Vortex die Kappe für 30 Sek., um die Zellen zu lysieren. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 30 min und Einfrieren bei -80 ° C bis zur RNA-Isolierung. </li></ol> 4. Gesamt-RNA Isolation Von LCM Samples (Dieser Abschnitt wird nur in der Video-Präsentation beschrieben werden) <ol><li> Gesamt-RNA aus Zellen isoliert wird unter Verwendung des Micro RNAqueous-Kit (Ambion) nach den Protokollen des Herstellers. Alle Reagenzien und Waschlösungen sind in diesem Kit zur Verfügung gestellt. Vornässen Mikrofilter Kartuschenanordnung durch Zugabe von 30 ul Lyselösung Puffer in den Filter. Nach 5 min zentrifugieren des Filters für 30 Sekunden bei 10.000 × g zentrifugiert. </li><li> Hinzufügen 3 ul LCM Zusatz zum Probenlysat, um Pipette mischen und Zentrifuge. </li><li> Fügen Sie 52 ul 100% EtOH (1/2 Volumen) auf die Probe Lysat; Pipette zu mischen, und übertragen das Lysat auf den FilterSpalte. </li><li> Zentrifugieren Filtersäule bei 10.000 × g für 1 Minute, um die RNA an die Säule binden. Wenn es mehrere Kappen für ein Probe, drehen jedes Lysat durch die gleichen Spalte getrennt. </li><li> Füllen Sie das RNA-Isolierung Verfahren wie im RNAqueous Micro Kit beschrieben. </li><li> Führen DNase Behandlung und DNase Inaktivierung von LCM-RNA-Proben wie im Kit beschrieben, übertragen die RNA zu einem RNase-freier Schlauch und bei -80 ° C. </li></ol> 5. RNA Quantifizierung und Downstream-Anwendungen Beurteilung der RNA-Qualität und Quantifizierung erfolgt über ein Agilent Bioanalyzer mit Reagenzien aus dem Pico Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. <ol><li> Gesamt-RNA wird auf einem Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) analysiert. Die Software wertet die Konzentration und die Integrität der RNA-Probe durch Zuweisen einer RNA Integrity (RIN) zu jeder Probe reicht fROM 1 bis 10 ist. 1-5 zeigt abgebaut RNA und 7-10 zeigt eine gute Qualität RNA. </li><li> Individuelle TaqMan-Assays oder RT2 Profiler Arrays mit SYBR-Green Chemie; nicht abgebaute intakte RNA wird für Real-Time PCR eingesetzt werden. Die RNA kann auch für mRNA Mikroarray-Analyse und microRNA-Microarray-Analyse eingesetzt werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Das LCM-Technik ermöglicht es uns, bedeutende Fortschritte im Verständnis der molekularen Mechanismen der TBI machen. 8,10,11,12,13 Wir waren die ersten Forscher, um diese Technik zu nutzen, um zu demonstrieren, dass unterschiedliche Teilbereiche des Ratten-Hippocampus Genexpressionsprofile haben, dass korrelieren mit ihrer selektiven Anfälligkeit für Verletzungen. Unsere Studien haben gezeigt, dass wir die Genexpression zu quantifizieren, durch qPCR, von so wenig wie 10 Laser gefangenen Zellen und dass wir genomweiten Microarray-Analyse von so wenig wie 600 eingefangenen Zellen durchzuführen. LCM würde ein wertvolles Werkzeug in ähnlichen Studien von anderen Hirnregionen, die bekanntermaßen in verschiedenen neurologischen und neuropsychiatrischen Erkrankungen beteiligt sein werden. Zum Beispiel haben Studien mit LCM Licht in der Pathogenese des Morbus Parkinson in Dopamin-Neuronen der Substantia nigra, 14 Schuppen und half genomweite Profilierung Studien des Nucleus accumbens, die in Lohn-Schaltungen in s verwickelt beteiligt istubstance abuse Störungen. 15 Neuronal Heterogenität am Genomebene 16 reflektiert und zu den mangelnden Erfolg von experimentellen Behandlungen für TBI in klinischen Studien bei. Daher ist es unser Ziel, diese Technik zu nutzen, um die kritischen Elemente beeinflussen neuronale Überleben nach SHT zu untersuchen. Unsere jüngsten genomweite Profilierung Studie zu sterben und benachbart überlebenden Hippocampusneuronen nach SHT vorgeschlagen, dass eine zelluläre Rheostaten, der das Verhältnis der Expressionsmengen des Zellüberlebens spiegelt zum Zelltod Genen reguliert Zellschicksals nach SHT. Diese laufenden Studien wird auf die Konzeption und Entwicklung von pharmakotherapeutische Strategien positiv beeinflussen können das Überleben der Zelle Rheostat beitragen. Darüber hinaus verwenden wir derzeit LCM zur Verfolgung und Überwachung der Auswirkungen von potentiellen therapeutischen medikamentöse Behandlungen in Hippocampus-Neuronen nach SHT. So zeigen unsere Studien, dass angesichts sorgfältige RNase-freien Umgang mit Techniken und einigeModifikationen von bestehenden Protokollen, ist es möglich, qualitativ hochwertige RNA-Proben aus LCM für genaue quantitative Genexpressionsanalyse erhalten. Allerdings gibt es ein paar Fallstricke mit LCM Techniken verbunden sind. Zum Beispiel kann nur Sammeln neuronalen Zellen ohne Mikroglia Kontamination nahezu unmöglich. Im pyramidenförmigen Zellschicht des Hippocampus wurde geschätzt, dass 95% der Zellen Neuronen mit 90% dieser Population zu Pyramidenzellen und 10% Interneuronen sein, so dass ein kleiner Prozentsatz von Glia und anderen Zelltypen. 8,17 sind, 18 In unseren Studien verwenden wir Fluoro-Jade einen fluoreszierenden Farbstoff, der spezifisch Etiketten nur verletzten Neuronen im Gehirn. Ein anderer Farbstoff, der ein Marker für GFAP ist notwendig wäre Mikroglia färben. 19 Sammeln nur die Fluoro-jade gebeizt einzigen neuronalen Körpern gewährleistet eine homogene Population von Neuronen. Ein weiteres häufiges Problem, dass erfordern Fehlerbehebung kann, ist, dass ein Kreis nicht istt definiert ist, wenn der Laser abgefeuert. Wenn dies auftritt, ist es notwendig, die Laser-Einstellungen prüfen und einstellen Leistung und Dauer wie nötig. Auch ist es wichtig sicherzustellen, dass die Kappe gelegt wird und flach auf das Gewebe vollständig in dem Arm sitzt. Unter Bezugnahme auf die LCM technisches Handbuch oder den technischen Support anrufen wird manchmal notwendig sein. Nach LCM und RNA-Isolation, sollte die Qualität der RNA stets anhand einer Bioanalyzer vor jeder Genexpressionsanalyse werden. Es gibt verschiedene Arten von Laser-Capture-Geräte derzeit auf dem Markt einschließlich Laserschneiden (Life Technologies, Leica Microsystems) und Laser katapultiert (Zeiss) Instrumente. Unsere LCM System funktioniert gut für die Erfassung einer kleinen Anzahl von Zellen. Andere hohem Durchsatz und mehr automatisierte Systeme können besser geeignet zur Gewinnung einer größeren Anzahl von Zellen für genomische und besonders Proteomanalyse. Tatsächlich hat LCM mit diesen automatisierten Systemen ein großes Potenzial für die Analyse von protein Expression in identifizierten Zellen angereichert oder Populationen von Zellen. 20 Weiteren kann LCM erleichtern Genexpressionsanalyse immunmarkierten Zellen, 21 ermöglicht es uns, die Genexpression in definierten Zelltypen zu untersuchen unabhängig von der Komplexität in den heterogenen Geweben. So ist LCM ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Spitzenforschung molekulare Untersuchungen von Einzel-oder angereichert Populationen von Zellen.

Genexpressionsanalyse von heterogenen Gewebe ist seit jeher problematisch;. Dies gilt insbesondere im Gehirn von Säugetieren, die etwa 5.000 verschiedene Zelltypen hat 4 Vor der Entwicklung des Laser Mikrodissektion (LCM)-Technik, genomische Untersuchungen der Wirkungen von TBI in vivo wurden auf der Analyse der Genexpression in einer gemischten Population von Gehirnzellen besteht, nicht nur die verschiedenen neuronalen Zelltypen, sondern auch von Gliazellen und immunmodulatorische tragenden Zellen. Die daraus resultierenden komplexen Genexpressionsprofile aus diesen heterogenen Gewebe erhalten, und die oft widersprüchliche Muster von Verletzungen induzierte zelluläre Signale, mag eine Erklärung für das Scheitern in klinischen Studien am Menschen von therapeutischen Strategien bewährt in vorklinischen Studien der TBI. 5 sein Um ein klares Verständnis der Verletzung-induzierte Genexpression in gefährdeten Populationen von Neuronen zu erhalten aus der Ratte hippocampus, haben wir die Technik der LCM, zuerst von Emmert-Buck et al. 3 Anschließend modifiziert wir dieses Mikrodissektion Technik optimiert für effiziente Erfassung von angereichertem Populationen von Neuronen und einzelnen Neuronen für die mRNA-Profiling mittels quantitativer real-time PCR und Mikroarray-Analyse . Um die Integrität der mRNA in Gefrierschnitten von Hirngewebe für genomische Analyse aufrechtzuerhalten, modifizierten wir bestehende Protokolle zum Fixieren, Färben und schnellen Erfassung von Neuronen aus gefrorenen Rattenhirn Abschnitte. Für die Identifizierung und Isolierung von verletzten und sterbenden Neuronen im Hippocampus wir auch optimierte die Fluoro-Jade Färbetechnik für LCM. Fluoro-Jade nicht zwischen apoptotischen und nekrotischen Zelltod zu unterscheiden. So können alle Arten von degenerierten Neuronen dieses Fleck. 6,7 erkannt werden Hier beschreiben wir das Protokoll in unserem Labor verwendet, um Pools von einzelnen sterben oder überleben Neuronen sowie Schwaden von angereichertem populati erhaltenons von unterschiedlichen neuronalen Zelltypen (zB CA1-CA3 Neuronen zur Genexpressionsanalyse nach SHT). Das Verfahren für Fluid Schlagwerk Hirnverletzung in unserem Labor durchgeführt wird ausführlich in Shimamura et al., 8 beschrieben und ist sehr ähnlich zu der lateralen Fluid-Perkussions-Schädigung Protokoll für Mäuse in JoVE von Alder et al. 9 Da die LCM Technik hat wurde gezeigt, dass eine minimale oder keine Auswirkung auf die Unversehrtheit von DNA haben, RNA und Protein in Gewebe, das ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die molekulare und Proteinanalyse von definierten Zelltypen.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PixCell IIe Laser Capture Microscope</td>
 <td>Life Technologies (Arcturus)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAqueous Micro- Kit</td>
 <td>Life Technologies (Ambion)</td>
 <td>AM1931 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capsure LCM caps</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>LCM0211/LCM0214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoro-Jade</td>
 <td>Histo-chem Inc.</td>
 <td>#1FJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cresyl Violet Acetate</td>
 <td>Sigma-aldrich</td>
 <td>C5042-10G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene (Histological grade)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>X3P-1GAL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
 <td>UTMB pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free barrier pipette tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> 
 <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> 
 <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica DM6000 B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury

Langfristige kognitive Behinderung nach TBI ist mit Verletzung induzierte Neurodegeneration im Hippocampus-Region in einem mittleren Schläfenlappen, die kritisch für das Lernen, Gedächtnis und leitende Funktion zugeordnet ist. 1,2 Daher unseren Studien zur Genexpressionsanalyse von spezifischen neuronalen konzentrieren Populationen in unterschiedlichen Teilbereichen des Hippocampus. Die Technik der Laser Mikrodissektion (LCM), die 1996 von Emmert-Buck eingeführt, et al., 3 hat für signifikante Fortschritte in der Genexpressionsanalyse einzelner Zellen erlaubt und angereichert Populationen von Zellen aus heterogenen Gewebe wie dem Gehirn von Säugetieren, die enthält Tausende von funktionellen Zelltypen. 4 Wir verwenden LCM und ein gut etabliertes Tiermodell für die Schädel-Hirn-Trauma (SHT), um die molekularen Mechanismen, die die Pathogenese der TBI zugrunde zu untersuchen. Nach Fluid-Perkussions-TBI, sind Gehirn zu vorbestimmten Zeiten nach der Verletzung entfernt, sofort auf Trockeneis eingefroren,und zum Schneiden in einem Kryostaten vorbereitet. Die Rattengehirne in Oktober und geschnitten eingebetteten sofort oder gespeicherte mehrere Monate bei -80 ° C vor dem Schneiden für die Laser Mikrodissektion. Darüber hinaus verwenden wir LCM um die Auswirkungen der TBI auf den Tagesrhythmus zu studieren. Dazu erfassen wir Neuronen aus dem suprachiasmatischen Kerne, die die Master Clock des Gehirns von Säugetieren enthalten. Hier zeigen wir die Verwendung von LCM zu bestimmten einzelnen Neuronen (verletzt und degenerierenden, Fluoro-Jade-positive oder unverletzt, Fluoro-Jade-negativ) und angereicherten Populationen von Neuronen im Hippocampus für nachfolgende Genexpressionsanalyse durch Echtzeit-PCR und / r oder Ganzkörper-Microarrays. Diese LCM-fähigen Studien haben gezeigt, dass die selektive Anfälligkeit von anatomisch verschiedene Regionen des Ratten-Hippocampus in den verschiedenen Genexpressionsprofile von unterschiedlichen Populationen von Neuronen durch LCM aus diesen unterschiedlichen Bereichen erzielt werden reflektiert. Die Ergebnisse unserer Single-Cell-Studien, in denenVergleicht man die Transkriptionsprofile zu sterben und benachbart überlebenden Hippocampusneuronen, deuten auf die Existenz eines Zellüberleben Rheostaten, der Zelltod und Überleben reguliert nach SHT.

In unserem ersten LCM Studie konnten wir, dass funktionell unterschiedliche Teilbereiche (CA1 und CA3) des Ratten-Hippocampus zu zeigen Genexpressionsprofile, die ihre Anfälligkeit für TBI. 8 1A-1C reflektieren zeigt Laser-Capture von hippocampalen Pyramidenzellen (CA1- CA3), Gyrus dentatus Neuronen und Neuronen SCN, bevor und nachdem LCM. Saubere Aufnahmen von pyramidal, Granulat oder SCN Neuronen sind jeweils auf die Makro-Kappen gezeigt. 2A-2B veranschaulicht Sterben, Fluoro-Jade positive Pyramidenzellen und Hinterbliebene, Fluoro-Jade negativen Pyramidenzellen vor und nach LCM. Die saubere Erfassung des Sterbens oder überlebenden Neuronen wird durch Betrachten der aufgenommenen Zellen auf den LCM caps gezeigt. Nach LCM, kann die Gesamt-RNA für eine Vielfalt von molekularen Studien einschließlich der quantitativen real-time PCR-Analyse der Genexpression mittels TaqMan-oder SYBR green Chemie (3A), kleine focu verwendet werdensed PCR-Arrays mit SYBR green Sonden (3B) oder Gesamtgenom Mikroarray Studien (3C). <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Abbildung 1. Laser Mikrodissektion an Schwaden definierter Zellpopulationen aus dem Rattenhirn. Gefrorene 10 um Kranzschnitte der Rattenhirn werden in Ethanol fixiert, gefärbt mit einem Farbstoff Nissl (Cresylviolett) und vorbereitet LCM. Es zeigen Bilder der Rattenhippokampus und suprachiasmatischen Kern vor und nach LCM und die eingefangenen Zellen visualisiert auf den Makro Kappen. A. Pyramidale Neuronen aus den CA1-CA3 Teilfeldern des Ratten-Hippocampus. B. Granule Zellen in der hippocampalen. C. Bilaterale suprachiasmatischen Kerne zu beiden Seiten des dritten Ventrikelsund oberhalb der Sehnervenkreuzung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Abbildung 2. Laser Mikrodissektion einzelner Neuronen von Ratten Hippocampus. Dargestellt sind A. degenerieren, Fluoro-Jade-positive (gebeizt) hippocampalen CA3 Neuronen und B. Surviving, Fluoro-Jade-negative (ungefärbten) CA3 Neuronen vor und nach LCM. Eingefangenen Zellen visualisiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Genexpressionsanalysen von Gesamt-RNA aus dem Laser erfasst Neuronen isoliert. A. Quantitative real-time PCR Daten circadianen Uhr Genexpression in SCN. B. Heatmap der Genexpression im Sterben und Überleben Hippocampusneuronen zeigt Expression von Apoptose-Gene mit fokussierten PCR-Arrays . C. Agilent gesamten Genoms Mikroarray-Analyse der Genexpression in hippocampalen CA1-CA3 Neuronen von Ratten, die Schein-Verletzung erhalten, TBI oder TBI zuzüglich eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus siRNA zur Knockdown Expression von Genen durch Hirnverletzung (neuronaler Stickstoffmonoxid induzierten Synthase und Glutathionperoxidase-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Wir beschreiben, wie der Laser-Mikrodissektion (LCM) verwenden, um angereichert Populationen von Neuronen im Hippocampus oder einzelne Neuronen aus Gefrierschnitten der Verletzten Rattenhirn für nachfolgende Genexpressionsanalyse mittels quantitativer real-time PCR und / oder des gesamten Genoms Microarrays erhalten.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

laser-capture-microdissection-enriched-populations-neurons-or-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.1K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Wir beschreiben, wie der Laser-Mikrodissektion (LCM) verwenden, um angereichert Populationen von Neuronen im Hippocampus oder einzelne Neuronen aus Gefrierschnitten der Verletzten Rattenhirn für nachfolgende Genexpressionsanalyse mittels quantitativer real-time PCR und / oder des gesamten Genoms Microarrays erhalten.

Serie: Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Riechzellen durch nasale Biopsie Combined Erhalten mit Laser-Mikrodissektion: Ein möglicher Ansatz zum Behandlungserfolg bei Mental Disorders Studieren

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neurone von Frische und Gefrorene Rattenhirngewebe

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.