NGF an das Gehirn geliefert ist eine Herausforderung. Hier stellen wir einen neuen Trägertyp vor, der eine sichere und längere Freisetzung des bioaktiven Proteins ermöglicht. Diese Technik ermöglicht eine einfache und effiziente Beladung von NGF in poröse Siliziumträger.
Es wird bei Raumtemperatur und ohne Verwendung von starken organischen Lösungsmitteln durchgeführt. Da das poröse Siliziumträgerdesign abstimmbar ist, können die Träger als NGF-Reservoirimplantate für eine langfristige Freisetzung dienen, aber auch modifiziert werden, um andere Faktoren und Medikamente zu tragen. Für Ingenieure und Chemiker ist der Herstellungsprozess möglicherweise einfacher durchzuführen.
Während für Lebenswissenschaftler und Kliniker, die Zellkultur Verfahren sollten relativ einfach zu reproduzieren sein. Beginnen Sie mit der Montage eines ein Punkt fünf mal einen Punkt fünf Zentimeter großen Siliziumwafers mit einem gut charakterisierten Widerstand in eine Polytetrafluro-Ethal-Ätzzelle mit einem Streifen aus Aluminiumfolie als Rückenkontakt und einem O-Ring zur Versiegelung der Zelle. Das Gewebe ist für den Einsatz von Siliziumwafern mit ähnlichen Widerstandswerten jedes Mal represistierbar.
Die Siliziumprobe in einer Drei-zu-eins-Lösung von Akleus-Flusssäure und Ethanol wird 20 Sekunden lang bei einer konstanten Stromdichte von 250 Milliampere pro Zentimeter quadratisch elektrochemisch geätzt. Spülen Sie dann die Oberfläche des resultierenden porösen Siliziumfilms dreimal mit Ethanol ab, bevor Sie unter einem Stickstoffstrom trocknen. Wenn die Probe trocken ist, oxidieren Sie die frisch geätzte poröse Siliziumprobe im Rohrofen bei 800 Grad Celsius eine Stunde lang in der Umgebungsluft zu einem oxidierten porösen Siliziumgerüst.
Wenn die Probe abgekühlt ist, verwenden Sie eine Holzsäge, um sie in eine acht mal acht Millimeter große Probe zu schneiden. Um die Proben mit NGF zu beladen, geben Sie 52 Mikroliter frisch zubereitete NGF-Ladelösung auf jede Probe und inkubieren Sie die Proben für zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer abgedeckten Schale unter hohen Feuchtigkeitsbedingungen. Nach zwei Stunden die Lösung auf den Proben sammeln und NGF-Ladelösung und die gesammelten Proben nach der Ladelösung in den entsprechenden Konzentrationsbereich für das Iliza-Kit verdünnen.
Wenn alle Proben verdünnt wurden, fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Proben in Kalibrierkurvenproben zu jedem Bohrkörper eines NGF-Capture-Antikörpers hinzu, der 96 Well-Iliza-Platte für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur beschichtet hat. Am Ende der Inkubation die Platte viermal waschen und hundert Mikroliter eines Mikrogramms pro Milliliter biotentilierten Detektionsantikörpers für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur zu jedem Brunnen hinzufügen. Nach vier Waschungen, wie gezeigt, fügen Sie 100 Mikroliter Avidin-Horseradish Peroxidace zu jedem Brunnen für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur gefolgt von vier Waschungen im Waschpuffer, wie gezeigt.
Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter Substratlösung zu jedem Brunnen für eine 25-minütige Farbentwicklung Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Verwenden Sie dann einen Mikroplattenleser, um die Absorption bei 405 Nanometern zu messen, wobei die Wellenlängenkorrektur auf 650 Nanometer eingestellt ist, und die NGF-Konzentration sowohl in der Ladelösung als auch in der gesammelten Nachladelösung basierend auf der Kalibrierkurve zu bestimmen. Für In Vitro NGF Freisetzung, inkubieren die NGF geladen oxidierte poröse Siliziumträger in zwei Milliliter NullPunkt Null ein Molar PBS ergänzt mit einem Prozent Boyvine Serum albaman in Null Punkt Null zwei Prozent Natriumazid bei 37 Grad Celsius und 100 Rotationen pro Minute der Orbitaladjatation.
Sammeln Sie die Lösung alle zwei Tage und ersetzen Sie sie nach jeder Aspiration durch zwei Milliliter frische SPBS. Dann frieren Sie die gesammelten Freisetzungsproben in flüssigem Stickstoff für minus 20 Grad Celsius Lagerung, bis NGF-Analyse von iliza, wie gerade gezeigt. Um ein differenziertes Feo Cromo Sitoma 12 oder PC 12, Zellkultur zu erzeugen, sammeln Sie die Zellsuspension durch Sentripugation und setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter n frischem Grundwachstumsmedium wieder aus.
Nach einer zweiten Sentribugation den Palate in drei Millilitern des Grundlegenden Wachstumsmediums wieder aussetzen und eine 23-Spur-Spritze verwenden, um die Zellen zehnmal zu saugen, um Zellcluster zu trennen. Nach dem Zählen, Samen ein mal 10 bis die vierte Zelle pro Zentimeter quadratische n-Messbereich auf einem kolligen Typ ein beschichtete Platten in Gegenwart von Differenzierungsmedium. Legen Sie die Platten in den Inkubator.
Nach 24 Stunden bei 37 Grad Celsius frische murine Beta NGF oder NGF geladenporigen Siliziumträger auf jeder Platte hinzufügen und die Platten zum Inkubator zurückgeben. Um die Zelllebensfähigkeit zu bewerten, inkubieren Sie die Kulturen mit 10 Prozent einer geeigneten Lebensfähigkeitsindikatorlösung zu repräsentativen Zeitpunkten für fünf Stunden bei 37 Grad Celsius und messen Sie die Absorption auf einem Spektropentometer bei 490 Nanometern, wobei die Wellenlängenkorrektur auf 630 Nanometer festgelegt ist. Um die PC 12-Zelldifferenzierung in Gegenwart von NGF-belasteten porösen Siliziumträgern zu bewerten, säen Sie die PC 12-Zellen in 12 niedrig kollagenbeschichteten Platten 24 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator und führen die zuvor erhaltenen In Vitro-proben in die entsprechenden Versuchsbrunnen ein.
Nach einer 24-stündigen Inkubation die Zellen durch Lichtmikroskopie abbilden und die Anzahl der Zellen mit Alkronuriten in jedem Brunnen manuell zählen. Zur morphometrischen Analyse der differenzierten PC 12-Zellen erfassen Sie Phasenbilder der kultivierten Zellen bis zu drei Tage nach der Behandlung mit NGF und öffnen Sie die Dateien in Neuron J.Konvertieren Sie die Bilddatei in ein Acht-Bit-Format und verwenden Sie die Bildskala-Leiste, um das Verhältnis von Pixel zu Mikrometer zu messen. Verwenden Sie Analysieren und Festlegen von Maßstäben, um den Maßstab festzulegen und die Länge jedes Neurites zu messen.
Zählen Sie dann manuell die Anzahl der Verzweigungspunkte und die Anzahl der Nouriten, die aus jedem Zellsoma stammen. Gezeigt werden hochauflösende Rasterelektronenmikroskopiebilder des resultierenden oxidierten porösen Siliziumfilms. Eine Top-View-Mikrographie des Films zeigt seine sehr poröse Natur mit Poren von etwa 40 Nanometern Durchmesser.
Eine Querschnittsmikroskopie eines spaltenden Films zeigt eine poröse Schichtdicke von zwei Punkten von neun Mikrometern, die sich durch die Verbindung zylindrischer Poren auszeichnet. Eine nachhaltige Freisetzung von NGF ohne Burst-Effekt wird für einen Zeitraum von einem Monat mit einer schnelleren NGF-Veröffentlichung während der ersten Woche im Vergleich zu einer viel langsameren Freisetzungsrate in den späteren Tagen der Veröffentlichungszeit erreicht. Die Behandlung mit NGF-belasteten porösen Siliziumträgern induziert die Bildung von Neuriten in charakteristischen verzweigten neuronalen Netzwerken in PC 12-Zellkulturen.
Beachten Sie, dass auch nach 26 Tagen die freigesetzte NGF eine Zelldifferenzierung von über 50 Prozent induziert, was darauf hindeutet, dass die NGF-Einschließung innerhalb des porösen Wirts die biologische Aktivität des Proteins für einen Zeitraum von etwa einem Monat konserviert. Die morphometrische Analyse der mit NGF belasteten porösen Silizium behandelten Zellpopulationen an den Tagen eins und drei zeigt, dass PC 12-Zellen, die mit NGF-belastetem porösem Silizium behandelt wurden, morphometrische Werte aufweisen, die denen entsprechen, die in den kontrollierten Behandlungskulturen für alle drei getesteten Parameter beobachtet wurden. Wenn Sie die vorgestellten Schritte angemessen befolgen und erfüllen, erhalten Sie ein vorteilhaftes NGF-Liefersystem, das das Überleben und die Differenzierung neuronaler Zellen aufrecht erhält.
Wir untersuchen derzeit die Verwendung von NGF porösen Siliziumträgern als langfristige Freisetzen von Implantaten im Gehirn, um ihre normale Schutzwirkung zu untersuchen und degenerative Krankheiten wie die Alzheimer-Krankheit zu kennen. Nach diesem Verfahren kann auch die Wirkung der NGF-belasteten porösen Siliziumträger auf ein normales Wachstum von Dosal-Holz-Gangränzellen untersucht werden. Poröses Silizium ist ein vielversprechendes Nanomaterial, das für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden kann.
Anders als die hier vorgestellte, einschließlich biologischer oder chemischer Sensoren, Diagnostik und Bildgebung. Um eine mögliche Toxizität der porösen Siliziumträger gegenüber Ihrer Zelllinie auszuschließen, achten Sie darauf, einen Aufsatz der Dauerhaftigkeit durchzuführen und Ihre porösen Siliziumproben zu sterilisieren.
