Alle Autoren erkennen die Infrastruktur Unterstützung der NHMRC CTC, University of Sydney, der Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australien und den Rebecca Cooper Foundation, Australien. Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Australian Research Council (FT110100254) und der JDRF, Australien (CRN201314) finanziert, um WW, RJF AAH und MVJ durchgeführt alle Nasslabor Experimente durchgeführt ASJ Datenanalyse. WW schrieb den ersten Entwurf. AAH geplant das Studium und die Daten analysiert. Alle Autoren lesen und einigten sich auf die endgültige Fassung der Handschrift, Zahlen und Arbeitsblätter zur Veröffentlichung eingereicht.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li><li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens.">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta, ., V, M., Joglekar, M. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

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Die kritischen Schritte innerhalb der Sonde qPCR-basierte Protokolle, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, sind Sie sicher, dass es 1) das gleiche Volumen und die Konzentration der RT-Produkt wird in jedem qPCR Reaktions geladen, 2) die richtigen Verhältnisse und Mengen der Komponenten benötigt qPCR Reaktion vorbereitet und gut gemischt, 3) die korrekte und einheitliche Volumina sind miteinander qPCR Reaktion gegeben, und 4) die Vorbereitung und Laden von jeder Probe und Reaktionsgemisch wird in kürzester Zeit wie möglich durchgeführt, während immer noch darauf achten, die obigen kritischen Schritte bereits erwähnt. Die Mikrofluidik Array Karten müssen geeignete Zentrifuge und spezifische Eimer. Jede Schaufel kann bis zu 3 Karten (beladen / leer) zu halten. Achten Sie immer darauf, dass alle 3 Slots eines Becher belegt sind und die Schaufel, indem ähnliche Eimer (Eimer dies sollte auch 3 Karten, entweder leer oder voll enthalten) in die entgegengesetzte Schlitz der Zentrifuge ausgeglichen. Beim Aufsetzen der Karte in der bucket Halter, stellen Sie sicher, dass die 8 Stauseen projizieren nach oben und Reaktionsfeldern vor der Außenwand der Zentrifuge. Dreh die Karten bei 331 × g für 1 min bei Raumtemperatur. Nach dem ersten Durchlauf, öffnen Sie die Zentrifuge und optisch sicher, dass die Reaktionsmischung wurde durch die 384 Vertiefungen verzichtet. Wiederholen Sie den Spin bei gleichen Einstellungen für ein weiteres Mal. Entfernen Sie die Karte aus Eimer und sicherzustellen, dass das Niveau der Reaktionsmischung in jedem der acht Stauseen einheitlich ist. Etwaige Unstimmigkeiten bei den in den Behältern links Flüssigkeitsvolumen machen die Karte ungeeignet zum weiteren Gebrauch. Um die gleiche Konzentration der RT-Produkt haben, wird dieselbe Eingangskonzentration von RNA in jedem RT-Reaktion gegeben. Die Gesamt-RNA-Konzentration wird unter Verwendung eines Mikro volumespectrophotometer gemessen. Die beobachtete 260/280 Verhältnis so niedrig wie 1.3 für die RNA aus Plasma / Serum isoliert werden; dies scheint nicht zu wirken auf den nachgelagerten qPCR bezogene Verfahren oder Daten erzeugt 30. Ebenso ist die 260/280 Verhältnisdie hier getesteten RNA-Proben lagen zwischen 1,3 bis 1,7 ohne abnormale Effekte in der qPCR beobachtet. Bei Verwendung einer geringen Gehalt an RNA-Proben, wie die aus biologischen Flüssigkeiten, kann es schwierig werden, um RNA vor der Verarbeitung zu quantifizieren. Wir empfehlen die Verwendung von synthetischen Spike-in an der RNA-Isolierung sowie die reverse Transkription Stufen. Nach unserer Erfahrung Arabidopsis thaliana miRNA-Kandidaten (ath-miR-159a und ath-miR-172a) über Caenorhabditis elegans miRNAs (wie cel-miR-39 oder cel-miR-54), die in unserer Erfahrung können höher sind bevorzugt Homologie als die von A. thaliana. Die Verwendung einer solchen stufenspezifischen Spike-in kann für die Normalisierung der miRNA Daten über mehrere Proben zu verschiedenen Zeitpunkten getestet ausmachen. Mit einem festen Eingangslautstärke von RNA für die cDNA-Synthese-Reaktion wird auch empfohlen 32,33. Die drei Sonden-basierte Protokolle für miRNA Quantifizierung hier beschriebenen erfordern unterschiedliche MengenGesamt-RNA-Eingang, unterschiedliche Workflows und Kosten. Jeder der Abläufe sind entworfen, um unterschiedliche Durchsätze, basierend auf der Anzahl der miRNA und der Anzahl der zu analysierenden Proben zu bieten. Mit zunehmendem Durchsatz (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), die Kosten pro Reaktion mit einer Zunahme in der Menge an Daten über eine Zeiteinheit erhalten wird. Da alle diese Plattformen nutzen TaqMan Chemie, kann die Qualität der erhaltenen Daten erwartungsgemäß ähnlich sein werden. TaqMan qPCR ist ein etabliertes Verfahren zur Identifizierung der Fülle von miRNAs im Serum / Plasma Proben 9,11,27. Obwohl die drei Plattformen hier diskutierten dieselbe Chemie, eine Abnahme der Reaktionsvolumen führt zu einer Verringerung des dynamischen Bereichs des Transkripts Detektion (Farr RJ et al., Unveröffentlichte Daten). Der 96-Loch-qPCR-Plattform ist eine geringeren Durchsatz, aber hohe Empfindlichkeit Plattform und unserer Ansicht nach der &quot;Goldstandard&quot; für alle sondenbasierten (oder dye based) PCR-Plattformen. Dies kann jedochdie wirtschaftlichste und effiziente Plattform nicht sein, wenn mehrere Hundert oder Tausende von Proben, die untersucht und für mehrere microRNAs. Mikrofluidik (TLDA) und nanofluidics (OA) Plattformen mit hohem Durchsatz / Content-Plattformen zur Akquisition von größeren Daten in kürzerer Zeit zu ermöglichen. Obwohl Chargenunterschiede wurden in den TLDA Karten beobachtet worden ist, kann diese durch Anfordern TLDA Karten aus dem gleichen Ansatz minimiert werden. Wir beobachten, dass TLDA Plattform (Abbildung 3) zeigten signifikante Unterschiede in 17% der Mitte - geringe Häufigkeit miRNAs bei der Prüfung mit dem gleichen Probe auf unterschiedliche Chargen TLDA Karten. Wir empfehlen daher die gleichen Chargennummern für die Analyse mit TLDA Karten. Diese Variante könnte auch aufgrund der technischen Variabilität inklusive eventueller Beladung und Pipettierfehlern sein. Wir empfehlen jedoch, Bestellung / Anforderung der gleichen Charge von TLDA Karten. Keine signifikante Batch-Variante wurde auf die OA-Plattform beobachtet. Trotzdem TaqMan basierend experimental qPCR nähert Angebot Leichtigkeit, um die Fülle von miRNAs im Plasma / Serum Proben zu messen. Die niedrigen, mittleren und hohen Durchsatz Ansätze hier nicht an die Flexibilität, um eine Reihe von Proben und miRNAs mit einem hocheffiziente, reproduzierbare und sauber (geringem Hintergrundrauschen) Chemie analysieren.

Mikro-RNAs (miRNAs) sind ~ 22 Nukleotid nicht-kodierenden (NC-) RNAs, die als Regulatoren der Genexpression 1-3. Die meisten miRNAs bei Tieren funktionieren durch sequenzspezifische Basenpaarung mit einer mRNA, zur Förderung der 3&#39;-UTR, die negative Regulation der Genexpression 2-4 führt. Dies erfolgt in der Regel über eine Hemmung der mRNA-Translation oder durch ribosomale Drop-off. miRNAs Umlauf ist gezeigt worden, Biomarkern in Forschungs- und klinischen Gebieten für eine Vielzahl von Krankheiten, wie Diabetes 5-7, Eierstock- 8, 9 Prostata und Brustkrebs 10,11, Hepatitis B 12 und anderen Autoimmunerkrankungen 13 sein. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um reichlich miRNAs in verschiedenen Zellen oder Gewebe zu identifizieren, ebenso wie im Umlauf aus menschlichem Plasma und Serumproben, die besser zugänglich und weniger invasiv ist 9,11-15. Verschiedene Methoden der miRNA Quantifizierung wurden established mit mehreren Plattformen, wie beispielsweise die Standard-96-Well-Platte Plattform 4,12,16-18, der Mikrofluidik Kartenplattform 12,18-23 und der Nanofluidik Array-Plattform 17,24. Quantitative real-time PCR (qPCR) bietet die Möglichkeit, relative oder absolute Zahl der Transkripte Messung mit mehreren (Farbstoff- oder Sonde-basierte) Chemie. Sonde-basierte Echtzeit-PCR-Chemie bietet den Vorteil der niedrigen Hintergrundfluoreszenz und eine hohe Empfindlichkeit, eine einzige Abschrift Kopie zu erkennen. Es ist relativ kostengünstig, einfach zu bedienen und sehr gut reproduzierbar, so dass es eine bevorzugte Methode zur Quantifizierung und Bestimmung miRNA-Expression 25. Probe qPCR-basierte Verfahren umfasst im Allgemeinen zwei Schritte: die reverse Transkription (RT) und qPCR 4,26,27. RT ist, wo der Stamm-Schleifen-RT-Primer an einem reifen oder primären miRNA-Molekül hybridisiert und komplementären (c) DNA umgewandelt. Quantifizierung der cDNA-Produkt wird dann unter Verwendung miRNA-spezifischen PCR Primern26-28. Das Prinzip der sondenbasierten qPCR basiert auf dem Nachweis von Komplementärstrangverlängerung in Echtzeit, was die Hydrolyse des fluoreszenzmarkierten Sonde beinhaltet bezogen. Diese Sonden wurden entwickelt, um einen fluoreszierenden Reporter und einen Quencher, die nur voneinander entfernt sind, um FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) erlauben. Detektion der Emission von der Fluoreszenzreporter (Emitter) von der Nähe des Löschermolekül maskiert. Wenn Taq-Polymerase (pol) sich von der Stromaufwärts-Primer und erreicht eine Gabel (das 5&#39;-Ende der Sonde), hydrolysiert das Taq Pol-Exonukleaseaktivität der Sonde, was zu einer physikalischen Dissoziations / Trennung des fluoreszierenden Emitters vom Quencher. Diese Version von einem einzigen Molekül Fluoreszenzemitter wird durch den Detektor erfasst und als eine inkrementelle Erhöhung des Fluoreszenzsignals von diesem gut / Reaktions dargestellt. Der Anstieg in der Fluoreszenz ist proportional zu der Menge an PCR-Produkt erzeugt wird, so dass eine genaue quantification des amplifizierten Ziel 26,28. Mit zunehmender Nachfrage miRNA Quantifizierung mittlere bis hohe Durchsatz-Technologien wurden entwickelt, damit eine größere Anzahl von Proben in einer kurzen Zeit verarbeitet werden. TaqMan Low Density Array (TLDA) ist ein mittelDurch innovative mikrofluidische Design auf Sondenbasis qPCR Chemie bietet eine Erhöhung der Zahl von miRNAs auf einer Platte analysiert. TLDA beinhalten die Verwendung eines vorgegebenen Pool von RT-Primer, die verwendet werden, um die cDNA zu synthetisieren. Diese cDNAs werden anschließend in einen kunden 384er mikrofluidischer Karte gesponnen, um die Expression mehrerer miRNAs mittels qPCR 22,26,29 bestimmen. Jede Vertiefung der Karte enthält getrockneten Primer und Sonden zur spezifischen miRNA (en) zu verstärken, also bis zu 384 Reaktionen können in Einzel TLDA Karte 26 verarbeitet werden. Die nanofluidics Array ein Hochdurchsatz-Plattform, die zum Nachweis von Gen-Transkripte verwendet wird <sup&gt; 24 unter Verwendung der gleichen Sonde basierenden Chemie. Es nutzt eine proprietäre Matrix mit hydrophoben hydrophilen Wechselwirkungen einfache Laden der 33 Nanoliter-Reaktionsmischung in einer Anordnung von 3072 Durchgangslöcher auf einem Edelstahl-Schlitten 24 zu erleichtern. Dieser Artikel befasst sich zeigen, wie diese Methoden zur Quantifizierung von miRNAs im Serum / Plasma durchgeführt werden und die kritischen Faktoren, die berücksichtigt werden müssen bei der Durchführung und Interpretation dieser Daten. Getroffen, um Konto, werden ihre individuellen Vor- und Nachteile in diesem Artikel beschrieben werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

Sondenbasierten quantitative PCR (qPCR) ist ein bevorzugtes Verfahren zum Messen Transkript Fluss, da es eines der am meisten empfindlichen Nachweisverfahren, die eine genaue und reproduzierbare Analyse liefert. Sondenbasierte Chemie bietet den geringsten Grundfluoreszenz im Vergleich zu anderen (Farbstoff) Chemien. Gegenwärtig gibt es verschiedene Betriebssysteme, dass die Verwendung sondenbasierte Chemie Transkript Fluss zu quantifizieren. qPCR in einer 96-Well-Platte ist die routinemßig verwendete Verfahren ist jedoch nur ein Maximum von 96 Proben oder miRNAs kann in einem einzigen Durchlauf getestet werden. Dies ist zeitraubend und mühsam, wenn eine große Anzahl von Proben / miRNAs analysiert werden. Hochdurchsondenbasierten Plattformen wie Mikrofluidik (zB TaqMan Array Card) und nanofluidics Arrays (zB Openarray) bieten eine einfache reproduzierbar und effizient die Fülle von mehreren mikroRNAs detektieren in einer großen Anzahl von Proben in einer kurzen Zeit. Hier zeigen wir, den Versuchsaufbau einnd Protokoll für die miRNA-Quantifizierung von Serum oder Plasma-EDTA-Proben, mit Sonde-basierte Chemie und drei verschiedenen Plattformen (96-Well-Platte, Mikrofluidik und Nanofluidik Arrays) mit steigendem Durchsatz.

Die empfohlene Volumen für eine miRNA-Sonde-basierte Assays qPCR Reaktion ist 20 ul. Anmerkung: Wir haben bestätigt, dass ein Reaktionsvolumen von 5 ul der Lage ist, ähnliche Ergebnisse wie die unter Verwendung von 20 ul Volumen 4,7,30 erreicht herzustellen. Absenken des Reaktionsvolumen auf 5 ul ermöglicht eine 75% ige Abnahme der Kosten für Reagenzien, ohne merklichen Verlust der Empfindlichkeit. Wie in Abbildung 2 dargestellt, Reaktionsvolumen von 20 ul und 5 ul zeigen eine starke Co-Verhältnis bis 39 Zyklen (mit r 2 von 0,92, p = 0,0002). Mikrofluidik Array stellt ein Werkzeug zur Gewinnung von Daten über 754 miRNAs in einer Probe in etwa 5 Stunden (für Karte A und die Karte B), die eine effizientere Methode zur Analyse mehrerer Proben im Vergleich zu herkömmlichen Platte mit 96 Vertiefungen PCR ist ausgedrückt. Wir verglichen miRNA Mikrofluidik Array Karten für die gleiche Probe (Probe A und Probe A Wiederholung) 3A -. B zeigt eine Bland-Altman-Plot (&lt;strong&gt; 3A) und Korrelation Grundstück (3B) für alle 754 miRNAs für diese Proben getestet. Es gibt 3 verschiedene Steuer miRNAs (U6, RNU44 und RNU48) nach dem Zufallsprinzip auf beiden Karten (Karten A und B) an verschiedenen Standorten platziert. Wenn Werte U6 Zyklus Schwelle (Ct) zwischen den 2 läuft im Vergleich haben wir nicht beobachten, signifikante Unterschiede zwischen den Werten (Tabelle 4). Es ist auch wichtig zu beachten, dass U6 ist in größerer Fülle (niedrigere Ct-Wert) in der Probe beurteilt ausgedrückt. Dann verglichen wir alle miRNAs, die Ct-Werte in beiden Läufen (n = 150) haben zwischen 0-19,99, die ähnlich Ausdruck miRNAs insgesamt mit einem Koeffizient der Bestimmung von 98% (3C-D) hatte. Von allen 277 miRNAs, die Ct-Werte zwischen 20 und 29.99 in den beiden Läufen haben, unterschieden sich 16 miRs deutlich zwischen den ursprünglichen und wiederholen Läufe (3E - F) Die Zahl der miRNAs mit signifikanten Unterschied zwische.n die Durchläufe erhöht (89 von 327), wenn die Ct-Werte wurden zwischen 30-40 für beide Läufe (Abbildung 3G - H) ausgewählt. Die nanofluidics Array Plattform liefert die Daten für 754 miRNAs von jedem Serum / Plasma-Probe getestet, wie in 4A dargestellt ist es wichtig, diese Verstärkungskurven zu untersuchen. - Wie es bei allen qPCR - sicherzustellen, dass das Ergebnis anzeigt wahre Verstärkung. Jedes der 48 Untergruppen (Abbildung 1) enthält auch einen Test für die drei beliebtesten &quot;Hauswirtschaft&quot; ncRNAs. U6, RNU44 und RNU48 4B veranschaulicht eine typische Clustering von U6 repliziert aus einer einzigen Probe. Diese Wiederholungen anzuzeigen niedrige Standardabweichung (SD &lt;0,5) und so sind ein Indikator für die Zuverlässigkeit. Alternativ 4C zeigt die erhöhte Variabilität U6 Replikate (SD&gt; 0.5) in einer zweiten Probe. Dies schließt nicht die Gültigkeit o negierenf die übrigen Tests, obwohl es notwendig eine gründliche Kritik. U6, wie bei den meisten &quot;Hauswirtschaft&quot; miRNAs in biologischen Flüssigkeiten, können eine Variable Ausdruck haben. Es sei darauf hingewiesen, daß eine der Proben, in 4C skizziert, wird 4-fach weniger U6 Gehalt als die in Figur 4B dargestellt. Da die Höhe der U6 in Probe in 4C dargestellt ist, 75% weniger als mit der, in der Platte 4B dargestellt zu beginnen, wird eine verstärkte technische Variabilität aufgrund der Poisson-Verteilung von Transkripten, die von der kleinen Reaktionsvolumen 17 verstärkt wird erwartet. Ein weiteres nützliches Tool ist die Qualitätskontrolle (QC) Bilder, für den Export zur Verfügung, sobald der Lauf beendet ist. Eine Auswahl davon ist der Fluoreszenz von ROX, der passive Farbstoff in der qPCR Reagenzgemisch gefunden, um zu bestätigen, dass jedes Durchgangsloch wurde korrekt (Abbildung 5) geladen. Ein Durchgangsloch oder gar ein eigenes<html> Reifen Subarray kann nicht geladen werden aufgrund einer unzureichenden Probenvolumen, Verdampfung, in die Vertiefungen der 384er-Probenplatte, Versagen der Probe Plattendichtung, oder Defekte in dem Accufill Systems oder seiner Spitzen vollständig entfernen vorliegende Blasen. Jede entladen Durchgangsbohrungen müssen identifiziert werden, um die Kennzeichnung miRNAs als &quot;nicht nachweisbar&quot;, zu vermeiden, wenn in Wirklichkeit der Test wurde nicht geladen. Wenn dieses Problem auftritt, zu bestätigen, dass mindestens 5 &amp; mgr; l Probe / Mastermix in jedem Well der 384-well-Probenplatte geladen wird, die Probenplatte ordnungsgemäß vor der Beladung zentrifugiert, ist die Siegelfolie vollständig entfernt, und die beladene Openarray Schieber verschlossen und innerhalb der vorgegebenen Zeit für alle aufeinanderfolgenden Durchläufen ausführen. Wenn Lade Problem nicht beseitigen, können diese werden eher die sich auf bestimmte Partie oder des Loses der Arrays oder ähnlichen Verbrauchsmaterial und weitere Unterstützung sollte durch den Hersteller eingeholt werden. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52.586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Layout von Proben für die Nanofluidik Array-Workflow: (A) Jeder 384-Well-Probenteller können Proben für bis zu 8 Nanofluidik Arrays zu halten. (B) Verwässert ist vorverstärkt cDNA in 8 Vertiefungen (2 Spalten von 4 Zeilen) in benachbarten 8-Well-Gruppen gelegt, mit Pool A und Pool B. Jeder Kreis steht für eine gut. (C) Jede Vertiefung der Probenplatte wird zu einem Unterfeld des Nanofluidik Array geladen werden. Jedes kleine Quadrat stellt einen Teilfeld. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Abbildung 2: Co-Verhältnis-Analyse für konventionelle 96-well PCR-Plattformen: Co-Verhältnis von 20 ul und 5 ul Reaktionsvolumina auf TaqMan Real-time qPCR mit einem Standard-96-Well-Platte-Plattform in CT-Werte (39 Zyklen). Wir verglichen 4 verschiedene microRNAs (miR-375, miR-30c, 30d und miR-miR-7) in 4 verschiedenen menschlichen Serum- und Plasmaproben. Nur 11 Datenpunkte aufgezeichnet, da die anderen waren nicht nachweisbar. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Abbildung 3: Die Umlauf miRNA Profiling mit Mikrofluidik Array Karten Mit 2 Mikrofluidik-Karten (Karten-A und-B-Karte), ein Profil von 754 miRNAs erzeugt (A - B). Wie hier gezeigt, haben wir dieselbe Probe für 2 Mikrofluidik Array läuft, um die Reproduzierbarkeit der Mikrofluidik Karte Ergebnisse zu überprüfen. Wir beobachteten einen ähnlichen Ausdruck miRNAs insgesamt mit Ct-Werten zwischen 0 bis 19,99 (C - D). Es gibt nur wenige miRNAs (16 von 277) mit Ct-Werten zwischen 20 bis 29,99 und signifikante Unterschiede zwischen den Wiederholungsläufe (E - F). Achtzig neun von 327microRNAs mit höheren Ct-Werte (30-40) zeigten signifikante Unterschiede zwischen den beiden Durchgängen (G - H). &#160; Die Daten werden mit Hilfe gepaart T-Test analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Abbildung 4: Vertreter Profil von PCR-Produkt Amplifikationskurven: Ist eine repräsentative Figur der kombinierten (A) Amplifikationskurven aller miRNA Ziele für eine menschliche Plasmaprobe. Ein Test auf U6 (eine gemeinsame Steuer ncRNA) ist in jedem Unterfeld platziert. Die Probe in (B) zeigt eine geringe Variabilität (SD &lt;0,5), während (C) zeigt eine hohe Standardabweichung (SD&gt; 0,5) innerhalb U6 repliziert. Beide Proben sind total RNA aus menschlichem Plasma isoliert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Abbildung 5: QC Analyse Nanofluidik Arrays: Qualitätskontrolle (QC) Bilder einer richtig eingelegt Nanofluidik Array (links) und einer falsch eingelegt Nanofluidik Array (rechts). Die passive Farbstoff ROX (in der qPCR Reagenzienmix vorhanden), fluoresziert, um eine korrekt geladen Durchgangsbohrung angeben. Die Anordnung auf der rechten Seite hat mehrere Subarrays / Durchgangslöcher, die nicht mit der qPCR Reagenzgemisch geladen werden, und diese sollten als falsch-negative PCR-Reaktionen identifiziert werden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro 5 ul-Reaktion (ul) </td></tr&gt; <tr><td> RT-Puffer (10x) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Reverse-Transkriptase- </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1A: RT Reagenzienmischung Komponenten in einer 5 &amp; mgr; l RT-Reaktionsvorbereitung TaqMan Echtzeit qPCR unter Verwendung eines Standard-96-Well-Platte-Plattform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro 5 ul-Reaktion (ul) </td><td> Volumen pro 20 ul Reaktions (ul) </td></tr><tr><td> Schnelle PCR-Mastermix (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR Assay (20x) * </td><td> 0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nuklease-freiesWasser </td><td> 1,45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen: </td><td> 4.2 </td><td> 16,8 </td></tr></tbody></table> * Testkomponente auf Grundlage des ausgewählten miRNA getestet. Tabelle 1B: qPCR Reagenzienmix Komponenten in einem 5 oder 20 &amp; mgr; qPCR Reaktionsansatz für TaqMan Real-time qPCR mit einem Standard-96-Well-Platte Plattform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTPs mit dTTP (100 mM) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT-Puffer </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / ul) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Nuklease-freiem Wasser </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2A: RT Reagenzienmix Komponenten in einer 5 ul RT-Reaktion Vorbereitung TLDA miRNA-Panel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2B: PreAmp Reagenzienmix Komponenten in einem 25 &amp; mgr; pre-Amplifikation Reaktions Vorbereitung TLDA miRNA-Panel. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTPs mit dTTP (100 mM) </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT-Puffer </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20 U / ul) </td><td> 0,09 </td></tr><tr><td> Nuklease-freiem Wasser </td><td> 0,35 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3A: RT Reagenzienmix Komponenten in einer 5 ul RT-Reaktion Vorbereitung sondenbasierten Nanofluidik miRNA-Panel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Komponentes </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3B:. PreAmp Reagenzienmix Komponenten in einem 25 &amp; mgr; pre-Amplifikation Reaktionsansatz für sondenbasierten Nanofluidik miRNA Platte HINWEIS: Die interaktive Zusatz Excel-Tabellen für die drei Plattformen zur Verfügung gestellt, die bereits einen Anteil von 5% zusätzlich zu zum Pipettieren Fehler zu kompensieren. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Probe A </td><td> Probe A wiederholen </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Die Umlauf miRNA U6 Profilerstellung mithilfe der Mikrofluidik Array Karte. Mit zwei Array Mikrofluidik-Karten (A und B). Ct-Werte U6 Steuer miRNA aus Probe A (insgesamt = 8). Konsequente U6 Steuer miRNA Fluss zwischen den Läufen beobachtet.

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Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K Aufrufe.  The University of Sydney.  Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren. 

Serie: Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Experimentelle Ansätze zur Tissue Engineering

Forschung

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...