Wir danken Xufeng Wu für den Zugang zum STORM-Mikroskop. Diese Forschung wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm des National Cancer Institute (NCI) Centre for Cancer Research und des National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) unterstützt.

Achtung: Bitte konsultieren Sie vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Mehrere der in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien sind toxisch und krebserregend. Bitte wenden Sie bei der Durchführung des Protokolls alle geeigneten Sicherheitshinweise an, einschließlich des Einsatzes von Ingenieurkontrollen (Dunstabzugshaube, Handschuhfach) und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Laborkittel, Volllängenhose, Zeltschuhe). 1. Multiplexed Imaging von aktivierten T-Zellen <ol><li> Direkt konjugierte Antikörper mit Alexa-647 (A647) -Farbstoff unter Verwendung des Alexa 647 Antikörper-Markierungskits. Befolgen Sie das Etikettierungsprotokoll des Herstellers. HINWEIS: Die Dialyse der Antikörperlösung in 1x PBS wird vor diesem Schritt empfohlen, um die Antikörper-Markierungseffizienz zu erhöhen. </li><li> Spin markierte Antikörper für 5 min bei 20.800 rcf und sammeln Überstand, um aggregierte Antikörper zu entfernen. </li><li> Vorbereitung von fluoreszierenden nanondiamantbeschichteten Deckgläschen <olAufrechtzuerhalten <li> 4-Well-Deckglaskammern (siehe Reagenz / Materialliste) mit 250 μl 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) für 15 min, aspirieren und bei 65 ° C für 30 min trocknen. (Kein Spülen vor dem Trocknen). </li><li> Vorbereitung einer Verdünnung von 100 nm FNDs in 1x PBS. Testen Sie verschiedene Verdünnungen, um sicherzustellen, dass genügend FNDs sichtbar sind, jedes Sichtfeld in Schritt 1.2.7 (wir verwenden eine 1: 200 Verdünnung von FNDs, die vom Hersteller bereitgestellt werden). </li><li> Vortex die verdünnten FNDs für 1 min. </li><li> Sonde den FND-Überstand für 30 s bei einer Hochleistungseinstellung. </li><li> Inkubieren Sie den beschallten FND-Überstand in einer PLL-beschichteten 8-Well-Deckglaskammer für 30 min bei Raumtemp. </li><li> 5x mit 1x PBS waschen und die FND-beschichtete Kammer mit 647 nm Laseranregung am TIRF-Mikroskop visualisieren. Idealerweise sollten 4-10 einzelne FNDs in einem Sichtfeld sichtbar sein, da die entsprechende Verdünnung der FNDs in Schritt 1.2.2 (wir verwenden ein 100X-Objektiv mit 256 x 256 Kamera-Pixel-Einstellung, um ein 61 x 61 μm-Sichtfeld zu ergeben) mitMindestens eine FND, die in jedem Quadranten des Bildgebungsfeldes vorhanden ist. Wenn die FNDs gruppiert sind ( dh FNDs mit deutlich höherem Signal als umgebende FNDs und eine Punktspreizfunktion größer als 200 nm), zentrifugieren FNDs bei 6.800 rcf für 1 min und wiederholen das Beschichtungsverfahren unter Verwendung des FND-Überstandes. </li><li> Füge 250 μl anti-CD3-Antikörper (10 μg / mL) in jede Vertiefung zu und inkubiere für 1 Stunde bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Lösung entfernen und 1x PBS für 30 Sek. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 5 mal (waschen Sie 5x). </li></ol></li><li> Aktivierung von Jurkat-T-Zellen <ol><li> 1 ml Jurkat-T-Zellen bei 800 rcf für 6 min spinnen und in 300 μl 1x HBS-Lösung resuspendieren. Jurkat-T-Zellen sollten idealerweise in einer Konzentration von 0,5-1,0 x 10 &amp; sup6; Zellen / ml vor dem Spinnen liegen. 1x HBS-Lösung besteht aus HEPES-Puffersalzlösung mit 1% Rinderserumalbumin, wie zuvor beschrieben 22 . </li><li> Füge 150 μl hinzuVon 1x HBS-Lösung in jeder Vertiefung und inkubieren bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Füge 50 μl resuspendierte Jurkat T-Zellen zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere für 3 min bei 37 ° C. </li><li> Füge 300 μl 4% Paraformaldehyd zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen 3x mit 1x PBS. </li><li> Permeabilisieren von Zellen durch Zugabe von 250 μl 0,1% Triton-X-Lösung für 5 min bei Raumtemp. </li><li> Waschen 3x mit 1x PBS. </li><li> Füge 250 μl 1% Fisch-Gelatinelösung in 1x PBS zu jeder Vertiefung für 30 min bei Raumtemp. </li><li> Waschen 3x mit 1x PBS. </li></ol></li><li> Imaging aktiviert Jurkat T-Zellen mit madSTORM <ol><li> Zugabe von 200 μl markiertem Antikörper bei 0,1-0,5 μg / ml zu fixierten Zellen für 1 Stunde bei Raumtemp. </li><li> Waschen 5x mit 1x PBS. </li><li> Füge 1 ml STORM-Puffer hinzu und decke die Kammer mit einem Glasdeckel ab, um die Einwirkung von Luft zu begrenzen. Der STORM-Puffer wurde zuvor beschrieben 10 . Wir empfehlen maKönig neue STORM Puffer für jede Runde der Bildgebung und Spinnen der STORM Puffer bei 20.800 rcf für 2 min, um Präzipitate zu entfernen. </li><li> Mit einer niedrigen 647-nm-Laserleistung im TIRF-Modus finden Sie eine gefärbte Zelle mit mindestens 3 FNDs im Sichtfeld. Um bei der Lokalisierung von FNDs zu helfen, kann eine gleichzeitige Erregung mit 568 nm Laser verwendet werden, um die Helligkeit des FND-Signals zu erhöhen. HINWEIS: Die in Abschnitt 2.1 beschriebene Leistung der gemittelten Referenzkorrektur verbessert sich durch die Aufnahme von mehr FNDs. </li><li> Erhöhen Sie 647 nm Laserleistung und erwerben Sie Bilder. Normalerweise erwerben wir 10.000 Frames bei 200 ms Belichtung, 125 mW 647 nm Laser, 100X TIRF Objektiv (1,49 NA), 100X EM Verstärkung (5 MHz bei 16 Bit, Umwandlungsverstärkung 1). Details zu unserem Bildaufbau wurden bereits beschrieben 10 . </li><li> Waschen 5x mit 1x TBS. </li><li> Füge 1 ml o hinzu(3,5 M MgCl 2 , 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) und inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min. </li><li> Wiederholung der Elution 3 mal. (Genaue Elutionsbedingungen und die Anzahl der Elutionsspülungen, die benötigt werden, um das Signal zu entfernen, müssen für jeden verwendeten Antikörper überprüft werden). </li><li> 3x mit 1x TBS waschen und 1 ml 1x PBS zugeben. </li><li> Photobleach unter Verwendung von 647 nm Laser bei hoher Leistung (125 mW) mit 405 nm Laser bei 2-5 mW, um A647 Farbstoffe im Dunkelzustand zu aktivieren. Warten Sie, bis alle verbleibenden Signale von nicht-eluiertem Antikörper photobleichen. Typischerweise dauert dies 2-5 s Laserbelichtung. Erfassung von Beispielbildern (~ 100 Frames) mit den STORM-Einstellungen in 1.3.5 nach der Elution und Photobleaching wird empfohlen, um das Entfernen des Signals zu bestätigen. Normalerweise entfernen wir 99,8% des Signals mit dieser Methode. Wir empfehlen die Prüfung der Elutionseffizienz jedes Antikörpers vor der Verwendung in madSTORM wie zuvor gezeigt 10 . </li><li> Füge 250 μl 4% Paraformaldehyd für 15 min hinzu. Diese prEreignisse reverse Vernetzung von festen Molekülen in der Zelle. </li><li> Waschen 3x mit 1x PBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.12 für die sequentielle Etikettierung mehrerer Ziele. Fig. 1 zeigt ein zusammengesetztes Bild von mehreren Molekülen in einer aktivierten Jurkat-T-Zelle, die unter Verwendung von madSTORM erhalten wurde. </li></ol></li></ol> 2. Driftkorrektur und Ausrichtung von Multiplex-Bildstapeln <ol><li> Driftkorrektur von madSTORM Bildstapeln <ol><li> Öffnen Sie Bilder mit ImageJ. Wir empfehlen, die Bilddateien vor dem Öffnen in ImageJ in ein TIFF-Format umzuwandeln. Verwenden Sie den Rechteck ROI, um eine einzelne FND auszuwählen. Spielen Sie die Zeitspanne, um sicherzustellen, dass die FND in jedem Rahmen des Bildstapels sichtbar ist. Verwenden Sie Run-Analyse im ThunderSTORM-Plugin, um die FND zu lokalisieren. Für die gemittelte Referenzkorrekturmethode, die in 2.1.5 beschrieben ist, ist es wichtig, dass in jedem Bildrahmen eine einzelne FND lokalisiert ist ( dh die Anzahl der identifizierten Peaks sollte e seinQual auf die Anzahl der Frames). </li><li> Wenn die FND nicht in jedem Frame identifiziert wird, wählen Sie eine andere FND. Wenn sich mehrere Peaks in einem einzigen Frame befinden, entfernen Sie den Peak, der am meisten von früheren Peaks abweicht. </li><li> Wiederholen Sie 2.1.2 für jede FND im Bildstapel. Denken Sie daran, dass einige FNDs nicht in den Drift-Korrekturprozess einbezogen werden sollten, damit sie als unabhängiges Messgerät für Driftkorrekturgenauigkeit dienen können, wie in Schritt 2.1.7 beschrieben. </li><li> Für eine schnellere, weniger präzise Driftkorrektur verwenden Sie entweder die in ThunderSTORM enthaltenen Kreuzkorrelations- oder Fiducial-Korrekturalgorithmen, um die FND-Bilder zu korrigieren. Typischerweise verwenden wir 100 Bins, 5-Vergrößerungen und 0,1 Trajektorien-Glättungsfaktor für die Kreuzkorrelation und 10 max Distanz, 0,1 min Marker Sichtbarkeit und 0,01 Trajektorien Glättungsfaktor für die Referenzkorrektur. Kreuzkorrelation und Referenzkorrektur ergibt eine Korrekturdatei, die auf andere FNDs angewendet werden kann, um die Driftkorrekturgenauigkeit zu testen. </li><li> Für eine strengere, präzisere Driftkorrektur, verwenden Sie den gemittelten Fiducial Korrektur (AFC) Algorithmus wie zuvor beschrieben 10 . Dieser Prozess erfordert keine Optimierung von Parametern und liefert eine höhere Lokalisierungsgenauigkeit als durch SMLM-Lokalisierungsalgorithmen vorhergesagt. Die gemittelte Driftkorrektur erfordert jedoch mindestens 4 FNDs und die FNDs in jedem Frame des Bildstapels lokalisiert werden. Die AFC-Driftkorrektur führt mit der Aufnahme von mehr FNDs besser aus, da eine große Anzahl lokalisierter FNDs die verzerrende Wirkung eines Ausreißerpeaks in einem gegebenen Rahmen verringern wird. </li><li> Lokalisieren Sie alle Punktspreizfunktionen innerhalb des Bildstapels mit ThunderSTORM wie zuvor beschrieben 10 . Wir verwenden typischerweise eine Pixelgröße von 100 nm, Photoelektronen pro A / D-Zählwert von 4,28, Basispegel A / D-Zählwert von 100, EM-Verstärkung von 100, PSF: Integrierte Gaußsche Lokalisierung, 5-Pixel-Anpassungsradius, Maximum-Likelihood-Anpassungsmethode und 1,3 Pixel initial sigma</li><li> Wenden Sie den von FNDs erfassten Driftkorrekturfaktor auf Lokalisierungen aus dem gesamten Bildstapel an. Überprüfen Sie das endgültige Bild, um eine korrekte Driftkorrektur zu gewährleisten ( Abbildung 2 ). Der resultierende Driftkorrekturfaktor sollte unabhängig auf FNDs getestet werden, die nicht in der AFC-Prozedur enthalten sind, um den Grad der Driftkorrekturgenauigkeit zu messen. Die Genauigkeit von driftkorrigierten, unabhängigen FNDs sollte nahe dem durchschnittlichen Präzisions- / Unsicherheitswert liegen, der aus dem in Schritt 2.1.6 verwendeten Lokalisierungsalgorithmus berechnet wurde. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.7 für die madSTORM-Bildstapel von sequentiell markierten Antikörpern. Denken Sie daran, dass die Lokalisierung des gleichen Satzes von FNDs in jedem madSTORM-Bildstapel für das folgende Ausrichtungsverfahren entscheidend ist. </li></ol></li><li> Ausrichtung von madSTORM Bildern <ol><li> Berechnen Sie die Schwerpunktposition der Drift-korrigierten FNDs in jedem madSTORM-Bild. Um dies zu tun, finden Sie die mittlere x und y-Achse poFür jede lokalisierte FND und durchschnittlich die mittleren x- und y-Positionen aller FNDs in jedem madSTORM-Bild. Der detaillierte Algorithmus für diesen Schritt wurde zuvor beschrieben 10 . Ausrichten von sequentiellen madSTORM-Bildern unter Verwendung der Schwerpunktpositionen von FND-Markierungen. Um die Ausrichtung durchzuführen, berechnen Sie den Versatz zwischen zwei lokalisierten madSTORM-Bildern, indem Sie die Schwerpunktposition von FNDs im zweiten madSTORM-Bild von der ersten subtrahieren. Dann subtrahiere den Offsetbetrag von allen Lokalisierungen im zweiten madSTORM-Bild. </li><li> Wir empfehlen, das erste madSTORM-Bild als Referenzbild zu verwenden und diesen Ausrichtungsschritt zwischen dem ersten und dem dritten, dem ersten und dem vierten usw. zu wiederholen . Testen Sie die Ausrichtungsgenauigkeit, indem Sie den Versatz zwischen FNDs messen, die nicht im Ausrichtungsprozess enthalten sind. Große Offsets können darauf hindeuten, dass verschiedene Sätze von FNDs verwendet wurden, wenn die Schwerpunktpositionen von sequentiellen madSTORM-Bildern berechnet wurden. </li><li> Wenn ja, Schritte 2.2.1-2.2.2 shouLd wird mit demselben Satz von FNDs wiederholt, um die Ausrichtung durchzuführen. HINWEIS: Es werden benutzerdefinierte Codes für die AFC-Driftkorrektur- und Ausrichtungsverfahren bereitgestellt. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die sequentielle Multiplex-, Driftkorrektur- und Ausrichtungsprozeduren in madSTORM ermöglichen eine präzise, ​​hochmultiplexierte Visualisierung heterogener Strukturen in Zellen. 10 Darüber hinaus vermeidet madSTORM die Einschränkungen von mehrfarbigem STORM wie chromatische Aberration und suboptimale Photoscharter / Emissionseigenschaften von nicht-fernen roten Farbstoffen 9 , 12 . Da der Elutionsschritt die sterische Interferen...

Es wurde eine Vielzahl von Super-Auflösungs-Mikroskopietechniken entwickelt, um die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie (~ 200 nm) zu überwinden. Darunter befindet sich eine Kategorie von Techniken, die als Singlemolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) bezeichnet werden, die eine Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (PALM) und eine stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) umfasst. SMLM-Techniken teilen sich bei der Verwendung von Fluorophoren, die zwischen auf (fluoreszierenden) und aus (dunkel / foto geschalteten) Zuständen umgeschaltet werden können, was eine sequentielle Lokalisierung der Fluoreszenz von einzelnen Molekülen 1 , 2 , 3 ermöglicht . Aufgrund seiner Kompatibilität mit handelsüblichen Farbstoffen und Mikroskopen ist direkt STORM (dSTORM) zu einer weit verbreiteten SMLM-Technik geworden 4 . DSTORM kann routinemäßig ~ 10 nm Lokalisierungsgenauigkeit erreichen, definiert als die Unsicherheit bei der Berechnung des Zentrums eines BeugensIonen-begrenzte Punktspreizfunktion (PSF). Trotz der hohen Genauigkeit, die mit den Lokalisierungsalgorithmen 5 , 6 , 7 geschätzt wird , wurde eine genaue Bestimmung der tatsächlichen Lage einzelner Moleküle durch eine Reihe von Problemen behindert. Zunächst fügt eine mechanische Bewegung des Mikroskopstadiums während der Bildaufnahme eine erhebliche Unsicherheit zur Lokalisierungsgenauigkeit hinzu. Da SMLM-Bilder über Tausende von Zeitraffer-Frames erhalten werden, können nanoskalige Bewegungen des Mikroskopstadiums die Präzision des endgültigen Superauflösungsbildes erheblich beeinträchtigen 8 . Um die Bühnenbewegung während der Bilderfassung zu kompensieren, wird die Bühnendrift üblicherweise aus der regressionsbasierten Anpassung von Binned-Lokalisierungen aus dem Bild selbst (Kreuzkorrelation) oder sequentiellen Lokalisierungen von fiducial-Markern (Referenzkorrektur) 1 , 9 geschätzt. HowevDiese Methoden erfordern die Optimierung mehrerer Parameter für jeden Bildstapel und können keine Bühnenbewegungen bei kurzen Zeitskalen wie mechanische Vibration berücksichtigen. Gold-Nanopartikel und mehrfarbige fluoreszierende Perlen wurden als Fiducial-Marker in SMLM verwendet, sind aber nicht lichtstabil und führen zu einer deutlich geringeren Präzision nach Driftkorrektur als die eingesetzten Stickstoff-Vakanz-Zentrum-Fluoreszenz-Nanodiamanten (FNDs) In madSTORM 10 Neben der Beugungsgrenze wird die Lichtmikroskopie durch spektrale Grenzwerte weiter eingeschränkt. Die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Targets erfordert fluoreszierende Sonden mit nicht überlappenden Spektralprofilen, die in der Regel die Fluoreszenz-basierte Lichtmikroskopie auf 6 Farben und SMLM auf 2-3 Farben 4 , 11 , 12 beschränken . Darüber hinaus verursacht eine nichtlineare chromatische Aberration eine Fehlausrichtung von mehrfarbigen Bildern, wDie umfangreiche Ausrichtungsverfahren mit mehrfarbigen Markierungen 8 , 13 erfordern. Um diese Grenzen zu überwinden, haben frühere Studien mehrere Targets unter Verwendung eines wiederholten Photobleichens oder chemischen Quenchens von sequentiell gebundenen Fluorophoren 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 abgebildet. Während diese Verfahren die spektralen Grenzen der Mikroskopie überwinden können, ist das Fluoreszenzbleichen bekannt als ein toxisches Verfahren 20 , und ein verlängertes Bleichen oder Abschrecken kann unerwünschte Nebenwirkungen wie den Verlust der Vernetzung verursachen. Darüber hinaus könnte die Anhäufung von fluoreszierenden Sonden zu einer sterischen Blockierung von Bindungsstellen in der Probe führen, was ein großflächiges Multiplexen und ein robustes Targeting von Epitopen verhindert. Um eine solche sterische Störung zu vermeiden,Tudy erreichte Multiplexing mit stochastischem Austausch von frei diffundierenden Proteinfragmenten 21 . Während dieses Verfahren eine dichte Markierung von zellulären Strukturen ermöglicht, erfordert es eine umfangreiche biochemische Präparation, um Peptidfragmente zu isolieren, kann keine Einzelmolekülpositionen lokalisieren und erleichtert nicht leicht das Multiplexen mit großem Maßstab unter Verwendung von handelsüblichen Sonden. Wir präsentieren ein detailliertes Video-Protokoll, das die sequentielle Bindung und Elution von fluoreszierenden Antikörpern für gemultiplexte, antikörpergrßenbeschränkte dSTORM (madSTORM) -Bildgebung und die Verwendung von fluoreszierenden Nanondiamanten beschreibt, um eine präzise Driftkorrektur und Ausrichtung zu erreichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">8 well coverslip chamber</td>
			<td style="width:117px;">Lab-tek</td>
			<td style="width:124px;">155409</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NV-100nm Fluorescent Nano-diamond</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>Red FND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD3&#949; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin, Fraction V</td>
			<td>KSE Scientific</td>
			<td>98-100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15712</td>
			<td>Carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin from fresh water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A20186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7154</td>
			<td>Highly toxic, air sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cysteamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070</td>
			<td>Highly toxic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyclooctatetraene 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td>Highly toxic, air sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x TBS</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly multiplexed, super-resolution imaging of t cells using madstorm

Die Imaging heterogener zellulärer Strukturen unter Verwendung einer Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie wurde durch unzureichende Lokalisierungsgenauigkeit und Multiplexfähigkeit behindert. Unter Verwendung von fluoreszierenden Nano-Diamant-Markierungsmarkern beschreiben wir die Driftkorrektur- und Ausrichtungsverfahren, die erforderlich sind, um eine hohe Präzision in der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie zu erhalten. Zusätzlich wird eine neue Multiplex-Strategie, madSTORM, beschrieben, bei der mehrere Moleküle in der gleichen Zelle mit sequentieller Bindung und Elution von fluoreszierenden Antikörpern gerichtet werden. MadSTORM wird auf einer aktivierten T-Zelle demonstriert, um die Orte verschiedener Komponenten innerhalb einer membrangebundenen, Multi-Protein-Struktur, die so genannte T-Zell-Rezeptor-Mikrocluster, zu visualisieren. Darüber hinaus wird die Anwendung von madSTORM als allgemeines Werkzeug zur Visualisierung von Multi-Protein-Strukturen diskutiert.

Das sequentielle Elutions- und Färbeverfahren wurde verwendet, um das gemultiplexte madSTORM-Bild von Mikroclustern und anderen Strukturen in einer aktivierten Jurkat-T-Zelle zu erzeugen ( Fig. 1 , Kontrollfigur-Ausrichtungen). Jedes pseudofarbige Bild repräsentiert eine Runde der madSTORM-Bildgebung, die in den Schritten 1.1.1 bis 1.3.13 erworben wurde. Wie zuvor beschrieben, sollte das Sichtfeld auf Restsignal von vorherigem, nicht-eluiertem Antikörper ...

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Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Wir zeigen eine Methode, um mehrere Moleküle innerhalb heterogener Nanostrukturen bei Einzelmolekülgenauigkeit unter Verwendung sequentieller Bindung und Elution von fluoreszenzmarkierten Antikörpern abzubilden.

Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K Aufrufe.  National Institutes of Health.  Wir zeigen eine Methode, um mehrere Moleküle innerhalb heterogener Nanostrukturen bei Einzelmolekülgenauigkeit unter Verwendung sequentieller Bindung und Elution von fluoreszenzmarkierten Antikörpern abzubilden. 

Serie: Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Mittelung der Virushülle Glykoprotein-Spikes von Electron Cryotomography Rekonstruktionen mit Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll