Wir erkennen Justin Pinkney und Johannes Hohlbein für die Hilfe bei der Konstruktion des Mikroskops und maßgeschneiderte Seamus Holden für die Lokalisierung Software. Rodrigo Reyes-Lamothe wird für die Bereitstellung der E. dankte coli-Stamm. Die Forschung wurde von der Europäischen Kommission Siebten Rahmenprogramms Zuschuss FP7/2007-2013 HEALTH-F4-2008-201418, UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council Grants BB/H01795X/1 und des Europäischen Forschungsrates 261.227 Zuschuss zu ANK finanziert. DJS wurde durch ein Wellcome-Trust-Programm WT083469 Zuschuss finanziert. SU wurde durch ein Promotionsstipendium MathWorks unterstützt.

1. Zellkultur Verwenden Sie sterile Kulturgefäße und Pipettenspitzen. Die E. coli-Stamms AB1157 polA-PAmCherry trägt eine C-terminale Fusion PAmCherry Pol1. Die Fusion wurde in der nativen chromosomale Lage durch den Austausch des Wildtyp-Gen mit Lambda-Red-Rekombination wie in Datsenko et al eingefügt. 8 Funktionalität des Fusionsproteins wurde bestätigt, wie durch zelluläre Wachstumsraten und Sensibilität für die DNA-schädigenden Mittel Methyl beurteilt Methansulfonat (MMS). Mehr Informationen über Bau der Zellstamm in Uphoff et al. 7 zu finden, Datsenko et al. 8 und Reyes-Lamothe et al. 9 Zellkulturen werden in M9-Minimalmedium gezüchtet, um Autofluoreszenz zu verringern und zu vermeiden Hintergrund Partikel auf dem Objektträger. Alternativ kann eine nährstoffreiche definierten Medium 10 verwendet werden. <ol><li> Streak die E. coli-Stamm AB1157 polA-PAmCherry aus einem gefrorenen Glycerin Lager auf einem Luria Broth (LB) Agarose-Platte mit selektiven Antibiotika (hier 25 ug / ml Kanamycin) und bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Impfen eine 5 ml LB-Kultur aus einer einzigen Zellkolonie und wachsen bei 37 ° C bei 220 rpm für 3 h Schütteln. </li><li> Verdünnte die Kultur 1:10.000 in 5 ml Minimalmedium (M9-Medium, MEM + Aminosäuren Prolin, MEM-Vitamine, 0,2% Glycerin) und bei 37 ° C unter Schütteln bei 220 UpM über Nacht. </li><li> Am folgenden Morgen, messen Sie die optische Dichte (OD) mit einem Spektralphotometer und verdünnte die Kultur in 5 ml frischem Minimalmedium OD 0,025. Wachsen für 2 Stunden bei 37 ° C unter Schütteln bei 220 rpm bis frühen exponentiellen Phase (OD 0,1). </li><li> Konzentrat 1 ml der Zellen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 2.300 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 20 ul restliches Medium und Wirbel. </li></ol> 2. Objektträger PreparatIon <ol><li> Bereiten Sie eine 1,5%-Nieder Fluoreszenz Agarose-Lösung in dH 2 O. Verwenden Sie eine Mikrowelle, um die Agarose zu schmelzen, bis die Lösung klar ist. Mischungs 500 ul der geschmolzenen Agarose-Lösung mit 500 ul 2x Minimalmedium durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren ein paar Mal. </li><li> Verbreiten Sie die Agarose-Lösung gleichmäßig auf die Mitte eines Mikroskopdeckglas (Nein 1.5 Dicke). Das muss schnell geschehen, bevor die Agarose kühlt, Vermeidung von Blasen. </li><li> Glätten Sie das Pad mit einem zweiten Deckglas (Nein 1.5 Dicke). Um die Hintergrund-Fluoreszenz-Partikel zu entfernen, Deckgläser wurden in einem Ofen bei 500 ° C für 1 Stunde gebrannt. Verbrannt Deck kann Wochen bei Raumtemperatur in Aluminiumfolie abgedeckt gelagert werden. </li><li> Für die DNA-Schäden Experimente, bereiten eine Agarose-Pad, die 100 mM MMS. Die nächsten Schritte in den Schritten 2.1-2.3, sondern fügen 8,3 ul MMS 500 &amp;mgr; l M9-Medium vor dem Mischen mit 500 ul 1,5% geschmolzener Agarose, für eine Endkonzentration von 100 mM MMS. (Achtung! MMS ist giftig und erbgutverändernde und muss mit Handschuhen, Maske, Schutzbrille und Labormantel behandelt werden). </li><li> Entfernen Sie die obere Folie aus dem Pad und fügen 1 ul konzentrierte Zellsuspension auf dem Pad. Immobilisieren die Zellen durch Abdecken der Unterlage mit einem unbenutzten verbrannt Deckglas (Dicke Nein 1.5, passend zu den Mikroskop-Objektiv-Spezifikation) und durch Drücken ganz sanft auf der Folie. Zellen sollten innerhalb von 45 min der Immobilisierung vor den Agarose-Pad trocknet abgebildet werden. Um bei längeren Trocknungsversuche zu verhindern, können Agarose-Pads mit Silikondichtungen abgedichtet werden. </li><li> Für DNA-Schädigung Experimenten inkubiert Zellen auf dem Agarose-Pad, enthaltend 100 mM MMS für 20 min in einer Feuchtekammer bei Raumtemperatur vor der Abbildung immobilisiert. </li></ol> 3. Vorbereiten Mikroskopie Datenerfassung PALM beruht auf der Erkennung und genaue Lokalisation von einzelnen fluoreszierenden Proteinen. Die Empfindlichkeit und optimale Ausrichtungdas Mikroskop ist entscheidend für die Qualität der Daten. Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskope verwenden typischerweise Total Internal Reflection (TIR) ​​Beleuchtung, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch spannende Fluorophore nur in einer dünnen Abschnitt über dem Deckglas Oberfläche zu verbessern. Hier Bildgebung innerhalb E. coli erfordert hoch schiefe Beleuchtung 11, die auf einem TIRF Mikroskop leicht abnehm den Winkel des Anregungslicht erreicht wird. PAmCherry Bildgebung erfordert ferner eine 405 nm Laserphotoaktivierung und 561 nm Anregungslaser. Die Fluoreszenzemission wird auf einem Elektronenvervielfachungs CCD (EMCCD)-Kamera mit einer Vergrößerung, was zu einer Pixellänge von 114,5 nm / Pixel aufgezeichnet. Für eine optimale Lokalisierungsgenauigkeit, sollte die Pixelgröße etwa die Standardabweichung Breite der PSF entsprechen, um eine ausreichende Probennahme, ohne sich das Signal über zu viele Pixel zu gewährleisten. 3 zeigt eine schematische Darstellung einer minimalen PALM-Setup. Movie-1vermittelt einen Eindruck von der maßgeschneiderte Mikroskop Bauprozess, siehe Uphoff et al 7 für eine detaillierte Beschreibung des Instruments.. <ol><li> Darstellende Routinemikroskop Ausrichtung. Messung der 405 nm und 561 nm kontinuierliche Laser-Intensitäten vor dem Ziel. Einstellen der Intensität 561 nm bis 3,5 mW (~ 400 W / cm 2) und 405 nm, Intensität 10 uW (~ 1 W / cm 2). Verwenden Sie einen stufenlos variablen Graufilter Rad, das allmähliche Anpassung von 405 nm Intensität 0-10 uW ermöglicht. Abschalten der Laserbeleuchtung bis zum Beginn des Experiments. </li><li> Legen Sie die Probe auf dem Mikroskop Bühne und bringen die Zellen in den Fokus in Durchlichtmikroskopie-Modus (4A). Die EM-CCD Kameraverstärkung muss abgeschaltet werden, um Schäden an der Kamera durch Überbelichtung zu verhindern. </li><li> Definieren Sie eine beschnitten FOV zu Datengröße zu reduzieren und die Kamera Auslesegeschwindigkeit. </li><li> Decken Sie die Probe aus Umgebungslicht und der Schweizch auf der EM-CCD-Kamera zu gewinnen. </li><li> Stellen Sie die Bildrate auf 15,26 ms / frame (einschließlich 0,26 ms Kamera Auslesen). Siehe &quot;Belichtungszeit und Anregungsintensitäten&quot; in der Diskussionsabschnitt. </li><li> Anzeige der Kameradaten, um die dunkle Hintergrundsignal (4B) zu überprüfen. </li><li> Schalten Sie die 561-nm-Laser und überprüfen Sie die Anregung Hintergrundsignal (4C). </li><li> Schalten Sie die 405-nm-Laser für die Photoaktivierung der Pol1 PAmCherry-Fusionsproteine ​​und die Intensität, bis Fluoreszenz PSFs angezeigt. </li><li> Stellen Sie den Winkel des Anregungsstrahls nur eine dünne Schnitt der Probe in der Nähe der Deckfläche zu beleuchten. <ol><li> Zu diesem Zweck wird der Laserstrahl in der hinteren Brennebene einer 100X NA 1,4 Objektiv (3) fokussiert. Übersetzen der Fokussierungslinse senkrecht zum Strahl bewegt den Fokus weg von der Mitte der Objektiv wodurch der Strahl auf das Ziel unter einem Winkel verlassen. </li><li> Aim, um die Fluoreszenzintensität zu maximieren und das Hintergrundsignal zu minimieren. Beachten Sie, dass strenge TIR-Anregung ist optimal, um Bild Fluorophore innerhalb von 100 nm von der Deckfläche, die Abbildung jedoch DNA-Bindeproteine ​​mit der E. zugehörigen coli Nucleoid erfordert tiefere Ausleuchtung bis 0,8 um. </li></ol></li></ol> 4. Datenerfassung Hier beschreiben wir die allgemeine Protokoll für die Übernahme eines PALM Film. Das gleiche Verfahren gilt für die Abbildung Pol1 PAmCherry-Fusionsproteine ​​in E. unbeschädigt coli-Zellen und DNA-Schäden unter Dauerbehandlung mit MMS. Die Anwendung der Methode zur Fusionsproteine ​​unterschiedlichen Molekulargewichts oder Kopienzahl pro Zelle unterschiedliche Einstellungen erfordern Akquisition (siehe Diskussion Abschnitt). <ol><li> Suchen Sie eine neue Sichtfeld (FOV) von Zellen in Durchlichtmikroskopie-Modus und Fokus, das Bild. Nehmen Sie eine Kamera Momentaufnahme, um die Zelle Konturen (Abbildung 4A) aufzeichnen.</li><li> Decken Sie die Probe aus Umgebungslicht und schalten Sie die Kamera EMCCD Gewinn. </li><li> Schalten Sie die 561-nm-Laser und bleichen die zelluläre Autofluoreszenz-und Hintergrund-Spots auf dem Deckglas für ein paar Sekunden, bevor die Datenerfassung. Für Zellen gezüchtet und in M9-Medium abgebildet und Verwendung verbrannt Deckgläser gibt es in der Regel sehr wenig Fluoreszenzhintergrund, aber Vorbleichen nützlich sein könnte für Bildgebung von Zellen in einem reichen Wachstumsmedium wie LB sein. Beachten Sie, dass intensive Beleuchtung ist toxisch für Zellen, so Vorbleichen sollte auf einem Minimum gehalten werden. </li><li> Starten Sie den Erwerb eines PALM Film unter Dauer 561 nm Anregung bei 15,26 ms / frame. </li><li> Schalten Sie die 405-nm-Laser und nach und nach die Intensität im Laufe des Films zu erhöhen, die bis zu 1 W / cm 2. Vermeiden Sie höhere Intensitäten 405 nm, die zelluläre Autofluoreszenz führen. Achten Sie auf die Dichte von fluoreszierenden Molekülen - es ist wichtig, um Aktivierungsraten niedrig zu halten, so dass PSFs sind deutlichisoliert in jedem Rahmen (Fig. 4D-F). </li><li> Aufzeichnen 10.000 Frames / Film (abhängig von der Anzahl der Moleküle pro Zelle abgebildet werden), ein Film dauert typischerweise 2-3 Minuten und erfordert 0,5-1 GB Festplatte in Abhängigkeit von der Größe des FOV. </li><li> Wiederholen Sie die Aufnahme für mehrere FOV. Beachten Sie, dass jedes FOV kann nur einmal abgebildet werden, weil PAmCherry Fluorophore bekommen photo und irreversibel gebleicht. </li></ol> 5. Datenanalyse Eine automatisierte und robuste Datenanalyserahmen ist für die Leistung und Effizienz der Methode. Wir verwenden eigene Software in MATLAB geschrieben. <ol><li> Führen die Analyse unter Verwendung von Lokalisierungs in Crocker et al. 12 beschriebenen Algorithmen, Holden et al. 13, HoldenI et al. 14 und Wieser et al. PSF 15 werden zunächst in einem Bandpass-gefilterten Bildes mit einem Gauß-Kern mit 7 Pixel identifizierts Messer (5A). Kandidatenpositionen entsprechen PSFs Spitzenpixelintensitäten über das 4,5-fache der Standardabweichung des Hintergrundsignals (Fig. 5B). Die lokal hellste Pixel pro Kandidat PSF dient als Startwert für die Montage einer elliptischen Gauß-Funktion (Abbildung 5C). Die freien Anpassungsparameter sind: X-Position, Y-Position, Breite x-, y-Breite, Drehwinkel, Amplitude und Offset-Hintergrund. Die elliptische Gauß-Maske macht Molekül während der Belichtungszeit, die Unschärfen und verformt die PSF. </li><li> Zeichnen Sie die resultierende (x, y) Lokalisierungen aus allen Rahmen der PALM-Film auf die Durchlichtmikroskopie Bild der gleichen Sichtfeld. Lokalisierungen Pol1-PAmCherry sollte im mittleren Bereich des E. erscheint coli-Zellen (Fig. 6A). Wenn viele Lokalisierungen außerhalb der Zellen erscheinen, wurde die Lokalisierung Schwelle zu niedrig eingestellt oder die Probe enthielt Hintergrund fluoreszierende Partikel. </li><li> Für automatisierte Tracking-Analyse, die MATLAB-Implementierung des in Crocker et al beschriebenen Algorithmus. 12 kann verwendet werden (siehe &quot;Diffusion-Analyse&quot; in der Diskussion Abschnitt). Positionen, die in den nachfolgenden Frames innerhalb einer benutzerdefinierten Verfolgungsfenster sind verbunden, um eine Bahn zu bilden. In dem Fall, dass mehrere Lokalisierungen im selben Fenster auftreten, werden Spuren eindeutig durch Minimierung der Summe der Schrittlängen zugeordnet. Für eine ausführliche Diskussion der verschiedenen Aspekte bei der Berechnung der Diffusionskoeffizienten von Ein-Teilchen-Tracking-Daten finden Sie Wieser et al. 15. <ol><li> Der Algorithmus verwendet eine Speicherparameter für transiente Blinken oder verpasste Lokalisierungen während einer Spur Konto. Hier stellen wir die Erinnerung Parameter auf 1 Frame, höhere Werte können für die Verfolgung Fluorophore mit langlebigen Dunkelzuständen verwendet werden. </li><li> Wählen eines geeigneten Verfolgungsfenster auf der Grundlage der folgenden Kalibrierungsschritte. Für Pol1, verwenden wir 0,57 um (5 Punkte).</li><li> Führen Sie den Tracking-Algorithmus für eine Reihe von Tracking-Fenster-Parameter. Berechnung der Anzahl der Spuren pro Zelle gemessen als Funktion der Verfolgungsfenster, um die kleinstmögliche Spur Fenster nicht spaltet Spuren (Fig. 6B) zu identifizieren. </li><li> Plotten der resultierenden Spuren auf der Durchlichtmikroskopie Bild des gleichen FOV um die räumliche Verteilung der Molekülbewegung in den Zellen sichtbar zu machen. Pol1 Titel sollte Diffusion in einzelnen Zellen (6C-D) beschränkt anzuzeigen. </li><li> Wenn eine Fraktion von Spuren zwischen den Zellen zu überqueren erscheint dies legt nahe, dass getrennte Moleküle irrtümlich verbunden, da die Verfolgungsfenster zu groß und / oder die Photogeschwindigkeit zu hoch war (Fig. 6E) gewählt. </li><li> Zeichnen Sie die kumulative Verteilung der Schrittlängen zwischen aufeinander folgenden Lokalisierungen (6F). Die Kurve steigt und sättigt reibungslos für hinreichend große Tracking-Fensterzeigt aber eine Grenzkante, wenn das Fenster zu klein gewählt. </li></ol></li><li> Um die Diffusionseigenschaften von Pol1 analysieren, berechnen Sie die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) zwischen aufeinander folgenden Lokalisierungen für jeden Track mit insgesamt N Schritte): MSD = 1 / (N-1) Σ i = 1 N-1 (X i +1 - x i) 2 + (y i +1 - y i) 2. Nehmen Sie nur Tracks mit mindestens 4 Stufen (N ≥ 5 Lokalisierungen), die statistische Unsicherheit in den MSD-Werte zu reduzieren. </li><li> Zeichnen Sie eine Kurve der MSD-Werte über einen Bereich von Latenzzeiten durch Berechnung Verschiebungen über mehrere Frames (6G). Die Form des MSD-Kurve kann helfen, die beobachteten Molekülbewegung (6H) zu klassifizieren. </li><li> Berechnen Sie den scheinbaren Diffusionskoeffizienten D * pro Spur von der MSD: D * = MSD / (4 At) - σ loc 2 / At. Das zweite term korrigiert die geschätzte Fehlerlokalisierung (hier σ loc = 40 nm und At = 15,26 ms, siehe Wieser et al. 15). </li><li> Zeichnen Sie ein Histogramm der gemessenen D *-Werte von allen Spuren in der FOV (7A). </li><li> Identifizieren einzelner Pol1 Moleküle, die das Chromosom der Grundlage der gemessenen D *-Wert pro Spur gebunden erscheinen. Trennen Sie die Populationen der gebundenen (scharfe Verteilung zentriert D * ~ 0 um 2 / sec) und frei diffundierenden Moleküle (breite Verteilung bei D zentriert * ~ 0,9 um 2 / sec), indem Sie einen Schwellenwert D * &lt;0,15 um 2 / sec ( rote Balken in den 7A und 7D). </li><li> Führen Sie die Lokalisierung, Tracking, Analyse und Verbreitung für Pol1 in unbeschädigte Zellen (7A-C) und in Zellen unter DNA-Schäden, die Behandlung mit MMS (7D-E). Der Anteil an gebundenem Spuren eine direkte quantitative Messung der DNEine Reparatur Aktivität Pol1 in vivo. </li></ol>

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Die Autoren erklären, sie haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir diskutieren verschiedene Schlüsselaspekte für den Erfolg des Experiments. Wahl und die Expression des fluoreszierenden Fusionsprotein: Es gibt eine große Palette von photoaktivierbaren und photo fluoreszierende Proteine ​​17. Die spezielle Auswahl richtet sich nach den Mikroskop Eigenschaften, insbesondere der Laser und Filter zur Verfügung. Die Kombination von 405 nm und 561 nm ist für gemeinsame photoaktivierbare fluoreszierende Proteine. Wir haben uns für PAmCherry 6, weil es ist monomeren und zeigte keine Aggregation in den Zellen. Darüber hinaus ermöglicht irreversible Photo Zählen der Anzahl der aktivierten Fluorophore zu Protein Kopienzahl pro Zelle zu messen. Anstatt das Fusionsprotein aus einem Plasmid exprimiert, bevorzugen wir die chromosomale Insertion des Gens für das Fusionsprotein an der Wildtyp-Locus. Dies gewährleistet eine vollständige Ablösung des Proteins von Interesse mit der Fluoreszenz version und die Aufrechterhaltung der Expressionsniveau Wildtyp. Photoaktivierung Rate: Es ist wichtig, um die Photoaktivierung Rate, so dass im Durchschnitt weniger als ein Molekül pro Zelle ist in der fluoreszierenden Zustand in jedem Bild des Films anzupassen. Dies hängt von der Intensität 405 nm und die Zahl der Moleküle von links nach aktiviert werden. Bei sehr niedrigen Bilddichten jedoch nicht alle Moleküle wird noch vor Ende des Films abgebildet werden oder sehr lange Filme müssen erworben werden. Die Anzahl der Frames pro Film aufgezeichnet ist abhängig von der Kopienzahl von Fusionsproteinen pro Zelle und die mittlere Lebensdauer der Photobleaching PAmCherry bei den Anregungsbedingungen. Die Kopienzahl ist Pol1 ~ 400 Moleküle / Zelle 1 und der mittlere Wert der Exponentialfunktion Bleichen Lebensdauerverteilung betrug ~ 4 Rahmen. Durch die Erhöhung der 405 nm Intensität allmählich wird der Aktivierungs gleichmäßig über 10.000 Einzelbilder des Films verteilt sind. Daher ist jede Zelle occupdurch fluoreszierende Moleküle für insgesamt ~ 1.600 Rahmen ied, wodurch kleine Überlappung von PSF-und Spur Komplikationen in einem Film von 10.000 Frames. Belichtungszeit und Anregungsintensitäten: In erster Linie müssen Belichtungszeiten kurz genug sein, um scharfe PSFs mit wenig Bewegungsunschärfe zu beobachten. Jedoch sollte die Frame-Rate gewählt, um beobachtbare Molekularbewegung zwischen aufeinanderfolgenden Rahmen über die Lokalisierungsunsicherheit zu ergeben, andernfalls entscheidend Photonen werden durch Überabtastung des Spur verschwendet. Die Bewegung des ungebundenen Moleküle müssen ausreichend lange Zeitintervallen abgetastet werden, deutlich von der scheinbaren Bewegung der gebundenen Moleküle aufgrund der Lokalisierungsunsicherheit zu sein. Wenn die Belichtungszeit eingestellt ist, sollte die PSF Intensität eingestellt werden. Die Lokalisierungsgenauigkeit eines PSF mit der Anzahl von Photonen über die Dauer eines Rahmens detektiert wird. Höhere Anregungsintensitäten erhöhen die Photonenemissionsrate but auch die Photobleisatz und Hintergrundsignal. Verwenden Sie die niedrigste Anregungsintensität, die den gewünschten Lokalisierungsgenauigkeit gibt. Für Pol1-PAmCherry haben wir uns für 15.26 ms / Frame und 3,5 mW 561 nm-Anregung (400 W / cm 2). Es ist wichtig, die Lebensfähigkeit der Zellen für die jeweiligen Aufnahmebedingungen zu bestätigen durch die Überwachung von Zellwachstum und Morphologie vor und nach der Datenerfassung (siehe Zusatzinformationen in Uphoff et al. 7). Pol1 zeigt eine verbindliche Zeit von ~ 2 s auf eine Lücken-DNA-Substrat in vivo 7, wir erwarten daher, dass die Mehrheit der Moleküle für die gesamte Dauer eines Titels entweder im gebundenen oder ungebundenen Zustand. Gebundenen Moleküle erscheinen im Wesentlichen unbeweglich da Chromosom Websites haben eine Diffusionskoeffizienten um mehrere Größenordnungen niedriger (18 ~ 10 -5 um 2 / sec, Elmore et al.) Als Pol1 Diffusion in das Zytoplasma (~ 1 um 2 </sbis&gt; / sec). Diffusion-Analyse: Die scheinbare Diffusionskoeffizienten D * wird von der MSD einzelner Spuren berechnet, ein Minimum von 4 Stufen (5 Bilder), gemittelt über die statistischen Fehler zu reduzieren. Beachten Sie, dass ~ 75% der Moleküle Bleichen innerhalb von weniger als 5 Rahmen für den beschriebenen Bilderzeugungsbedingungen. Solche kurzen Tracks bieten keine ausreichende statistische Sicherheit zu gebundenen und ungebundenen Moleküle unterscheiden. Jedoch sind die relativen Anteile von gebundenen und ungebundenen Moleküle, die auf der Proteinaktivität zu berichten, unabhängig von der Gesamtzahl der analysierten Spuren. Es ist nützlich, um die PSF Lokalisationsfehler (σ loc) bei der Berechnung der D *-Konto, weil die Unsicherheit fügt ein scheinbares Zufalls Schritt zur Lokalisierung eines jeden Moleküls 15. Um die Klassifizierung von gebundenen und diffundierende Moleküle zu verbessern, empfehlen wir die Berechnung D * Both von der Einzelschritt-Bewegungen und Verschiebungen über die Zeit der zwei Rahmen. Es ist dann möglich, zwei getrennte D * Schwellenwerte festlegen: D * (15 ms) &lt;0,15 um 2 / s und D * (30 ms) &lt;0,075 um 2 / sec. Beachten Sie, dass D * eine scheinbare Diffusionskoeffizient, der durch Zell Einschluss der Spuren und Bewegungsunschärfe aufgrund der Diffusion während der Belichtungszeit beeinflußt wird. Um genaue unvoreingenommene Diffusionskoeffizienten zu extrahieren, ist es nützlich, um die beobachtete Bewegung simulierten Daten auf der Grundlage einer stochastischen Brownsche Bewegung Modell 5,7 Vergleichs bewährt. Simulierten Daten können auch verwendet werden, um Datenanalyseverfahren testen. Mögliche Anwendungen dieser Methode: Wir beschrieben einen allgemeinen Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo durch die Veränderung in der Mobilität eines Proteins bei Bindung an das Chromosom. Die Aktivitäten der DNA-oderRNA-bindende Proteine ​​in Reparatur beteiligt, Replikation, Transkription und Chromosom Wartung kann somit in Echtzeit auf der Ebene einzelner Zellen mit einer Auflösung unterhalb der optischen Beugungsgrenze einzuhalten. Photoactivated Einzelmolekül-Tracking erweitert herkömmlichen Tracking-Methoden, die auf ein paar markierte Moleküle pro Zelle beschränkt werden. Eine alternative Methode, die molekulare Diffusion in vivo misst ist Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Während FRAP ist sehr nützlich zur Messung globaler Diffusionseigenschaften in großen Zellen ist es in seiner Fähigkeit, verschiedene Molekülarten mit unterschiedlichen Mobilitäten in einem räumlich heterogenen Umgebung zu lösen, insbesondere für kleine Bakterienzellen begrenzt. Wir haben photoEinzelMolekül-Tracking eingesetzt, um DNA-Bindungsaktivitäten und subzellulärer Lokalisierungen aus einer Reihe von verschiedenen Proteinen in E. messen coli einschließlich Pol1, DNA-Ligase, Fis Protein-, DNAPolymerase-III-7, sowie Bauliche Erhaltung von Chromosomen Proteine ​​MukB, E, und F 19. Wir erwarten, kann das Verfahren auch auf andere Zelltypen angepasst werden.

Dieses Protokoll beschreibt die direkte Messung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in lebenden Escherichia-coli-Zellen. Die Technik nutzt die Änderung der Diffusionskoeffizient einer einzigen fluoreszenzmarkierten Proteins, wie es das Chromosom (Fig. 1) bindet. Um die Methode, die wir verwenden, DNA-Polymerase I (Pol1), eine prototypische DNA-bindendes Protein, das DNA-Lücken in rückständigen Strang Replikation und Exzision Reparaturwege 1 füllt demonstrieren. Das Aufkommen der Super-Resolution-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Visualisierung molekularer Strukturen in Zellen mit Nanometer-Auflösung. Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) beschäftigt fluoreszierende Proteine, die von einem Anfangszustand in einen dunklen fluoreszierenden Zustand (Abbildung 2) aktiviert werden kann. Nur eine Teilmenge aller markierten Molekülen ist zu jeder Zeit aktiviert werden, um ihre Positionen in einer sequentiellen Art und Weise unabhängig von t zu bestimmen,er Gesamtkonzentration der markierten Moleküle in der Probe 2. Die Lokalisierungsgenauigkeit pro Molekül hängt hauptsächlich von der Größe des fluoreszierenden Point Spread Function (PSF), die Anzahl der gesammelten Photonen, und das Hintergrundsignal 3. Viele Anwendungen dieser Verfahren konzentrieren sich auf die verbesserte Visualisierung von Zellstrukturen. Die Erkenntnis, dass PALM mit Einzelmolekül-Tracking kombiniert werden 4 neue Wege eröffnet, um die Bewegung der eine beliebige Anzahl von markierten Proteinen in lebenden Zellen direkt zu folgen. Erhöhte Empfindlichkeit und zeitliche Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskope erlauben nun Verfolgung der einzelnen Streu fluoreszierende Proteine ​​im bakteriellen Zytoplasma 5. Hier beschäftigen wir PAmCherry, eine gentechnisch fluoreszierenden Protein, das irreversibel wandelt von einem Anfangs nicht-fluoreszierenden Zustand in einen fluoreszierenden Zustand bei Bestrahlung mit 405-nm-Licht 6. Aktiviert PAmCherry Fluorophore Bild seind durch Anregung bei 561 nm und für mehrere Frames verfolgt, bis Bleichen. Wir zeigen die Fähigkeit des Verfahrens, um transiente DNA-Bindungsereignisse einzelner Proteine ​​zu identifizieren mit einer Fusion von Pol1 und PAmCherry. Behandlung der Zellen mit Methylmethansulfonat (MMS) verursacht Schäden, DNA-Methylierung in DNA-Substrate gapped durch Basen Exzisions-Reparatur-Enzyme aktiviert wird. Unsere Methode zeigt deutliche Bindung von Einzel Pol1 Moleküle in Reaktion auf MMS Schaden 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1444">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:477px;"></td>
			<td style="width:467px;">created by Lambda-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM vitamins</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11120-052</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>certified molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>BB024060SC</td>
			<td style="width:467px;">remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl methanesulfonate (MMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129925</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PALM setup</td>
			<td>home-built</td>
			<td></td>
			<td>described in Uphoff et al. 2013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>for data analysis and visualization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Localization software</td>
			<td style="width:187px;">custom-written, available online</td>
			<td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td>
			<td style="width:467px;">MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tracking software</td>
			<td>available online</td>
			<td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td>
			<td style="width:467px;">MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker &#38; Grier 1996 if used in publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking

Protein-DNA-Wechselwirkungen sind im Herzen der vielen grundlegenden zellulären Prozesse. Zum Beispiel werden DNA-Replikation, Transkription, Reparatur und Chromosomenorganisation von DNA-bindenden Proteinen, die spezifische DNA-Sequenzen erkennen, Strukturen oder geregelt. In-vitro-Experimente haben dazu beigetragen, detaillierte Modelle für die Funktion von vielen Arten von DNA-bindenden Proteinen zu erzeugen, dennoch Die genauen Mechanismen dieser Prozesse und deren Organisation in der komplexen Umgebung der lebenden Zelle noch weit weniger verstanden. Wir vor kurzem eine Methode zur Quantifizierung von DNA-Reparaturaktivitäten im Live Escherichia coli Zellen unter Verwendung von Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking-Systems. Unsere allgemeine Ansatz identifiziert einzelnen DNA-Bindungsereignisse durch die Änderung der Mobilität eines einzelnen Proteins bei der Assoziation mit dem Chromosom. Der Anteil an gebundenen Molekülen eine direkte quantitative Maß für das Protein Aktduktivität und Fülle von Substraten oder Bindungsstellen auf der Ebene einzelner Zellen. Hier beschreiben wir das Konzept des Verfahrens und zeigen die Probenvorbereitung, Datenerfassungs-und Datenanalyseverfahren.

Das Konzept der photoEinzelMolekül Verfolgung, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo zu untersuchen, ist in Fig. 1 dargestellt. PAmCherry Fusionsproteinen in lebenden E. erkannt coli-Zellen in einer sequentiellen Weise durch Photoaktivierung einzelne Moleküle stochastisch mit 405 nm Licht bei einer Frequenz von weniger als ein Molekül pro Zelle zu einem Zeitpunkt. Aktivmoleküle unter Dauer 561 nm Anregung abgebildet. Molekularbewegung in der Zelle kann durch Verbinden der Nähe Lokalisierungen in einer Reihe von Rahmen, bis irreversible Photobleichen verfolgt werden. Da die Diffusion von DNA-bindenden Proteinen basiert auf der Bindung des Chromosoms verlangsamt, der scheinbare Diffusionskoeffizient D * pro Spur erhalten direkt berichtet über einzelne Protein-DNA-Wechselwirkungen. Abbildung 2 zeigt die Photoaktivierung Pol1 PAmCherry-Fusionsproteinen in lebenden E. coli-Zellen. Der Einfluss der 405 nm Intensität on die Dichte der fluoreszierenden Moleküle in der Fig. 4 gesehen werden. Beachten Sie, dass die Dichte nicht allein durch die 405 nm Intensität, sondern zusätzlich durch die Anzahl der Moleküle, die zur Aktivierung zur Verfügung stehen bestimmt, der Pool der verbleibenden Moleküle innerhalb eines PALM Film erschöpft. Lokalisierungs Analyse wird für jeden Rahmen eines PALM Film, wie in Fig. 5 dargestellt ausgeführt. Wir maßen die Lokalisierungsgenauigkeit mit unbeweglichen Moleküle in Zellen oder Fest gebundene Moleküle in lebenden Zellen. Unsere Akquisitions Einstellungen gab eine Lokalisierungsgenauigkeit von σ loc = 40 nm, in Übereinstimmung mit der theoretischen Vorhersage 3. Die resultierenden Pol1 Lokalisierungen besetzen den zentralen Bereich der Zelle (Fig. 6A), breit rekapituliert die räumliche Organisation des E. coli Nucleoid 7. Die Mehrheit der Pol1 Tracks in unbeschädigten Zellen zeigen verFusions wie in Fig. 6C gezeigt. Eine typische Zelle mehrere hundert Pol1 Spuren (Fig. 6D), die mit der Kopienzahl von etwa 400 Moleküle pro Pol1 E. enthält . coli Zelle 1 6B und 6E-F geben Hinweise auf die Wahl eines geeigneten Tracking-Parameter-Fenster - wenn die Tracking-Fenster zu groß ist, sind verschiedene Moleküle wahrscheinlicher zu werden fälschlicherweise zu einer Spur verbunden, und wenn die Verfolgungsfenster zu klein ist, Titeln mit mehr Schritte aufgeteilt werden. Der MSD-Kurve für Pol1 steigt linear für kurze Verzögerungszeiten und sättigt bei längeren Verzögerungszeiten durch Zellhaft (6G). Verschiedene Arten der Molekularbewegung durch MSD-Analyse identifiziert werden. Regie Bewegung gibt eine parabolische Kurve; Brownsche Bewegung wird durch eine gerade Linie gekennzeichnet, die engen Diffusionskurve ein Plateau erreicht; ein Versatz der MSD-Kurve für immobile Partikel stellt die localization Unsicherheit (6H). Weitere Informationen auf Einzelpartikelverfolgung und Tipps zur Fehlerbehebung in Arnauld et al. 16 zu finden Wir haben vorher die Methode angewandt, um die DNA-Reparaturaktivität von Pol1 in Reaktion auf exogene DNA-Alkylierung Schaden 7 zu messen. Die D * Histogramm Pol1 Tracks in unbeschädigten Zellen zeigt einen dominanten Bevölkerung diffundieren Moleküle (7A-C). Ein kleiner Anteil von 2,7% gebundenes Pol1 Moleküle wahrscheinlich in rückständigen Strang Replikation und Reparatur von endogenen DNA-Schäden beteiligt. Im Dauer 100 mM MMS Schäden, die Bevölkerung von Tracks mit D * ~ 0 um 2 / sec erhöht sich auf 13,8% (Abbildung 7D). Diese Spuren stellen einzelne Moleküle Pol1 Durchführung der DNA-Reparatursynthese zu Single-Nukleotid-Lücken als Teil der Basis-Exzisionsreparatur Weg zu füllen. Die Positionen der gebundenen Spuren zeigen die Standorte der einzelnenDNA-Schäden und Reparaturstellen (7E-F). <img alt="Figur 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> Fig. 1 ist. Grafische Darstellung der Methode. (A) Das fluoreszierende Protein PAmCherry kann aus einer anfänglichen nicht-fluoreszierenden Zustand bei Bestrahlung mit 405-nm-Licht photoaktiviert werden. Die hellen Zustand ist bei 561 nm angeregt und emittiert Fluoreszenz um 600 nm bis die Fluorophor Bleich irreversibel. (B) Steuerung der Photoaktivierung Rate ermöglicht die Abbildung nur eine einzige stochastisch aktiviert PAmCherry Fusionsprotein pro Zelle zu jeder Zeit während der beliebig großen Pool von Molekülen, die noch nicht in einem Dunkelzustand aktiviert wurden oder bereits gebleicht bleibt. (C) Die Position des fluoreszierenden Moleküls von der Mitte des isolierten PSF und trfür mehrere Frames acked bis Bleichen. (D) Tracks vieler Moleküle werden in sequentieller Weise aufgezeichnet. (EF) Die Wechselwirkung von einem DNA-bindenden Protein mit einer chromosomalen Ziel-Sequenz oder Struktur hält den Zufallsdiffusionsbewegung. Gebundenen und ungebundenen Moleküle werden von der scheinbaren Diffusionskoeffizienten D * von Einzelspuren extrahiert aus. Der resultierende Anteil an gebundenen Molekülen gibt ein quantitatives Maß für die Aktivität eines DNA-bindenden Proteins in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> 2. Photoaktivierung von Pol1-PAmCherry live E. coli-Zellen. Maßstabsbalken: 1 um. Schaltpläne sind unter jedem Panel angezeigt. (<html> A) Lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen auf einem Agarose-Pad immobilisiert übertragen. (B) Phototactivating eine einzige PAmCherry Fluorophor in einer Zelle. (C) eine höhere Photogeschwindigkeit erhöht die Anzahl der Fluoreszenzmoleküle. (D) Integrierte PAmCherry Fluoreszenz von einem Palm-Film. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> 3. Schematische Darstellung einer minimalen PALM-Setup zur Photoaktivierung und Imaging PAmCherry Fusionsproteine ​​D1:. Dichroitische Spiegel (z. B. 550 nm Langpass). D2: Der dichroitische Spiegel (z. B. 570 nm Langpass). L1: Kollimatorlinse. L2: TIR-Linse. L3: Tube-Objektiv.1177/51177fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> 4. Repräsentative Bilder von einem Film mit PALM 15.26 ms / frame Maßstabsbalken:. 1 um. (A) Lichtbild von Zellen auf einem Agarose-Pad immobilisiert übertragen. (B) Dunkler Hintergrund Bild gemessen an der EM-CCD-Kamera mit der Laser abgeschaltet. (C) Die Anregung Hintergrundbild unter Dauer 561 nm Anregung, bevor die Photoaktivierung. (DF) Erhöhte Intensität 405 nm führt zu höheren Raten von Photo PAmCherry, unter Dauer 561 nm Anregung abgebildet. Die eingerahmten Flächen sind unten vergrößert dargestellt. (D) Nieder 405 nm Intensität (&lt;1 uW) Aktiv sehr wenige fluoreszierende Moleküle pro FOV. (E) Medium 405nm Intensität (~ 2 uW) Photoaktivierung führt zu einer guten PSF Dichte für die Lokalisierung und Tracking-Analyse. (F) Höhere 405 nm Intensität (~ 10 uW) aktiviert mehr als einem fluoreszierenden Molekül in einigen Zellen, die die Lokalisierung und Tracking-Analyse verdeckt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> 5. Illustration des Lokalisierungsanalyse. Maßstabsbalken: 1 um (A) Band-Pass-Filtern entfernt störende Pixelrauschen und flacht Intensitätsgradienten über das FOV.. (B) Bewerber PSFs werden in der gefilterten Bildes basierend auf einer benutzerdefinierten Schwelle, die gewählt wird, um falsch-positive und falsch-negative Erkennungen zu minimieren, identifiziert. Die threshoLD entspricht der minimalen Intensität eines Kandidatenpixel geteilt durch die Hintergrund-Standardabweichung (Signal-zu-Rausch-Verhältnis, SNR). (C) Die lokal hellste Pixel, die die Schwelle dient als Ausgangs Lokalisierung Vermutung (orange Kreuz) für einen zweidimensionalen elliptischen Gauß-Passform geht. Maßstabsbalken: 0,5 um. Die daraus resultierende Super-Resolution-Lokalisierung (blaues Kreuz) eine durchschnittliche Genauigkeit von σ loc = 40 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> .. Abbildung 6 Abbildung der Tracking-Analyse Maßstabsbalken: 1 um. (A) Alle erkannten Lokalisationen Pol1-PAmCherry in einem Beispiel Zelle. (B) Anzahl der Spuren erkennened im Beispiel Zelle als Funktion des Spurfenster. Kleine Tracking-Fenster unterteilt Molekül Trajektorien, die zu hohe Anzahl an Titeln Artefakt führt. Die gestrichelte Linie zeigt unsere Wahl für den Tracking-Parameter-Fenster (0,57 um, 5 Punkte) - das gibt einen guten Kompromiss zwischen Erfassung der Vollausschüttung von Schritten und halten die Bahnen der verschiedenen Moleküle intakt. (C) Beispiel einer einzelnen Spur Pol1 PAmCherry-Molekül. (D) Alle in zufälligen Farben gezeigt, gemessen Spuren. (E)-Tracking-Artefakte, wenn die Tracking-Fenster zu groß gewählt (hier 0,8 um 7 Pixel) ist oder die Dichte des PSFs pro Frame zu hoch. (F) Kumulative Verteilungen der Schrittlängen für das Tracking-Fenster: 0,34 um (3 Pixel, rote Linie), 0,57 um (5 Pixel, blaue Linie), und 0,80 um (7 Pixel, grüne Linie). Beachten Sie, dass die 0,34 um Tracking-Fenster schneidet Schritte länger als 0,34 um was eindeutigschneidet die komplette Distribution von Schritten. Die Tracking-Fenster erkennt 0,57 um fast die gleiche Verteilung von Schritten, ebenso wie die 0,80 um Tracking-Fenster. (G) MSD-Kurve zeigt, beschränkt Diffusion von Pol1. (H) Schematische MSD-Kurven für gerichtete Bewegung, die Brownsche Bewegung, beschränkt Diffusion und immobile Partikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7. Direkte Messung des DNA-Reparaturaktivität von Pol1 live E. . coli-Zellen Maßstabsbalken: 1 um. (A) Histogramm der scheinbaren Diffusionskoeffizienten D * für alle Spuren von 4 oder mehr Schritte in einem Sichtfeld von unbeschädigten Zellen (N = 4.162 Spuren). Die Bevölkerung von Molekülen als b eingestuft<html> ound ist rot markiert. (BC) Tracks von Pol1-PAmCherry sind auf einer übertragenen Bildlichtmikroskopie gezeigt. Tracks wie klassifiziert nach ihrer Diffusionskoeffizienten gebunden sind rot dargestellt. (D) D * Histogramm für Pol1 Spuren in Zellen auf einem Agarose immobilisiert Pad mit 100 mM MMS und für 20 min inkubiert, bevor die Abbildung (N = 2.128 Spuren) gemessen. Die Bevölkerung der gebundenen Moleküle der DNA-Reparatur tätig ist rot dargestellt. (EF) Pol1-PAmCherry Spuren auf Mikroskopie-Bild übertragen Licht, die die Spuren der einzelnen Pol1 DNA-Reparatur-Ereignisse in rot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Video 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> Film 1. Der Aufbau einer maßgeschneiderten PALM-Setup.JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier, um Video anzusehen.

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Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von DNA-Protein-Interaktionen in lebenden Escherichia coli-Zellen.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

visualizing-protein-dna-interactions-live-bacterial-cells-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K Aufrufe.  University of Oxford.  Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von DNA-Protein-Interaktionen in lebenden Escherichia coli-Zellen. 

Serie: Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Die Beurteilung stomatäre Response to Bakterienzellen Live mit Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...