10SDG3500034 und UTMB-NZB-Start-up-Fonds zu SSM: Diese Arbeit wird durch einen Nationalen Entwicklungs Scientist Zuschuss von der American Heart Association unterstützt. Die Autoren erkennen die Cryo-EM und Wissenschaftliches Rechnen Einrichtungen des Sealy Zentrum für Strukturbiologie am UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ) sowie Drs. Steve Lüdtke und Ed Egelman Hilfe zu den 2D-und 3D-Wendelrekonstruktionsalgorithmen.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Pufferaustausch menschlichen FVIII-BDD 14 und Schweine-FVIII BDD 15 gegen HBS-Ca-Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH = 7,4) und konzentriert, um 1,2 mg / ml. Halten der Proteinlösung bei -80 ° C. </li><li> Vorbereitung Lipidnanotubes (LNT) durch Mischen Galactosylceramid (GC) und Phosphatidylserin (PS) bei 1.04 w / w-Verhältnis in Chloroform. Verdampfe das Chloroform unter Argon und Solubilisierung der Lipide in HBS-Puffer auf 1 mg / ml. Halten Sie die LNT-Lösung bei 4 ° C </li></ol> 2. Kryo-Elektronenmikroskopie von FVIII-LNT <ol><li> Cryo-EM Probenvorbereitung <ol><li> Glimmentladung das 300 mesh Quantifoil R2 / 2 Kupfergitter (Kohlenstoff Seite nach oben) in einem Gemisch aus O 2 und H 2-Gas für 10 s bei 50 W. </li><li> Mischen der FVIII und LNT Lösungen in HBS-Ca-Puffer im Verhältnis 1:1 w / w-Verhältnis und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Geben Sie einen Tropfen 2,5 ulFVIII-LNT Probe auf die hydrophilen Rasterelektronenmikroskopie im Vitrobot Mark IV befeuchteten Kammer (100% Luftfeuchtigkeit). </li><li> Blot und Flash einfrieren das Raster (ein Blot für 3,5 sec, tupfen Kraft 1) in flüssiger C 2 H 6, abgekühlt durch flüssige N 2 zu amorphem Eis zu erhalten. </li><li> Shop Netze in Lagerboxen unter flüssigem N 2 (LN2). </li></ol></li><li> Cryo-EM Data Collection HINWEIS: Die JEM2100-LaB6 (Jahr 2010) wird mit einem TemCon Betriebssystem, bestehend aus einem Computer mit dem Elektronenmikroskop, einem Bildschirm mit Fenstern Lesen der Vakuumanlage, Beleuchtungssystem, HT, Linsenströme und so weiter, und zwei miteinander verbundene ausgestattet Platten: links und rechts, auf beiden Seiten der Säule befindet. Die Strahlverschiebung X-, Y-Knöpfe (SHIFT Y, Y SIFT) und das Multifunktionsgerät (DEF / STIG) Knöpfe sind auf beiden Platten. Auf der linken Seite ist die Beleuchtung (Brigthness) Knopf. Auf der rechten Seite sind: die Vergrößerung (MAG / CAM-Länge) und Fokus (FOCUS) und die drei Knöpfe imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) und ein Beugungs Modi-Tasten (DIFF). Wir erwerben unsere Daten in MAG1 bei alpha 2. Die Mindestdosis Beleuchtungsbedingungen (MDS) für Kryo-EM Datenerfassung erforderlich sind mit F1 bis F6-Tasten, obere Reihe auf der RECHTEN Bedienfeld einstellen. In diesem Protokoll die allgemeinen Einstellungen werden verwendet: F1 - heben / senken Bildschirm, F2 - SEARCH-Modus, F3 - FOCUS Modus F4 - FOTO-Modus F5 - MDS OFF / ON und F6 - BEAM BLANK, verwendet, um die Probe von der Strahlung abschirmen Schäden, die durch Ablenken des Strahls. <ol><li> Legen Sie die Kryo-Halter in die Kryo-Station und füllen Sie den Dewar des Halters und der Kryo-Station mit LN2. Wenn die Temperatur erreicht -192 ° C, offener Blende am Halter Spitze, Platz vorher eingefroren Cryo-EM Gitter in die vorgesehene Stelle und mit einem Klemmring. </li><li> Legen Sie die Kryo-Halter in das Elektronenmikroskop. Füllen Sie den Dewar der Kryo-Halter und dem Anti-contaminator Kammer mit LN2. Warten Sie, bis der Halter für 30-60 min zu stabilisieren. Drücken Sie F6 auf unddrehen Sie den Faden auf. Wenn der Faden gesättigt ist, drücken Sie F6 aus und offener Blende auf Halter, um das Raster zu sehen. </li><li> Presse Low Mag / alpha 1 (bei 200X mag eingestellt), und suchen Bereiche mit dünnen Eis auf dem Netz. </li><li> Wechseln Sie zu MAG 1/alpha 2 bis Mindestdosis (MDS) eingestellt und Cryo-EM-Daten zu erwerben bei niedrigen Elektronendosen, ohne Beschädigung der Probe. <ol><li> Drücken Sie F2, um den Suchmodus eingestellt. Stellen Vergrößerung bei 40.000 x. Vergrößern Strahl mit brigtness Knopf, um minimale Elektronendosis ~ 0,04 E - / Å 2 · s. Presse DIFF zu Beugungsmodus zu wechseln. Stellen Sie die Kamera auf 120 cm Länge mit MAG / CAM LÄNGE Knopf. Suchen Flächen auf dem Gitter in den vorgewählten Bereichen in LOWMAG die Lipid-Nanoröhren in den Löchern des Kohlenstofffilms haben. </li><li> Drücken Sie F4, Foto-Modus bei 40.000-facher Vergrößerung eingestellt und stellen Sie Beleuchtung mit Helligkeitsknopf in Dosen von 16 bis 25 E - / Å 2 · s. Standard-Fokus-Taste drücken, um den Fokus Bedingungen eingestellt Einstellung der Z-Höheder Probe mit der Z-UP / DOWN-Tasten (rechts-Bedienung). Unschärfe-Set zwischen -1.5 und -2.5 um. </li><li> Richten Sie SEARCH und Fotomodus, indem ein Platz in der LIVE-VIEW-Fenster auf dem Digitalkamera-Monitor im Suchmodus entsprechend den in PHOTO-Modus abgebildet werden. </li><li> Drücken Sie F3, um Fokusmodus bei 100.000-facher Vergrößerung eingestellt. Fokus Beleuchtung, um die CCD-Chips decken (ca. 4 - 5 cm Radius) und von der Achse, um die Gegend in PHOTO-Modus abgebildet werden nicht bestrahlen. Stellen Defokus auf ~ -1.5 -2.5 und um mit dem FOCUS-Knopf und korrigieren Astigmatismus des Bildes mit DEF / STIG Knöpfe. </li></ol></li><li> Wählen Sie das FVIII-LNT im SEARCH-Modus durch den Erwerb von Live-Bildern in der Liveansicht-Fenster auf dem Digitalkamera-Monitor abgebildet werden. Zentrieren Sie die FVIII-LNT auf dem Platz auf der Live-View-Fenster gezogen. </li><li> Nehmen Sie ein digitales Bild auf der CCD-Kamera auf 52.000 X effektive Vergrößerung und 0,5 sec Belichtungs durch Umschalten in den Fotomodus und auf die AcquirE-Taste auf der digitalen Kamera-Aufnahme-Monitor. Die Bildaufnahmebedingungen sind wie die Beam-Blank (TERS) öffnen sich nur, wenn das Bild im Foto-Modus erworben gesetzt. </li><li> Prüfen Sie die Qualität und Defokussierung des aufgenommenen Bildes durch Drücken von STRG-F zu erhalten, eine Fast-Fourier-Transformation (FFT). </li></ol></li></ol> 3. 3D-Rekonstruktion HINWEIS: Die Bildanalyse-Software für die 2D-und 3D-Analyse verwendet: EMAN2 IHRSR und sind frei verfügbar. EMAN2 aus http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install heruntergeladen werden. Egelman@virginia.edu: Die IHRSR Software kann von Professor Egelman erhalten werden. Die endgültigen IHRSR Weiterbildungen sind auf der Texas Advanced Computing Center laufen Cluster: http://www.tacc.utexas.edu/ an der Universität von Texas, Austin. Die in Fig. 1 dargestellte 3D-Rekonstruktionsalgorithmus besteht aus zwei Schritten: zuerst einen homogenen Satz von helikalen Segmenten (Partikel) mit dem 2D-freien Referenz alignmein EMAN 2 nt (RFA) Algorithmen implementiert, die zweite Erreichen einer 3D-Rekonstruktion auf der Grundlage der Wendel Parameter und Rückprojektionsalgorithmen in IHRSR eingebaut. Der erste Schritt für die Auswahl nutzt die homogene Partikelmengen für die 3D-Rekonstruktion mit Single Particle SPA (Algorithmen), für die EMAN2 wurde speziell entwickelt und vertrieben entwickelten Programme: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Dieser Schritt wurde den Cryo-EM-Daten angepasst. Der zweite Schritt wird mit dem IHRSR Algorithmus, der spezifisch für die Art der Schraubenanordnungen mit den rekombinanten Faktor VIII-Formen erhalten gestaltet erreicht. Dieser Algorithmus ist weitgehend durch die wissenschaftliche Literatur 12 dokumentiert. <ol><li> Führen 2D-Bildanalyse mit dem EMAN2 wissenschaftliche Bildverarbeitungssuite: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 bis homogene Partikel (Wendelsegment) Sätze für Wendel Rekonstruktion auswählen. <ol><li> Wählen Cryo-EM mikroskopischen Aufnahmen mit straigmit der Digitalkamera-Software-und Visualisierungstools ht und gut organisierte Wendelrohre. </li><li> Umkehren, normalisieren und Filter für Röntgenbildpunkte in der GUI e2workflow.py, Einzelpartikel Rekonstruktion (spr) Option: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> Importieren der invertierten normierten und Röntgen gefilterten Pixelbilder in der e2helixboxer.py GUI. Wählen FVIII-LNT Wendelrohre und Segment bei 256 x 256 Pixel (2,9 Å / pix) mit 90% Überdeckung mit: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Bewerten Sie die Unschärfe-mikroskopische Aufnahmen von den ursprünglichen und gelten Kontrastübertragungsfunktion (CTF) Korrektur (nur Phasenkorrektur) auf die spiralförmige Segmente aus den gleichen Mikroaufnahmen mit der e2ctf.py Option in der e2workflow.py eingebaut: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> Generieren ersten Partikel (Wendelsegmente) setzt in der e2workflow.py GUI - SPR Option: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Berechnen 2D-Klasse mit Durchschnittswerten der Referenz e2refine2d.py Algorithmus Anwendung kostenlos k-Mittelwert Klassifizierung für einheitliche Datensätze mit dem gleichen Durchmesser LNT und der Grad der spiralförmigen Ordnung (Abbildung 2) zu wählen, nach dem Skript: &quot;e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - Eingang = INPUT.hdf - NCL = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = Phase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = Mittelwert - normproj-classkeepsig &#39;, die Änderung der NCL-Wert entsprechend. <ol><li> Klassifizieren Sie die Anfangsdaten in 150 Klassen NCLs = 151 &#39;über 8 Iterationen mit&#39; classkeep = 0,8 &#39;gesetzt, was bedeutet, dass Partikel mit weniger als 80% Ähnlichkeit zu dem Klassendurchschnitt werden aus der gegebenen Klasse ausgeschlossen. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Merge-Partikel aus der Klasse Mittelwertemit ausgeprägten spiralförmigen Beugungs in e2display.py Zwischendatensatz zu erstellen. </li><li> Klassifizieren Sie die Zwischendaten in 50 Klassen NCLs = 51 &#39;gesetzt, um Klassen mit gleichem Durchmesser und Grad der Ordnung zu unterscheiden. </li><li> Merge Partikel aus Klassen mit gleichem Durchmesser und Grad der Ordnung in e2display.py, um die endgültige Datensatz für die dreidimensionale Rekonstruktion zu erstellen: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector. </li></ol></li></ol></li><li> Führen Sie mit dem spiralförmigen Wiederaufbau Iterative Helical Real Space Wiederaufbau (IHRSR)-Algorithmus, wie in Egelman 17, 18 beschrieben. <ol><li> Schätzung der Anstieg &amp;Dgr; z (Å) des FVIII-LNT Helix aus dem kombinierten Fourier-Transformation der Teilchen in dem endgültigen Datensatz. </li><li> Definieren Sie den Azimutwinkel ΔΦ (º) durch mit einem konstanten Az parallel IHRSR Verfeinerungen, die Erhöhung von 5 ΔΦ76; bis 60 ° in 5 °-Schritten. </li><li> Führen Sie 100 aufeinanderfolgenden Zyklen IHRSR für jeweils endgültige Daten mit einer gesichtslosen Zylinder als ein Anfangsvolumen und den ersten Wendel Parameter Az und ΔΦ wie in 3.2.1 definiert ist. und 3.2.2. </li><li> Überprüfen Sie die letzten Bände für die Konvergenz der Schraubenparameter und Korrespondenz zwischen Klassendurchschnittswerte aus dem 2D-Klassifizierung des Datenkörpers und die Vorsprünge aus der letzten IHRSR Wiederaufbau. </li><li> Symmetrie aufzuerlegen, um den endgültigen 3D-Rekonstruktionen, die der asymmetrischen Einheit in der endgültigen Verteilung asymmetrisch 3D-Volumen beobachtet: 4-fach für den menschlichen FVIII-LNT und 5-fach für Schweine-FVIII LNT. Führen Sie weitere 100 Verfeinerung Zyklen, um eine endgültige symmetrisierten 3D-Rekonstruktion zu erzeugen. </li><li> Berechnen Sie die Fourier Shell Correlation-Kurve für beide Mengen, indem man zuerst die entsprechenden Daten in gerade und ungerade gesetzt: &quot;e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;outfile&gt; - split = 2 &#39;. Dann führen Sie in Folge 100 IHRSR Verfeinerungen wie in 3.2.3 beschrieben. Berechnen Sie die FSC der 3D-Volumen aus den geraden und ungeraden Datensätze erstellt: &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc. </li></ol></li><li> Visualisieren und Segment die FVIII-LNT Volumen in UCSF Schimäre. </li><li><ol><li> Öffnen Sie die letzten Bände von Schritt 3.2.5. in UCSF Chimera und stellen Sie die Kontur Ebene zu 0,005 in der TOOLS&gt; VOLUME DATA&gt; Volume Viewer-Option. </li><li> In TOOLS&gt; VOLUME DATA&gt; SEGMENT MAP, wählen Volumen in SEGMENT Registerkarte MAP und klicken Sie auf Segment zu Segment ist die Lautstärke. </li><li> Konzernsegmente, die einer Einheitszelle, indem Sie mit STRG + SHIFT und Klicken-Gruppe. </li><li> Farbe der Segmente durch Elementarzelle und Helix mit AKTIONEN&gt; COLOR Option, um die Strukturmerkmale betonen. </li></ol></li></ol> 4. Elektronentomographie <ol><li> Negativ gefärbten FVIII-LNT Probenvorbereitung <ol> &lt;li&gt; Bereiten FVIII-LNT Proben wie für die Cryo-EM Experimenten. </li><li> Glimmentladungen kohlenstoffbeschichtete 300-Mesh-Kupfergitter (Kohlenstoff Seite nach oben) in einem Gemisch aus O 2 und H 2-Gas für 10 s bei 50 W für Kryo-EM-Experimenten. </li><li> Geben Sie einen Tropfen 2,5 ul FVIII-LNT Suspension mit 6-nm kolloidalem Gold-Nanopartikel in das Netz, trocknen Sie die überschüssige Flüssigkeit und negativ, indem 5 ul 1% Uranylacetat-Lösung für 2 min färben. Tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit und Luft trocknen das Raster. </li></ol></li><li> Elektronentomographie Data Collection <ol><li> Übertragen Sie das Gitter in den einzelnen Kipphalter. </li><li> Übertragen des Halters in dem Elektronenmikroskop. </li><li> Sammeln Kippserie automatisch mit der Software SerialEM 19 bei 2 °-Schritten in einem Winkelbereich von -60 ° bis +60 ° und die Aufnahme von Bildern mit einer CCD-Kamera auf 52.000 X effektive Vergrößerung, -6 bis -10 um-Unschärfe und Elektronendosis von 150 - 170 electrons / Å 2 · s pro Schnittbild. </li></ol></li><li> Elektronentomographie Rekonstruktion der FVIII-LNT Hinweis: Rekonstruieren Sie das pFVIII-LNT LNT-und hFVIII gekippt Serie in 4.2 erworben. mit der Möglichkeit, die Software IMOD ETomo nach dem Tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html <ol><li> Mit einem Terminal-Fenster, öffnen Sie das Schnittbild in 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Bin das Tomogramm von 4 mit dem IMOD BINVOL Befehl, um die Größe des Schnittbildes zu verringern. </li><li> Wählen Sie den richtigen Winkel, um den Lipidnanoröhre entlang der Y-Achse in der klassierten Schnittbild mit dem Befehl IMOD ROTATEVOL drehen. </li><li> Drehen Sie den vollen Schichtaufnahme mit dem Befehl IMOD ROTATEVOL. </li><li> Schneiden Sie das ausgewählte Lipidnanoröhre entlang der Y-Achse mit der CLIP RESIZE Befehl IMOD orientiert. </li><li> Öffnen Sie das zugeschnittene Unterschichtbild mit 3DMOD. </li><li> Klicken Tomogramms, die Anordnung der Faktor VIII-Moleküle entlang visualisierendie Schichten in Z-Achse und entlang der Y-Achse in der Sub-Tomogramm Volumen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine Konkurrenz finanzielles Interesse und sie können direkt über eine der in dieser Handschrift veröffentlichten Verfahren kontaktiert werden.

In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, um zwischen zwei Membrangebundene von hochhomologen Proteinen unterscheiden: Human-und Schweine-FVIII selbstorganisierten auf den Lipidstoffnanoröhren in die Bedingungen im menschlichen Körper auftreten. Bei dem beschriebenen Verfahren, Mensch und Schwein FVIII erfolgreich schraubenförmig auf Lipid-Nanoröhren organisiert, was der wichtigste Schritt ist. Der nächste kritische Schritt ist, um die Probe in dünnen ...

Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) ist ein großes Glykoprotein von 2.332 Aminosäuren in sechs Bereiche unterteilt: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Thrombin nach Aktivierung FVIII wirkt als Cofaktor, Faktor IXa in der Membran-gebundenen Tenasekomplex. Die Bindung von FVIII aktiviert (FVIIIa) zu FIXa in einer Membran-je nach Art und Weise verbessert FIXa proteolytischen Effizienz von mehr als 10 5-fache, die entscheidend für die effiziente Blutgerinnung 4 ist. Trotz der wichtigen Rolle FVIII spielt bei der Koagulation und der Tenasekomplexes Bildung, noch die funktionelle Membran-gebundenen FVIII-Struktur gelöst werden. Um dies zu beheben, haben einzelne Lipid-Doppelschicht-Nanoröhren (LNT) reich an Phosphatidylserin (PS), die zur Bindung FVIII mit hoher Affinität 8, 9 und die aktivierte Thrombozytenoberfläche ähnlich entwickelt worden 10. Aufeinanderfolgende spiralförmigen Organisation von FVIII zu LNT gebunden ist erwiesen, wirkungs zu seinve für die Strukturbestimmung von FVIII-Membran-gebundenen Zustand von Cryo-EM-5. Funktionalisierten LNT sind ein ideales System, um Protein-Protein-und Protein-Membran-Wechselwirkungen von spiralförmig organisierten Membran-assoziierten Proteinen, die durch Kryo-EM 11, 12 zu untersuchen. Kryo-EM hat den Vorteil gegenüber herkömmlichen Konstruktionsverfahren, wie Röntgenkristallographie und NMR, als die Probe in der Nähe des physiologischen Umgebung (Puffer, Membran-pH-Wert) erhalten, ohne Additive und Isotope. Im Fall von FVIII, die Untersuchung der Membran-gebundenen Struktur mit dieser Technik ist noch physiologisch relevant, da die LNT ähneln eng durch Größe, Form und Zusammensetzung der Pseudopodien der aktivierten Thrombozyten, wo die Komplexe Tenase Zusammenbau in vivo. Mängel und Mangel an FVIII Ursache Hämophilie A, einer Erkrankung, die schwere Blutungen 1 in 5.000 Männern der menschlichen Bevölkerung 4, 6. Die meisten Eirksame Therapie für Hämophilie A ist lebenslange Verabreichung von rekombinantem humanem FVIII (hFVIII). Eine signifikante Komplikation des rekombinanten FVIII-Hämophilie-A-Therapie ist die Entwicklung von inhibitorischen Antikörpern gegen den menschlichen Form, die bei etwa 30% der Patienten mit Hämophilie A 13. In diesem Fall wird Schweine-FVIII (pFVIII) Konzentrat verwendet, wie Schweine-FVIII-Displays geringe Kreuzreaktivität mit inhibitorische Antikörper gegen menschliches FVIII und Formen funktionalen Komplexen mit menschlichen FIXa 7. Gründung der membrangebundene Organisation von sowohl Schweine-und Menschen FVIII Formen ist wichtig, die strukturelle Basis von FVIII-Cofaktor-Funktion und Auswirkungen auf Blut Blutstillung zu verstehen. In dieser Studie beschreiben wir eine Kombination von Lipid Nanotechnologie, Cryo-EM-und Strukturanalyse entwickelt, um die membrangebundene Organisation von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen. Die vorgestellten Cryo-EM-Daten und 3D-Strukturen für spiralförmig organisiert porcine und Menschen FVIII auf negativ geladenen LNT zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Nanotechnologie als Grundlage für die Strukturbestimmung von FVIII und Membran-gebundenen Gerinnungsfaktoren und Komplexe in einer physiologischen Membranumgebung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">JEM2100 with LaB6&#160;</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">JEM-2100</td>
			<td style="width:447px;">operated at 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">with TEMCON software</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan626 Cryo-holder</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">626.DH</td>
			<td style="width:447px;">cooled to -175 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">with temperature controler unit</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan 4K x 4K CCD camera</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">US4000</td>
			<td style="width:447px;">4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Solarus Model 950 plasma cleaner</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:205px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Materials</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">01821</td>
			<td style="width:447px;">plasma cleaned for 10 s on high power</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">Quantifoil R2/2 300 mesh</td>
			<td style="width:205px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Q225-CR2</td>
			<td style="width:447px;">Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">19481</td>
			<td style="width:447px;">1% solution, filtered</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:239px;">Galactosyl ceramide</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">860546</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840035</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Software</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">EM software Digital Micrograph</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">EM software EMAN</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">EM software Spider</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">EM software IHRSR</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;">Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (IMOD)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (SerialEM)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">UCSF-Chimera</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

helical organization of blood coagulation factor viii on lipid nanotubes

<html> Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) 1 ist ein leistungsfähiges Konzept für die funktionale Struktur von Proteinen und Komplexen in einem hydratisierten Zustand und 2 Membranumgebung zu untersuchen. Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) 3 ist ein Multi-Domain-Blutplasma-Glykoprotein. Defekt oder Mangel an FVIII ist die Ursache für Hämophilie Typ A - eine schwere Blutgerinnungsstörung. Nach der proteolytischen Aktivierung bindet FVIII an den Serin-Protease Faktor IXa auf der negativ geladenen Plättchenmembran, die entscheidend für die normale Blutgerinnung 4 ist. Trotz der zentralen Rolle spielt in FVIII-Koagulation, Strukturinformationen für die Membran-gebundenen Zustand ist unvollständig 5. Rekombinanten FVIII-Konzentrat ist das wirksamste Medikament gegen Hämophilie Typ A und im Handel erhältlichen FVIII als menschliche oder Schweine, beide bildende funktionelle Komplexe mit menschlichem Faktor IXa 6,7 ausgedrückt. &quot;&gt; In dieser Studie stellen wir eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), angewandte Nanotechnologie Lipid-und Strukturanalyse, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen:. Mensch und Schwein Die in unserem Labor entwickelte Methodik schraubenförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT) beschrieben. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass unser Ansatz ist empfindlich genug, um die Unterschiede in der Schrauben Organisation zwischen den beiden hoch homolog in Folge (86% Sequenzidentität zu definieren )-Proteine. Detaillierte Protokolle für die Schrauben Organisation Kryo-EM und Elektronentomographie (ET) Datenerfassung werden. Die zweidimensionale (2D angegeben) und dreidimensionale (3D) Struktur-Analyse angewendet, um die 3D-Rekonstruktionen von Mensch und Schwein erhalten FVIII-LNT wird diskutiert. Die vorgestellten Mensch und Schwein FVIII-LNT Strukturen zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Methodik zur kalkulierte die funktionale, membrangebundene Organisation von Blutgerinnungsfaktor VIII bei hoher Auflösung.

Rekombinante humane FVIII und Schweine wurden erfolgreich spiralförmig organisiert negativ auf einzelne Doppelschicht LNT erhoben, die aktivierte Thrombozytenoberfläche ähnelt. Die spiralförmige Organisation der Mensch und Schwein FVIII-LNT war konsistent durch die gesammelten digitalen Aufnahmen (Abbildung 2). Die Steuerung und der LNT Mensch und Schwein FVIII-LNT Wendelrohre wurden ausgewählt und mit der GUI und e2helixboxer.py anfänglichen Datensätze mit dem e2workflow.py GUI-...

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Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Wir präsentieren eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie, Lipid Nanotechnologie und Strukturanalyse angewandt, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen: Mensch und Schwein. Die in unserem Labor entwickelt, um spiralförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT)-Methode beschrieben.

Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch.  Wir präsentieren eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie, Lipid Nanotechnologie und Strukturanalyse angewandt, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen: Mensch und Schwein. Die in unserem Labor entwickelt, um spiralförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT)-Methode beschrieben. 

Serie: Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very promising application for molecular sensors, field effect transistor and super thin and flexible electronic devices1-4. Anodic arc discharge supported by the erosion of the anode material is one of the most practical and efficient methods, which can provide specific non-equilibrium processes and a high influx of carbon material to the developing structures at relatively higher temperature, and consequently the as-synthesized products have few structural defects and better crystallinity.
 To further improve the controllability and flexibility of the synthesis of carbon nanostructures in arc discharge, magnetic fields can be applied during the synthesis process according to the strong magnetic responses of arc plasmas. It was demonstrated that the magnetically-enhanced arc discharge can increase the average length of SWCNT 5, narrow the diameter distribution of metallic catalyst particles and carbon nanotubes 6, and change the ratio of metallic and semiconducting carbon nanotubes 7, as well as lead to graphene synthesis 8. 
 Furthermore, it is worthwhile to remark that when we introduce a non-uniform magnetic field with the component normal to the current in arc, the Lorentz force along the J&times;B direction can generate the plasmas jet and make effective delivery of carbon ion particles and heat flux to samples. As a result, large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes were simultaneously generated by such new magnetically-enhanced anodic arc method. Arc imaging, scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM) and Raman spectroscopy were employed to analyze the characterization of carbon nanostructures. These findings indicate a wide spectrum of opportunities to manipulate with the properties of nanostructures produced in plasmas by means of controlling the arc conditions.

Anodic arc discharge is one of the most practical and efficient methods to synthesize various carbon nanostructures. To increase the arc controllability and flexibility, a non-uniform magnetic field was introduced to process the one-step synthesis of large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes.

Simultane Synthese von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen und Graphen in einem magnetisch-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Forschung

Biotechnik

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in transcription of non-coding RNAs, specifically of microRNAs. Here, we propose a strategy to study the potential role of transcription factor in regulating transcription of microRNAs using publically available data, computational resources and high throughput data. We use the H3K4me3 epigenetic signature to identify microRNA promoters and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing data from the ENCODE project to identify microRNA promoters that are enriched with transcription factor binding sites. By transfecting cells of interest with shRNA targeting a transcription factor of interest and subjecting the cells to microRNA array, we study the effect of this transcription factor on the microRNA transcriptome. As an illustrative example we use our study on the effect of STAT3 on the microRNA transcriptome of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells.

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthese von Multi-walled Carbonnanotubes mit Silber-Nanopartikeln und Bewertung ihrer antibakteriellen Aktivitäten und zytotoxische Eigenschaften modifiziert

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&amp;#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...