Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AI064184 und AI76322 von den National Institutes of Health (NIH) und von Grant 61789-MA-MUR vom Army Research Office, um MST Forschung wurde auch von Welch Foundation Grants F1155 und NIH gewähren R01GM103655 zu GKI unterstützt

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Protokoll haben wir die Isolierung von Lipid-A-Arten aus ganzen Zellen von Bakterien beschrieben und beschrieben TLC oder MS auf Basis analytischer Methoden, um dieses isolierte Material chemisch zu charakterisieren. Tandem-Massenspektrometrie ist eine wirkungsvolle Strategie für die de novo Strukturaufklärung von biologischen Verbindungen und ist von unschätzbarem Wert für die chemische Charakterisierung der Palette der Lipid in der Natur beobachtet A-Moleküle. CID und UV-PD sind zwei sich ergä...

Lipopolysaccharid (LPS) der äußeren Hauptfläche Molekül fast allen gramnegativen Organismen und besteht aus drei molekularen Domänen: eine distale O-Antigen-Polysaccharid, ein Kern-Oligosaccharid, und die Membran-assoziierten Lipid A-Domäne auf dem äußeren Blatt der abgeschiedene Außenmembrandoppelschicht 1,2. Die Lipid-A-Domäne besteht aus 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) Resten und einer Lipid-A-Molekülspezies, wobei Lipid A kann als das Chloroform lösliche Teil von LPS bei milder Säurehydrolyse 1 definiert ist, 2. Die Standard-Lipid-A-Molekül kann chemisch als diglucosamine Rückgrat, Hexa-acyliert und bisphosphoryliertes definiert werden, im Einklang mit den in den Modellorganismus Escherichia coli (E. coli) 1,2 beobachtet Haupt Lipid A-Spezies. Neun konstitutiv exprimierte Gene, während gram-negative Bakterien konserviert ist, sind für die Herstellung von Lipid-A-Domäne (Fig. 1) 1,2 verantwortlich. Die meisten Bakterien haben einen zusätzlichen Satz von Genen, die im Grad der phylogenetischen Konservierung variieren, die in weitere chemische Modifikation der Lipid-A-3 teilnehmen. Dephosphorylierung, Entfernen von Acylketten, und die Zugabe von chemischen Gruppierungen, wie Amino-Zucker (z. B. Aminoarabinose) und / oder Phosphoethanolamin sind die am häufigsten beobachteten Aktivitäten (1). Viele der Enzyme, die für Lipid A Modifikation verantwortlich sind, werden direkt durch Umweltsignale, wie zweiwertige Kationen aktiviert ist, oder deren Expression durch zwei Teilantwort-Regler-Systeme 3 geregelt. Anerkennung von Lipid A-Arten durch den Host angeborene Immunsystem wird durch die Toll-like-Rezeptor-4/myeloid Differenzierungsfaktor 2 (TLR4/MD2) Co-Rezeptor 4 vermittelt. Hydrophobe Kräfte zwischen MD2 und der Lipid-A-Acyl-Ketten, sowie zwischen TLR4 und der 1 und 4 &#39;Phosphatgruppen von Lipid A fördern die starke Assoziation der Lippeid A mit TLR4/MD2 4,5. Änderungen, die Acylierung Staat oder die negative Ladung der Lipid A Auswirkungen TLR4/MD2 basierend Lipid A verändern Anerkennung und nachgelagerten Stimulation der angeborenen Immunantwort Aktivatoren NF-kB und Entzündungsmediatoren wie TNF und IL1-β 6,7. Änderungen, die die negative Ladung der Lipid A-Maske verhindern auch bakterizide kationische antimikrobielle Peptide aus der Bindung an gram-negative Zelloberflächen 3,8. Viele Lipid A Änderungen Hypothese aufgestellt, um bakterielle Fitness unter bestimmten Umweltbedingungen, wie im menschlichen Wirt oder in einer ökologischen Nische zu erhöhen. Aus diesem Grund viele Modifikation Enzyme sind attraktive Ziele in der Rationalisierung der antimikrobielle Verbindungen. Die chemische Vielfalt der Lipid-A-Strukturen in Bezug auf Organismus und / oder Umwelt und der biologischen Auswirkungen dieser unterschiedlichen Strukturen machen die strukturelle Charakterisierung von Lipid A ein wichtiges Unterfangen in ter studieren gram-negativer Bakterien. Isolierung von Lipid-A-Moleküle aus ganzen Bakterien umfasst die Extraktion von LPS aus der Bakterienzelloberfläche, einer hydrolytischen Schritt Lipid A zu befreien, gefolgt von einem abschließenden Reinigungsverfahren 9-11. Die am häufigsten genannten LPS Extraktionsverfahren ist das heiße Wasser-Phenol-Extraktionsverfahren, die zuerst von Westphal und Jann 10 eingeführt. Nach Extraktion ganzen LPS ist mild-sauren Hydrolyse, die chemisch trennt Kdo von der 6&#39;-Hydroxylgruppe des distalen Glucosamin-Zucker-Lipid A (Fig. 1) unterzogen. Zahlreiche Gefahren für die Warmwasserphenolverfahren einschließlich der Verwendung eines Hochrisiko-Reagens vorhanden ist, werden die Notwendigkeit der Zusammenarbeit extrahierten Nukleinsäuren und Proteinen und einigen Tagen abgebaut erforderlich, um das Protokoll 10 zu vervollständigen. Unser Labor hat sich weiter die Extraktion und Isolierung von Lipid A entwickelt, wie zuerst von Caroff und Raetz 12,13 entwickelt. Im Vergleich zu Heißwasserverfahren Phenol ist das hier vorgestellte Verfahren schneller und effizienter und bietet eine breite Palette von Kulturvolumen von 5 ml bis mehrere Liter. Darüber hinaus, im Gegensatz zu Warmwasser Phenol-Extraktionen, unsere Methode funktioniert nicht für grobe oder glatte Typen von LPS wählen, eine optimale Wiederherstellung der Lipid-A-Arten. In unserem Protokoll wird eine chemische Lyse ganzer Bakterienzellen unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und Wasser, wo LPS kann durch Zentrifugation pelletiert werden. Eine Kombination von milder Säurehydrolyse und Lösemittelextraktion (Bligh-Dyer) werden verwendet, um Lipid A aus kovalent gebundenen Polysaccharids zu befreien. Das Verfahren von Bligh und Dyer wurde die Extraktion von Lipid-Spezies aus einer Vielzahl von Tier-und Pflanzengeweben 14 aufgebracht, hier modifiziert, um hydrolysierte Polysaccharid aus Lipid A. In diesem letzten Trennstufe zu trennen, Chloroform löslichen Lipide selektiv in die untere organische partitionieren Phase. Um weiter zu reinigen Lipid A, Umkehrphasen-oderAnionenaustausch-Säulenchromatographie verwendet werden 12. Nach der Isolierung von Lipid A-Spezies aus ganzen Zellen, kann eine Anzahl von analytischen Verfahren verwendet, um die chemische Struktur des isolierten Material, wie NMR, TLC und MS-basierte Analyse charakterisiert werden. NMR ermöglicht die zerstörungsfreie Strukturaufklärung und stellt strukturelle Details zu Glycosidbindungen, eindeutige Zuordnung von Acyl-Kettenpositionen und Zuordnung der Bindungsstellen für Lipid-A-Modifikationen wie Aminoarabinose oder Phosphoethanolamin 15-17 zusammen. NMR-Analyse des Lipid A ist nicht in unserem Protokoll diskutiert, hat aber ausreichend anderswo 15,16 beschrieben. Für die schnelle Analyse TLC basierte Methoden werden häufig verwendet, aber nicht, um direkte Informationen über die feinen chemischen Struktur zu schaffen. MS-basierte Protokolle sind die am häufigsten verwendete Methode zur Charakterisierung von Lipid-A-Strukturen 18,19. Matrix zugeordnet Laserdesorptions-Ionisation (MALDI)-MS wird oft verwendet, um zunächst intakt überblicken Lipid A-Spezies. Einfach geladene Ionen von Analyten gemäß unserer Extraktionsverfahren hergestellt erzeugt. Da immer mehr Feinstrukturanalyse erforderlich ist, MS / MS-basierte Methoden beweisen, informativer als MALDI-MS. Gekoppelt Elektrospray Ionisation (ESI) einzeln oder mehrfach geladenen Lipid-A-Vorläufer-Ionen sind weitere Fragmentierung durch Kollision induzierte Dissoziation (CID) oder UV-Photodissoziation (UV-PD), strukturell informative Produkt-Ionen 18,20,21 generieren. Neutralverlust Produkte von Lipid A-Vorläufer-Ionen werden häufig während ESI-MS erzeugt eine zusätzliche Schicht von Strukturinformationen. Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) hat sich als notwendig und vielseitiges Verfahren zur Aufklärung der Lipid-A-Strukturen sein. Während MS / MS werden Ionen aktiviert wird, um eine Diagnosefragmentierungsmuster, die verwendet werden können, um die Struktur des Vorläuferionen aufzuklären ergeben. Die am weitesten AVAilable MS / MS-Methode ist CID. Dieses Verfahren erzeugt Fragment-Ionen durch Stöße der ausgewählten Vorläuferionen mit einem inerten Zielgas, was zu Energiedeposition, die zur Dissoziation führt. CID hat ein wichtiges Werkzeug bei der Zuordnung der Lipid A-Struktur für eine Vielzahl von Bakterienarten 22-33 bewährt. Obwohl CID ist die universell einsetzbar MS / MS-Verfahren, erzeugt es eine begrenzte Reihe von Produkt-Ionen. 193 nm UV-PD ist eine alternative und komplementäre MS / MS-Methode. Dieses Verfahren verwendet einen Laser, um Ionen zu bestrahlen, und die Absorption von Photonen führt Erregung der Ionen und anschließende Dissoziation. Diese höhere Energie MS / MS-Technik erzeugt eine Vielfalt von Produkt-Ionen als CID und bietet mehr informative Fragmentierungsmuster so. Insbesondere UV-PD bietet Informationen zu subtilen Veränderungen in der Lipid-A-Arten, basierend auf Spaltungen an glykosidischen, Amin-, Acyl-und CC-Bindungen verknüpft 18,21,34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

Lipopolysaccharid (LPS) ist die Hauptzelloberflächenmolekül von gram-negativen Bakterien auf dem äußeren Blatt der äußeren Membran-Doppelschicht abgeschieden. LPS kann in drei Bereiche unterteilt werden: der distale O-Polysaccharid, ein Kern-Oligosaccharid und das Lipid A-Domäne, die aus einer Lipid-A-Molekularspezies und 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonic Säurereste (Kdo). Die Lipid-A-Domäne ist die einzige Komponente, die für bakterielle Zellüberleben. Nach der Synthese wird Lipid A chemisch in Reaktion auf Umwelteinflüsse, wie pH oder Temperatur verändert, die Förderung von Resistenz gegen Antibiotika-Verbindungen und die Erkennung durch Mediatoren der Wirts angeborenen Immunantwort zu entziehen. Das folgende Protokoll beschreibt die kleinen und großen Isolierung von Lipid A aus gram-negative Bakterien. Isoliert Material wird dann chemisch durch Dünnschicht-Chromatographie (DC) oder Massenspektrometrie (MS) gekennzeichnet. Zusätzlich zur Matrix-unterstützte Laser-Desorptions / Ionisations-Zeit fLicht (MALDI-TOF) MS beschreiben wir auch Tandem-MS-Protokolle für die Analyse von Lipid einer molekularen Spezies mit Elektrospray-Ionisation (ESI), um eine Kollision induzierte Dissoziation (CID) gekoppelt ist und neu eingestellten UV-Photodissoziation (UV-PD)-Methoden. Unsere MS-Protokolle ermöglichen die eindeutige Bestimmung der chemischen Struktur, ausschlaggebend für die Charakterisierung der Lipid-A-Moleküle, die einzigartig oder neuartige chemische Modifikationen enthalten. Wir beschreiben auch die Radioisotop-Markierung, und die anschließende Isolierung von Lipid A aus Bakterienzellen für die Analyse durch TLC. Bezogen auf MS-basierte Protokolle bietet TLC eine wirtschaftlichere und schnelle Charakterisierung Verfahren, kann aber nicht verwendet werden, um eindeutig zuordnen Lipid eine chemische Strukturen ohne die Verwendung von Standards bekannter chemischer Struktur sein. In den letzten zwei Jahrzehnten Isolierung und Charakterisierung von Lipid A auf zahlreiche spannende Entdeckungen geführt, die unser Verständnis der Physiologie von gram-negativen Bakterien, die Mechanismen der Antibiotika-Widerstand verbessert habentung, die menschliche angeborene Immunantwort, und viele neue Ziele in der Entwicklung antibakterieller Verbindungen vorgesehen.

Canonical Lipid A von E. coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium ist ein Hexa-acylierte Glucosamin-Disaccharid mit Phosphatgruppen an der 1 - und 4 &quot;-Positionen. Während des Wachstums in reichen Medien (z. B. Luria Broth) ein Teil des Lipid-A enthält eine Pyrophosphat-Gruppe an der 1-Position ergibt ein Tris-phosphorylierten Spezies 36 (Fig. 1). KDO-(3-Desoxy-D-manno-octulosonsäure), befestigt an der 6&#39;-Hydroxylgruppe und bilde...

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolierung und Charakterisierung der Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid (LPS) von gramnegativen Bakterien gibt Einblick in Zelloberfläche basierend Mechanismen der Antibiotikaresistenz, bakterielle Überlebensrate und Fitness, und wie chemisch unterschiedlicher Lipid einer molekularen Spezies unterschiedlich modulieren Host angeborenen Immunantwort.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

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31.5K Aufrufe.  The University of Texas at Austin.  Isolierung und Charakterisierung der Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid (LPS) von gramnegativen Bakterien gibt Einblick in Zelloberfläche basierend Mechanismen der Antibiotikaresistenz, bakterielle Überlebensrate und Fitness, und wie chemisch unterschiedlicher Lipid einer molekularen Spezies unterschiedlich modulieren Host angeborenen Immunantwort. 

Serie: Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Forschung

Chemie

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

Eine inverse Analyse Ansatz zur Charakterisierung von chemischen Transport in Farben

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Synthese und Charakterisierung von funktionalisierten Metall-organische Gerüste

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Synthese und Charakterisierung von supramolekularen Kolloid-

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

Mikrofluidische trocken-Spinnen und Charakterisierung von regenerierten Seide Fibroin Fasern

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of this compound commences from [Ru(NH3)5Cl]Cl2 in 1 M NH4OH in a closed container, yielding a green solution. Purification is accomplished with cation-exchange chromatography. This compound is characterized and verified to be pure by UV-vis and IR spectroscopy. The mitochondrial calcium uptake inhibitory properties are assessed in permeabilized HeLa cells by fluorescence spectroscopy.

A protocol for the synthesis, purification, and characterization of a ruthenium-based inhibitor of mitochondrial calcium uptake is presented. A procedure to evaluate its efficacy in permeabilized mammalian cells is demonstrated.

Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.