Diese Arbeit wurde durch den NIH Director es New Innovator Award DP2OD006466 (nach K.C.H.) unterstützt. Die Autoren danken Russell Monds für eine praktische Demonstration der Methode und für wissenschaftliche Diskussionen.

1. Wachsen Sie bakterielle Kulturen in 2,5 ml Medien über Nacht
Rückverdünnungskulturen 1:100 in 250 ml Frischmedien und wachsen auf OD600 von 0,7-0,8 an. Bereiten Sie eine Lösung von 6% Natriumdodecylsulfat (SDS) in Wasser vor.
VORSICHT: SDS Pulver ist gefährlich - vermeiden SDS Pulver einatmen; eine Maske über Nase und Mund tragen.
2. Tag 1 - Lysing Bakterielle Kulturen wird im Laufe eines Tages und über Nacht durchgeführt
<ol><li>Während verdünnte Kulturen wachsen, stellen Sie ein kochendes Wasserbad auf einer Kochplatte in einem 1 L Becher auf. Sobald das Wasser kocht, aliquot 6 ml 6% SDS in 50 ml Polypropylen-Röhren, fügen Sie einen kleinen Rührstab zu jedem Rohr, sichern Rohrdeckel fingerdicht, legen Sie Rohre in Wasserbad, und schalten Sie das Rühren auf 500 U/min auf der Kochplatte.</li>
	<li>Die 250 ml-Kulturen bei 5.000 × g 10 min bei Raumtemperatur ernten und Pellets in 3 ml Medien oder 1x phosphatgepufferter Saline wieder aufhängen. Langsam Pipette Zell Suspensionen in 50 ml Tuben mit 6% kochenden SDS, um die Zellen zu lyse (Endkonzentration 4% SDS), während die Rohre in das kochende Wasserbad getaucht werden, und schließen Sie die Deckel wieder zu Fingerfest. Zellsuspensionen müssen nach der Resuspendierten schnell in kochende SDS übertragen werden. Abrupte Umweltveränderungen sollten vermieden werden, da dies zu einer fehlerhaften Veränderung der Zellwandstruktur führenkönnte.
</li>
	<li>Deckel kochendes Wasserbad und lassen Sie Zellen für 3 Stunden kochen, überprüfen Sie den Wasserstand regelmäßig und das Wasserbad nachfüllen, wenn nötig. Nach 3 Stunden das Heizelement der Kochplatte ausschalten und über Nacht bei 500 Umdrehungen umrühren.</li>
</ol>3. Tag 2 - Enzymatische Verdauungen werden im Laufe eines Tages durchgeführt
<ol><li>Wenn SDS in den 50 ml Tuben über Nacht gefällt hat, stellen Sie das Wasserbad für weitere 1-2 Stunden zum Kochen. Schalten Sie einen Wärmeblock auf 60 °C ein. Bereiten Sie einen 1 mg/ml Vorrat an Pronase E in 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% w/v NaCl vor und aktivieren Sie Pronase E bei 60 °C für mindestens 30 min.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Ultrazentrifugenset auf 400.000 × g, um Proben für 20 min bei Raumtemperatur zu spinnen, um die großen PG-Polymere zu pellet und damit von anderen zellulären Komponenten zu reinigen. Überstand vorsichtig entfernen und dann jedes Pellet in Raumtemperatur Reinstwasser wieder aufhängen. ANMERKUNG: Das Resuspensionsvolumen hängt vom Volumen der verwendeten Ultrazentrifugenrohre ab; verwenden Sie ein Volumen, das die Rohre mindestens auf halbem Weg füllt, aber das maximale Volumen der Rohre nicht überschreitet. Zentrifugieren/Waschen wiederholen, bis das Wasser während der Resuspension keine Blasen bildet, was darauf hinweist, dass die SDS vollständig entfernt wurde (in der Regel drei Waschungen). Hören Sie auf, das Pellet zu waschen, wenn sich ein weißer Niederschlag bildet, da dies darauf hindeutet, dass die Sacculi zusammenklumpen. Klumpen sind nicht katastrophal, aber Klumpen binden sehr stark an Kunststoff und Glaswaren, was zu einem großen Probenverlust führt. Fahren Sie in diesem Fall mit dem Protokoll unter Verwendung der verklumpten Sacculi-Probe fort.</li>
	<li>Setzen Sie die Proben beim letzten Zentrifugations-/Waschschritt in 900 l von 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06 % w/v NaCl wieder auf und übertragen Sie sie in 2 ml-Röhrchen, die zuvor mit Löchern in den Oberteilen mit einer kleinen Nadel gestochen wurden. Zu jeder Probe 100 l von 1 mg/ml aktivierter Pronase E (100 g/ml Endkonzentration) geben und bei 60 °C für 2 Stunden inkubieren. Stellen Sie einen anderen Wärmeblock auf 100 °C ein.</li>
	<li>Stoppen Sie die Pronase E-Verdauung, indem Sie jeder Probe 200 l 6% SDS hinzufügen und die Proben im 100 °C-Wärmeblock 30 min kochen. Stellen Sie einen anderen Wärmeblock auf 37 °C ein und machen Sie einen 1 mg/ml-Vorrat an Muramidase (Mutanolysin) in 50 mM Phosphatpuffer (pH 4.9).</li>
	<li>Verwenden Sie wie in Schritt 3.2 ein Ultrazentrifugenset auf 400.000 × g, um Proben für 20 min bei Raumtemperatur zu spinnen und mit Raumtemperatur Ultrareinstwasser zu waschen, bis SDS vollständig entfernt ist (in der Regel drei Waschungen). Das Resuspensionsvolumen hängt vom Volumen der verwendeten Ultrazentrifugenrohre ab; verwenden Sie ein Volumen, das die Rohre mindestens auf halbem Weg füllt, aber das maximale Volumen der Rohre nicht überschreitet.</li>
	<li>Beim letzten Zentrifugations-/Waschschritt Proben in 200 l 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 4.9) wieder aufsetzen. Dieses Volumen kann entsprechend der Menge an Peptidoglycan in der Probe angepasst werden und kann artenabhängig sein. Wenn es zuvor veröffentlichte Berichte über HPLC-Analysen für die Arten von Interesse gibt, kann dieser Band auf der Grundlage dieser Quantifizierungen geschätzt werden (eine Zusammenstellung von HPLC PG-Studien finden Sie in den ergänzenden Informationen der Referenz7). Für andere Arten kann die Sacculus-Vorbereitung bis zu diesem Schritt ausgeführt werden, und dann können verschiedene Mengen von Resuspension-Volumes hinzugefügt werden, um Proben zu replizieren, um das minimale Volumen zu bestimmen, das es dem PG ermöglicht, in lösungsweise zu bleiben (siehe Diskussion für weitere Schätzungen). Wenn die Probe mehr Peptidoglycan enthält, erhöhen Sie das Resuspensionsvolumen; Wenn die Probe wenig Peptidoglycan hat, reduzieren Sie das Resuspensionsvolumen auf mindestens 50 l.</li>
	<li>Die Proben in 1,5 ml Tuben geben und 1 mg/ml Muramidase hinzufügen, um eine Endkonzentration von 40 g/ml zu ergeben. 6-8 Stunden oder über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
</ol>4. Tag 3 - Die Vorbereitung der Proben für UPLC wird am letzten Tag durchgeführt
<ol><li>Schalten Sie einen Wärmeblock auf 100 °C ein. Kochen Sie die Proben ohne SDS für 5 min, um die Muramidase-Verdauung zu stoppen. Zentrifugenproben für 10 min bei 16.000 × g bei Raumtemperatur, dann den Überstand (Muropeptiden sind jetzt löslich) auf 13 mm x 100 mm Glasrohre übertragen. Versuchen Sie, so viel Überstand wie möglich zu erholen, immer sehr nah an das Pellet, ohne es zu stören.</li>
	<li>Stellen Sie den pH-Wert ein, indem Sie der Probe 500 mM Boratpuffer (pH 9) für eine Endkonzentration von 100 mM Boratpuffer hinzufügen. Boratpuffer ist kompatibel mit dem Reduktionsmittel Natriumborohydrid. Fügen Sie 1-2 Körner Natriumborohydrid hinzu, um jede Probe zu reduzieren und die Reaktion mindestens 30 min bei Raumtemperatur laufen zu lassen. VORSICHT: Natriumborohydrid ist hochreaktiv und gefährlich zu handhaben - vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut (Handschuhe tragen) und vermeiden Sie den Kontakt mit den Augen (Schutzbrille).</li>
	<li>Passen Sie die Proben auf pH 3-4 (der isoelektrische Muropeptidpunkt beträgt 3,5) mit 50 % v/v Orthophosphorsäure mit 20-l-Schritten bis pH 6, gemessen mit pH-Indikatorpapier, und dann mit 2-l-Schritten. VORSICHT: Orthophosphorsäure ist korrosiv und gefährlich zu handhaben - vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut (Handschuhe tragen) und vermeiden Sie den Kontakt mit den Augen (Schutzbrille). Die Probe sollte als Reaktion auf die Zugabe von Orthophosphorsäure sprudeln; Wenn die Probe nicht mehr sprudelt, weist dies in der Regel darauf hin, dass ein pH-Wert von 6 erreicht wurde. Wenn in der Probe kein Blasen auftritt, kann dies darauf hindeuten, dass die Menge an Natriumborohydrid zugesetzt wurde, die zu klein war. In diesem Fall, stoppen Sie die Senkung des pH-Werts, fügen Sie vorsichtig ein oder zwei Körner Natriumborohydrid hinzu, lassen Sie 5-10 min reagieren, dann setzen Sie die pH-Einstellung fort.</li>
	<li>Filtern Sie die Probe durch einen 0,22 m Spritzenfilter direkt in eine UPLC-Durchstechflasche. Wenn sich ein Niederschlag gebildet hat, erhitzen Sie das Rohr mit mehreren Bahnen durch eine Flamme, bevor Sie filtern. Wenn die Probe nicht innerhalb des Tages in das UPLC-Instrument injiziert wird, frieren Sie über Nacht bei -20 °C ein. Proben können bis zu einem Jahr bei -80 °C gelagert werden. Die Probe kann aufgetaut werden, indem sie mehrmals durch eine Flamme geht.</li>
	<li>Injizieren Sie 10 l jeder Probe auf ein UPLC-Instrument, das mit einer C18 1,7-m-Umkehrphasensäule und einem Absorptionsdetektor ausgestattet ist, um 202-208 nm zu überwachen. Proben werden sequenziell injiziert, aber Autosampler-Funktionen ermöglichen die Verarbeitung von bis zu 96 Samples im Batch. Verwenden Sie 50 mM Natriumphosphat (pH 4,35) + 0,4 % v/v Natriumazid für Lösungsmittel A und 75 mM Natriumphosphat (pH 4,95) + 15 % v/v Methanol für Lösungsmittel B. HINWEIS: Natriumazid wird hinzugefügt, um die 205 nm Absorption von Methanol auszugleichen, um eine Basisdrift zu vermeiden. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,25 ml/min ein und verwenden Sie einen linearen Gradienten über 25 min, um 100% Lösungsmittel B und sequentielle Elution von Muropeptiden innerhalb von 30 min zu erreichen. Wenn die Massenspektrometrie verwendet wird, um Muropeptide nach UPLC zu charakterisieren, sammeln Sie Bruchteile des Spitzenwerts eines Anteilssammlers und trocknen Sie die Fraktionen mit einem Zentrifugalverdampfer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+rod-shaped+sacculi.">Morphogenesis of rod-shaped sacculi.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).</li><li>Holtje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+stress-bearing+and+shape-maintaining+murein+sacculus+of+Escherichia+coli.">Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).</li><li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. 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Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).</li><li>Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+a+preeminent+technique+in+pharmaceutical+analysis.">UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis.</a> Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).</li><li>Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+&amp;#34;ultra+performance&amp;#34;+liquid+chromatography+coupled+to+oa-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies.">High resolution &amp;#34;ultra performance&amp;#34; liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).</li><li>Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+in+microbiological+diagnostics-identification+of+microorganisms+and+beyond+(mini+review).">MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review).</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).</li></ol>

Die Produktionskosten für diesen Artikel wurden von der Waters Corporation gesponsert.

Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist Schritt 3.1 des zweiten Tages der Probenvorbereitung. Wenn die SDS über Nacht gefällt hat oder wenn die Proben mehrere Wochen lang in 4% SDS bei Raumtemperatur gelagert wurden, müssen die Proben mindestens 1 Stunde neu geölt werden, um die SDS wieder aufzulösen. Eine häufige Ursache für SDS-Fällung ist die Verwendung von Medien mit Kaliumsalzen, daher sollte Kalium möglichst in Medien vermieden werden. Wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse erwähnt, ist es auch...

Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, intakte bakterielle Zellwände (Sacculi) zu isolieren und das Peptidoglycan (PG) so zu verdauen, dass Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) verwendet werden kann, um Informationen wie die Identität der Muropeptidkomponenten und ihre Konzentrationen, die durchschnittliche Länge der Glykan-Stränge und den Anteil des Materials, das an Querverbindungen zwischen Strängen beteiligt ist, bereitzustellen. Für eine detaillierte Diskussion der PG Biochemie und Mutropptinatsarten, gibt es mehrere ausgezeichnete Bewertungen, die PG-Struktur und seine Rolle bei Infektion, Resistenz, Morphogenese und Wachstumbeschreiben 1-6. Die High Performance Liquid Chromatography (HPLC) für die PG-Analyse wurde ursprünglich von Glauner und Schwarz in den 1980er Jahren entwickelt und in jüngerer Zeit in den Laboren von Miguel de Pedro und Waldemar Vollmer umfassend aufgetragen. Frühere Methoden verwendeten Aminosäureanalyse oder Papierchromatographie, zeitaufwändige und mühsame Techniken, die keine genaue oder vollständige Bewertung von Zellwandkomponenten liefern.
Die UPLC-Analyse kann einfach in jedem Basisforschungslabor implementiert werden, das Zugriff auf eine Ultrazentrifuge und UPLC hat. Die UPLC-Methode, die wir unten vorstellen, isoliert vollständige Sacculi und liefert so umfassende, quantitative Informationen über alle darin enthaltenen chemischen Arten. Diese Methode liefert eine präzise Quantifizierung aller Muropeptide über eine Bakterienpopulation, alle innerhalb eines 20-min-UPLC-Laufs. Die Umsetzung dieser Methode beinhaltet nur grundlegende Laborfertigkeiten, ohne nennenswerte finanzielle Investitionen in Materialien. Um die Schritte in dieser Methode auszuführen, müssen die Forscher nur in pipettieren, Puffer und Enzyme vorbereiten und den pH-Wert anpassen, um es für eine Breite von wissenschaftlichen Disziplinen zugänglich zu machen. Die Wahl der in diesem Protokoll verwendeten Enzyme hängt von der analysierten Bakterienart ab; das hier beschriebene Protokoll ist nützlich für Escherichia coliund hat sich im Allgemeinen als ausreichend für die Isolierung von Sacculi von anderen Gram-negativen Organismen erwiesen. Die Konsultation der Literatur wird empfohlen, wenn diese Methode auf Gram-positive Bakterien angewendet wird; bei diesen Arten ist die Sacculus-Reinigung traditionell schwieriger. Insbesondere kann diese Methode in Bezug auf Enzymwahl und Länge der Verdauungszeiten geändert werden müssen, um die dickeren Wände und Zubehörpolymere wie Teichosäuren von Gram-positiven Bakterien unterzubringen. Das erste Enzym in diesem Protokoll spaltet die an der Peptidoglykan-Anlage des Peptidoglykans angebrachte Anhaftung des äußeren Membranlipoproteins (wie Brauns Lipoprotein oder Lpp) und löst damit bis auf das C-terminale Di- (oder Tri-) Peptid des Lpp von der Zellwand. Dieser Schritt ist notwendig bei der Untersuchung enterobacteria, aber viele andere Gram-negative Bakterien haben keine Lpp-Äquivalente, und daher kann dieser Schritt übersprungen werden. Ein zweites Enzym spaltet speziell nach der Muramicsäurekomponente des Peptidoglykans und llüflisiert die Disaccharid-Untereinheit, die die Muropeptid-Arten bildet. Um eine genaue Bewertung der Architektur des PG zu liefern, sollte bei der Verdauung der Sacculi darauf geachtet werden, eine Spaltung der Querbrücken oder eines anderen Teils des Peptidstamms zu verhindern.
Obwohl die chemischen Zusammensetzungen von Peptidoglycan aus über 100 Stämmen von 40 Bakterienarten mit HPLC analysiert wurden, wurden keine Analysen mit UPLC-Technologie durchgeführt. Darüber hinaus hat die vorherige Arbeit Peptidoglycan nur von einem kleinen Bruchteil der bakteriellen Domäne charakterisiert, teilweise durch den Durchsatz von HPLC begrenzt. Daher wird die Verbreitung dieser Methode an so viele Forscher wie möglich und die Implementierung auf UPLC-Plattformen entscheidend für die Förderung physiologischer Studien des großen Anteils von Bakterienarten sein, deren Peptidoglycan noch kategorisiert werden muss.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Pronase E</td>
			<td style="width:115px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">E629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mutanolysin from Streptomyces</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium borohydride (NaBH4)&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">452882</td>
			<td>Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orthophosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">79607</td>
			<td>Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td>Sodium azide is a poison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex 0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH strips (pH range 0-6)</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M95863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene Falcon tubes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">13 mm x 100 mm glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:119px;">60CM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial</td>
			<td style="width:115px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000327C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:115px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9820</td>
			<td>SDS powder is hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Instrumentation</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Waters Acquity UPLC H-Class system, including:</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#181;m column</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC PDA Detector</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
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			<td height="21" style="height:21px;">Waters Fraction Collector III</td>
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			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler</td>
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isolation and preparation of bacterial cell walls for compositional analysis by ultra performance liquid chromatography

Die bakterielle Zellwand ist entscheidend für die Bestimmung der Zellform während des Wachstums und der Teilung, und bewahrt die mechanische Integrität der Zellen im Angesicht von Turgordrücken mehrere Atmosphären in der Größe. Über die verschiedenen Formen und Größen des bakteriellen Königreichs hinweg besteht die Zellwand aus Peptidoglykan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch kurze Peptide vernetzt sind. Peptidoglycans zentrale Bedeutung für die bakterielle Physiologie liegt seiner Verwendung als Antibiotikum-Ziel zugrunde und hat genetische, strukturelle und zellbiologische Studien motiviert, wie es während des Wachstums und der Teilung robust zusammengesetzt wird. Dennoch sind noch umfangreiche Untersuchungen erforderlich, um die wichtigsten enzymatischen Aktivitäten in der Peptidoglykan-Synthese und die chemische Zusammensetzung von bakteriellen Zellwänden vollständig zu charakterisieren. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ist eine leistungsstarke analytische Methode zur Quantifizierung von Unterschieden in der chemischen Zusammensetzung der Wände von Bakterien, die unter einer Vielzahl von ökologischen und genetischen Bedingungen angebaut werden, aber sein Durchsatz ist oft begrenzt. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Isolierung und Herstellung von bakteriellen Zellwänden für biologische Analysen von Peptidoglycan über HPLC und Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) vor, eine Erweiterung von HPLC, die Pumpen verwendet, um ultrahohe Drücke von bis zu 15.000 psi zu liefern, verglichen mit 6.000 psi für HPLC. In Kombination mit der hier vorgestellten Herstellung von bakteriellen Zellwänden ermöglichen die probengeringen Injektoren, Detektoren mit hohen Abtastraten, kleineren Probenvolumina und kürzeren Laufzeiten von UPLC eine hohe Auflösung und einen Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykanzusammensetzung und grundlegende bakterielle Zellbiologie in den meisten biologischen Laboratorien mit Zugang zu einer Ultrazentrifuge und UPLC.

Nach dem in Abbildung 1beschriebenen Verfahren sollte die endige Probe aus mindestens 200 l klarer Lösung bestehen, die direkt in eine UPLC-Durchstechflasche gefiltert wurde (Schritt 4.4). Die UPLC-Trennung der verschiedenen Muropeptide in einer bakteriellen Probe beruht auf ihrer relativen Löslichkeit zwischen der flüssigen mobilen Phase und der stationären Phase der Säule. Reversed-Phase C18 Säulen bieten eine stark hydrophobe Matrix, um die Muropeptid-Arten basierend auf Hydrophobie und Größe<...

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Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.

Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

16.0K Aufrufe.  Stanford University. Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.

Serie: Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Forschung

Chemie

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

Der Einsatz von Gas-Chromatographie zu Änderungen der Zusammensetzung der Fettsäuren in Rattenlebergewebe während der Schwangerschaft Analysieren

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

Synthese und katalytische Aktivität von Gold-Intercalated in den Wänden der mesoporösen Silicat-

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

Eine einfache Methode zur Glucosinolate Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully understood. We have traced the trajectories of individual nanoparticles using liquid-cell transmission electron microscopy (TEM) to investigate the mechanism of the assembly process. Herein, we present the protocols used for liquid-cell TEM studies of the self-assembly mechanism. First, we introduce the detailed synthetic protocols used to produce uniformly sized platinum and lead selenide nanoparticles. Next, we present the microfabrication processes used to produce liquid cells with silicon nitride or silicon windows and then describe the loading and imaging procedures of the liquid-cell TEM technique. Several notes are included to provide helpful tips for the entire process, including how to manage the fragile cell windows. The individual motions of nanoparticles tracked by liquid-cell TEM revealed that changes in the solvent boundaries caused by evaporation affected the self-assembly process of nanoparticles. The solvent boundaries drove nanoparticles to primarily form amorphous aggregates, followed by flattening of the aggregates to produce a 2-dimensional (2D) self-assembled structure. These behaviors are also observed for different nanoparticle types and different liquid-cell compositions.

Here we introduce experimental protocols for the real-time observation of a self-assembly process using liquid-cell transmission electron microscopy.

Flüssigkeit-Cell Transmissions-Elektronenmikroskopie zur Nachverfolgung Selbstmontage von Nanopartikeln

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...